Tabelul 1

primul proband (individ II-1 al familiei a) este primul copil al părinților sănătoși independenți de origine europeană. S-a născut după o sarcină fără evenimente la 40 de săptămâni de gestație, cu greutate și lungime normală la naștere și o circumferință a capului occipitofrontal limită (OFC) de 33 cm (-2 SD). Dificultățile de hrănire, vărsăturile și pierderea în greutate au caracterizat perioada postnatală timpurie. Întârzierea dezvoltării, hipotonia musculară și strabismul au devenit evidente la vârsta de 3 luni. Hyperopia a fost diagnosticată la vârsta de 9 luni. Toate etapele dezvoltării motorii au fost întârziate; el se rostogolea la 12 luni, stătea la 12 luni, se târâse la 30 de luni și mergea la 4 ani. La vârsta de patru ani, a prezentat o întârziere severă de dezvoltare cu microcefalie (OFC -2,2 SD) și hipotonie trunchială și orofacială. Mersul său a fost ușor ataxic și a afișat mișcări stereotipice, inclusiv fluturarea frecventă a mâinilor și jactitarea. Comportamentul său era foarte prietenos și deschis. În plus față de hipermobilitatea articulară și o hernie ombilicală, au fost observate trăsături dismorfice ușoare, incluzând un occiput aplatizat, fața lungă, nasul scurt cu nare antevertizate, filtru scurt, buza superioară subțire și tentată, buza inferioară evertată, bărbia ascuțită, Palatul arcuit înalt și dinții displazici (figura 1A). Dezvoltarea limbajului a fost întârziată semnificativ și limitată la trei cuvinte la vârsta de 4 ani. Părinții săi au observat în plus o senzație de durere scăzută. Un RMN cerebral, efectuat la vârsta de 4 ani, a evidențiat o atrofie generalizată ușoară a creierului, un model giral simplificat și o displazie corticală cerebeloasă ușoară asemănătoare unei forme ușoare de rombencefalosinapsis parțial cu emisfere cerebeloase posterioare superioare topite, dar separate emisferele cerebeloase anterioare inferioare (figura S1). Analiza cromozomială convențională a limfocitelor, analiza hibridizării interfazice a fluorescenței in situ (FISH) în celulele tamponului bucal, hibridizarea genomică comparativă a matricei (CGH), analiza METILĂRII SNRPN-locus (MIM: 182279) și secvențierea directă a ARX (MIM: 300382) au fost efectuate, toate acestea dând rezultate normale. Acest lucru ne-a determinat să efectuăm secvențierea trio exome cu probe de ADN atât ale părinților sănătoși, cât și ale probandului, așa cum este descris anterior.2 pe scurt, fragmentele de ADN codificate au fost îmbogățite cu un kit SureSelect Human All Exon 50MB V5 (Agilent), iar secvențierea a fost efectuată pe un sistem HiSeq2500 (Illumina). Citirile au fost aliniate la ansamblul genomului uman hg19 (UCSC Genome Browser) cu Burrows-Wheeler Aligner (BWA, v.0.5.87.5), iar detectarea variației genetice a fost efectuată cu SAMtools (V.0. 1.18), PINDEL (v.0.2.4 t) și ExomeDepth (v.1.0. 0). Filtrarea bioinformatică nu a detectat variante candidate rare (frecvența alelelor minore < 0,01) în urma unui mod de moștenire recesiv autosomal-recesiv sau legat de X. Cu toate acestea, am identificat o singură modificare a secvenței non-adnotată, de novo, cu un impact sever asupra structurii proteinelor (tabelul s1a). Această ștergere de 2 bp la poziția ADNc 1.866 bp (c.1866_1867delca) în CHAMP1 se preconizează că va schimba cadrul de citire și va induce un codon de oprire prematură la aminoacidul 629 (P.Asp622Glufs 8). Secvențierea Sanger a confirmat mutația heterozigotă c. 1866_1867delca în proband (figura S2) și absența acesteia din ADN-ul sanguin al ambilor părinți.

al doilea proband (individul II-3 din familia B) este al treilea copil al părinților olandezi neconsanguini. Băiatul s-a născut după o sarcină de neimaginat la 39 de săptămâni de gestație. Greutatea la naștere era normală. În perioada neonatală, a avut dificultăți de hrănire și a fost hrănit cu tuburi timp de șase săptămâni. O dezvoltare întârziată și o viziune afectată au fost observate în prima lună a vieții sale. Un RMN cerebral la vârsta de 3 luni a arătat mielinizare ușor întârziată. El a fost afectat de hipotonie severă, care sa îmbunătățit în timp. În plus, a suferit de infecții recurente ale tractului respirator superior și pneumonii de aspirație. La vârsta de 2 ani, o examinare a relevat mai multe trăsături dismorfice, inclusiv brahicefalie, o linie frontală joasă, hipertelorism, pliuri epicantice și o punte nazală largă. Înălțimea sa era de -2,2 SD, în timp ce greutatea și OFC-ul său se aflau în limitele normale. El a reușit să stea cu un anumit sprijin la vârsta de 2 ani.5 ani și parcurgeți câțiva pași fără sprijin, dar cu un echilibru insuficient al capului la vârsta de 3 ani. El a arătat un comportament stereotip caracterizat prin întoarcerea, răsucirea mișcărilor brațelor și mâinilor, suspinarea și scuturarea corpului său. Epilepsia frontotemporală nocturnă, probabil cauzatoare de apnee în somn, a fost tratată cu succes cu carbamazepină. Chiar dacă are o viziune scăzută cu un potențial evocat vizual suboptim și o electroretinogramă normală, cauza afectării sale de vedere este încă necunoscută. La vârsta de 5 ani, o reexaminare a arătat un băiat foarte vesel, cu stereotipuri așa cum este descris mai sus, fără vorbire și o creștere frontală a părului, ochi în formă de migdale, un palat înalt, dinți mici și diasthema, pe lângă caracteristicile dismorfice menționate anterior (figura 1b). De asemenea, a dezvoltat o hernie ombilicală. De-a lungul timpului, studiile metabolice de bază, analiza secvenței ATRX (MIM: 300032), SNP array și studiile de metilare pentru sindromul Prader-Willi (MIM: 176270) au dat rezultate normale. Prin urmare, am efectuat secvențierea trio-exome cu probe de ADN ale părinților și probandului, așa cum este descris anterior.3 pe scurt, Exome-secvențierea a fost efectuată cu o mașină solidă 5500xl (Life Technologies) după îmbogățirea cu kitul Agilent SureSelectXT Human All Exon 50MB (Agilent). Datele au fost analizate cu ajutorul software-ului LifeScope (Applied Biosystems, Life Technologies). O analiză de novo a fost efectuată cu părinții și ADN-ul probandului, identificând o singură modificare a secvenței de novo neadnotată, cu un impact sever asupra structurii proteinelor (tabelul S1B). Aceasta a fost varianta cu un singur nucleotid (SNV) c.1768c>T în CHAMP1, rezultând o mutație nonsens la aminoacidul 590 (p.Gln590 inkt). Secvențierea Sanger a confirmat heterozigotul c. 1768c>mutația T în proband (figura S3) și absența acesteia din ADN-ul sanguin al ambilor părinți.al treilea proband (individul II – 2 din familia C) este un bărbat de 18 ani, al doilea dintre cei trei copii născuți din părinți olandezi neconsanguini. S-a născut la săptămâna gestațională 39 după o sarcină fără evenimente și cu o greutate și o înălțime normală la naștere. OFC la vârsta de 6 săptămâni a fost -2.1 SD. Hipotermia și problemele de hrănire au caracterizat primele zile de viață și a fost suspectat refluxul esofagian. Hipotonia și întârzierea dezvoltării au devenit evidente în primele luni. La vârsta de 1 an, întârzierea dezvoltării și problemele de hrănire asociate cu pierderea în greutate au dus la o lucrare clinică extinsă, dezvăluind rezultate normale în analiza metabolică, RMN-ul creierului, determinarea vârstei osoase, radiografia craniului și măsurarea pH-ului. Analiza motilității esophegeale a arătat mișcări de înghițire diminuate, dar a exclus o anomalie structurală. Exotropia intermitentă și Hipermetropia ridicată (+6,25 dioptrii (dpt), bilateral) au fost diagnosticate. Examenul clinic a relevat aplatizarea severă a occipitului și spațierea crescută a incisivilor superiori mari și proeminenți. Hrănirea s-a îmbunătățit în timp. El a suferit de infecții repetate ale căilor respiratorii superioare și gastrită. Reperele motorii au fost întârziate, inclusiv rostogolirea la 9 luni, ședința la 13 luni și mersul la 30 de luni. Dezvoltarea limbajului său a fost, de asemenea, întârziată semnificativ. A rostit primele cuvinte la vârsta de 3 ani. Creșterea repetată a acidului pipecolic în ser a determinat o analiză metabolică extinsă, inclusiv analiza factorului de stimulare a coloniilor, a fibroblastelor și a țesutului hepatic. Rezultatele normale au făcut ca un defect peroxisomal să fie puțin probabil. La ultima vizită la vârsta de 18 ani, greutatea, lungimea și OFC au fost sub intervalul normal (greutate -2,7 SD; înălțime -2,9 SD; OFC -3,1 SD). Autismul a fost diagnosticat. El a vorbit în propoziții scurte cu vorbire neclară. Iubea muzica și înotul și era capabil să-și opereze bine computerul. Comportamentul său a fost prietenos. Părinții au raportat o senzație de durere scăzută. Examenul clinic a evidențiat hipotonie musculară, în special hipotonie orofacială cu aspect deschis și salivare, o față lungă, fisuri palpebrale ascendente, un filtru scurt, o buză superioară subțire și buza inferioară evertată, o bărbie ascuțită și urechi joase (figura 1C). De-a lungul anilor, cariotiparea, matricea CGH și testarea peștilor și metilării pe regiunea cromozomială 15q11q13, precum și analizele ARX, VPS13B (MIM: 607817) și UBE3A (mim: 601623) au fost efectuate fără constatări patogene. Acest lucru ne-a determinat să efectuăm secvențierea exomului trio de diagnosticare cu probe de ADN ale probandului și ambilor părinți. Exomes au fost îmbogățite cu setul SureSelect XT Human All Exon V5 (Agilent) și secvențiate în modul de rulare rapidă pe sistemul de secvențiere HiSeq2500 (Illumina). Citirile au fost aliniate la hg19 cu BWA (BWA-mem V.0.7.5 a) și variantele au fost apelate cu setul de instrumente de analiză a genomului haplotype caller (V.2. 7-2). Variantele detectate au fost adnotate, filtrate și prioritizate cu platforma Bench Lab NGS (Cartagenia). Analiza mutației de novo, prin filtrarea tuturor variantelor detectate în funcție de variantele parentale și de populație, a identificat o singură modificare a secvenței de novo neannotată, cu un impact sever asupra structurii proteinelor (tabelul S1C). Acesta a fost CHAMP1 SNV c. 1192c>t rezultând o mutație nonsensă la aminoacidul 398 (P.Arg398 Irak). Mutația heterozigotă c.1192c>t a fost validată și dovedită a fi de novo prin secvențierea Sanger (datele nu sunt prezentate).al patrulea proband (individul II – 2 din familia D) este un geamăn diamniotic dichorionic de origine olandeză. Mama a rămas însărcinată după fertilizarea in vitro (FIV) prin injectarea intracitoplasmatică a spermei (ICSI) din cauza oligoasthenospermiei paterne. Sarcina a fost complicată de preeclampsie. Fata s-a născut la 37 de săptămâni și 2 zile de gestație și a fost livrată prin cezariană. Greutatea și lungimea ei la naștere erau normale, dar OFC-ul ei era sub a treia centilă. Imediat după naștere, s-a observat o ușoară creștere a fisurilor palpebrale, un gât scurt cu pliu nuchal și labiile mici umflate. Era puțin hipotonică. Dificultățile de hrănire și refluxul esofagian au fost prezente în primele săptămâni de viață și a fost hrănită cu tub timp de 10 zile. Aneuploidia pentru cromozomii X, Y, 13, 18 și 21 a fost exclusă prin PCR fluorescent cantitativ (qfPCR), iar matricea CGH a dat rezultate normale. RMN cerebral a arătat mai întâi girație redusă și sulci largi, deși diagnosticul modelului giral simplificat nu a putut fi stabilit. Cu toate acestea, RMN-ul creierului la vârsta de 3 luni a fost raportat a fi normal. Spectroscopia prin rezonanță magnetică nu a arătat anomalii ale colinei, creatinei, n-acetilaspartatului (NAA), inozitolului, glutamatului/glutaminei sau lactatului. Nu s-au observat anomalii cardiace sau renale. Dezvoltarea ei motorie a fost întârziată. A început să meargă la vârsta de 18 luni. Testele Bayley scale de dezvoltare a sugarului (BSID-III) la 2 ani și 4 luni au relevat o întârziere de dezvoltare de 12 luni; abilitățile sale motorii fine și dezvoltarea vorbirii au fost întârziate. Limbajul ei receptiv era mai bine dezvoltat decât limbajul ei expresiv. A suferit de infecții recurente ale tractului respirator superior și o otită medie cronică. În plus, au fost diagnosticate hipermetropie ridicată (+7 dpt) și astigmatism. Somnul ei a fost tulburat semnificativ și nu a existat nicio îmbunătățire după tratamentul cu melatonină. Un EEG de somn nu a arătat anomalii, cu toate acestea părinții au raportat vrăji în timpul cărora nu răspunde. Comportamentul ei este foarte deschis și prietenos și are o senzație de durere scăzută. Ea a arătat stereotipuri de mână, hipersensibilitate tactilă și auto-stimulare sexuală. Dificultățile de hrănire erau încă prezente, în special la înghițirea anumitor alimente solide. Examenul clinic la vârsta de 3 ani a arătat caracteristici dismorfice ușoare, incluzând sprâncenele pline, pliurile epicantice, o punte nazală largă, o ușoară eversiune laterală a pleoapelor inferioare, un filtru scurt, hipotonie orofacială cu aspect deschis al gurii, o buză superioară subțire și tentată, o buză inferioară proeminentă, un palat arcuit înalt, dinți mici și diastemă (figura 1D). Mersul ei era stângace și ușor larg. Am efectuat secvențierea trio exome cu probe de ADN ale părinților și probandului, așa cum este descris mai sus pentru individul II-3 din familia B, care a identificat o singură modificare a secvenței de novo ne-adnotată (tabelul S1D). Această ștergere de 1 bp la poziția ADNc 635 (c.635delc) în CHAMP1 se preconizează că va schimba cadrul de citire și va induce un codon de oprire prematură la aminoacidul 218 (p.Pro212Leufs 7). secvențierea Sanger a confirmat mutația heterozigotă c.635delc în proband (datele nu sunt prezentate) și absența acesteia din ADN-ul sanguin al ambilor părinți.

o alterare independentă de novo CHAMP1 dăunătoare a fost identificată anterior într-un studiu sistematic de secvențiere exomă trio pe 51 de indivizi cu ID non-sindrom sever.2 Această modificare CHAMP1 este una dintre cele 87 de variante de novo din lotul proband raportat fără o descriere clinică detaliată în materialul suplimentar. Din cauza lipsei altor persoane afectate, patogenitatea acestei variante a rămas neclară la acel moment. În special, aceasta a fost mutația nonsens identică (c. 1192c > T; P. Arg398; Figura S4) pe care am identificat-o și aici în individul II-2 din familia C. Acest al cincilea proband (individul II-2 din familia E) este o fetiță de nouă ani, al doilea copil al părinților germani sănătoși non-consanguini. Mama ei a dezvoltat o tumoare Wilms la vârsta de 24 de ani; istoricul familial suplimentar nu a fost remarcabil. Probandul s-a născut prin extracție în vid după 40 de săptămâni de gestație cu greutate și lungime normală la naștere. OFC la naștere este necunoscut, deși a fost în limite normale la vârsta de patru săptămâni. Întârzierea dezvoltării psihomotorii a devenit evidentă în al doilea an de viață. A început să se târască la vârsta de 11 luni și să meargă la vârsta de 20 de luni. Testarea la scară Denver la vârsta de 36 de luni a relevat o întârziere în toate funcțiile, în special în dezvoltarea limbajului. Într-adevăr, dezvoltarea vorbirii a fost întârziată semnificativ, iar ea a vorbit doar zece cuvinte la vârsta de 4 ani și 8 luni. Abilitățile ei lingvistice receptive au fost mai bune în comparație, dar totuși întârziate pentru vârsta ei. Studiile metabolice de bază, EEG-urile și un RMN cerebral la vârsta de 3 ani au dat rezultate normale. Examenul neurologic la vârsta de 4 ani a evidențiat hipotonie orofacială. Părinții au descris o senzație de durere scăzută. La examinare la vârsta de 4 ani și 8 luni, lungimea corpului și OFC erau în limite normale, dar era supraponderală (IMC 19,8, +3 SD). Ea a prezentat trăsături faciale dismorfice ușoare, inclusiv fisuri palpebrale ascendente, pliuri epicantice, urechi joase, un nas proeminent, un filtru scurt, un aspect cu gura deschisă, cu o buză superioară subțire și tentată, o buză inferioară proeminentă și un palat arcuit înalt (figura 1e). Mersul ei era neîndemânatic. Comportamentul ei era foarte prietenos și deschis. La ultima examinare la 8 ani și 11 luni, lungimea ei și OFC au rămas în intervalul normal, dar obezitatea a crescut (IMC 23, 3, +3, 3 SD). Discursul ei a fost neclar și a vorbit în propoziții de până la trei cuvinte și a folosit în plus semne de mână. Hipotonia orofacială era încă prezentă. Părinții au raportat, de asemenea, hipotonie trunchială. Între timp, au fost diagnosticate hipermetropie (dreapta, +4,50 dpt; stânga, +3,50 dpt) și astigmatism bilateral. Înainte de includerea în studiul trio exome-secvențiere, cariotipare, testarea peștilor pe regiunea cromozomială 15q11q13 pentru Prader-Willi și Angelman (MIM: 105839), analiza X fragilă (MIM: 300624), MLPA P245 (sindroame de microdeletie-1, MRC Holland) și analiza array-CGH au dat rezultate normale.luate împreună, toate cele cinci persoane cu o mutație champ1 dăunătoare de novo sunt afectate de ID și de dezvoltarea motorie întârziată, cu o întârziere deosebit de severă în dezvoltarea vorbirii. În timp ce dezvoltarea motorie s-a îmbunătățit în timp, tulburările de vorbire au rămas. Toți indivizii au suferit de hipotonie musculară, în special trunchială. Hipotonia orofacială a fost observată la patru probanzi. Caracteristici dismorfice similare, inclusiv un filtru scurt, buza superioară tentată și buza inferioară evertată au fost observate la toți indivizii. Trei persoane au prezentat fisuri palpebrale ascendente, urechi joase și o față lungă și bărbie ascuțită. Un comportament prietenos a fost descris la toți indivizii. Scăderea senzației de durere, dificultățile de hrănire în perioada neonatală, hipermetropia și un palat arcuit înalt au fost observate la patru persoane. Trei indivizi au afișat mișcări stereotipice. Trei persoane au prezentat microcefalie. Înainte de identificarea mutațiilor cauzale CHAMP1, au fost efectuate o serie de teste genetice specifice diferite. Cele mai importante diagnostice diferențiale genetice au fost sindroamele Prader-Willi (PWS) și Angelman (AS). PWS a fost suspectat în trei probandi din cauza dificultăților de hrănire. La vârsta mică, dezvoltarea discursului sever întârziată, microcefalia și mersul ataxic au făcut din sindromul Angelman un diagnostic diferențial important, care a fost testat în trei probanzi. Analiza ARX a fost efectuată din cauza ID-ului și a întârzierii vorbirii la doi probandi masculi.în special, niciuna dintre cele patru modificări CHAMP1 identificate în studiul nostru nu a fost prezentă în dbSNP136, în baza de date ExAC sau în datele 1000 de genomi, indicând faptul că acestea sunt foarte rare în populație și este puțin probabil să fie modificări fără legătură cu boala. Dovezi suplimentare care confirmă natura patogenă a mutațiilor CHAMP1 în probandii noștri provin dintr-un studiu foarte recent de secvențiere la scară largă (descifrarea tulburărilor de dezvoltare) în total 1.133 de persoane cu ID și întârziere de dezvoltare. În acest studiu, au fost raportate modificări dăunătoare de novo CHAMP1 la doi indivizi independenți. Primul proband a fost un băiat care purta SNV c. 1002g>a prezis că va avea ca rezultat varianta nonsens la aminoacidul 334 (p.trp334) și despre care s-a raportat că prezintă ID, apnee obstructivă în somn, sfârcuri supranumerare și plagiocefalie. Cel de-al doilea proband a fost o fată care purta SNV c.1489c>T, rezultând o variantă nonsens la aminoacidul 497 (p.Arg497 Irak) și care a prezentat GDD, hipermobilitate articulară, anomalii ale sistemului de colectare renală și ale SNC, incoordonare și diastază recti. Autorii au clasificat CHAMP1 ca o ” genă nouă cu dovezi convingătoare pentru un rol în tulburările de dezvoltare.”4

constatările în total șapte indivizi independenți confirmă astfel că mutațiile din CHAMP1 sunt o cauză monogenă a ID / GDD. În conformitate cu această ipoteză, nu există o singură variantă CHAMP1 de pierdere a funcției depusă în baza de date ExAC, incluzând mai mult de 110.000 de alele secvențiate la acest locus, care argumentează puternic pentru un efect dăunător al mutațiilor CHAMP1. În special, scorul de intoleranță la variație reziduală (RVI), care cuantifică intoleranța genică la mutațiile funcționale7 din CHAMP1, este de -0,75 (13,71 TH percentila) și, prin urmare, chiar mai mic decât scorul mediu RVI pentru genele implicate în tulburări de dezvoltare (0,56; 19,54 TH percentila). Acest lucru sugerează că gradul de intoleranță la variantele dăunătoare ale CHAMP1 este semnificativ mai pronunțat decât gradul mediu de intoleranță la variantele dăunătoare ale genelor cunoscute a avea mutații care cauzează tulburări de dezvoltare.

CHAMP1 este localizat la cromozomul 13q34 și conține un singur exon codificator (precum și doi exoni 5′-netraduși) care codifică o proteină cu deget de zinc de 812 aminoacizi. S-a demonstrat că CHAMP1 interacționează cu proteina mitotică de control MAD2L2 și este necesară pentru localizarea axului său. CHAMP1 se localizează la cromozomi și fusul mitotic și reglează localizarea CENPE și CENPF la kinetochori. Mai mult, reglează atașamentul kinetocor-microtubul și, prin urmare, alinierea corectă a cromozomilor.5 mutațiile care afectează genele care codifică proteinele care reglează alinierea cromozomilor și / sau asamblarea fusului sunt o cauză bine stabilită a unei varietăți de tulburări de dezvoltare sindromice și non-sindromice. Exemplele includ POGZ (MIM: 614787),4kif2a (MIM: 602591), TUBG1 (MIM: 191135),6kif4a (MIM: 300521) și KIF5C (mim: 604593),8cenpe (MIM: 117143),9 și BUB1B (mim: 602860).10 prin urmare, CHAMP1 reprezintă o genă candidată funcțională atractivă pentru o tulburare de dezvoltare. Interesant, sa demonstrat că localizarea CHAMP1 la cromozomi și fusul mitotic este reglată de regiunea C-terminală care conține domenii de deget de zinc. Acestea din urmă s-au dovedit a fi necesare pentru alinierea corectă a cromozomilor.5 în special, se preconizează că toate mutațiile de novo dăunătoare identificate până acum, dacă rezultă o proteină stabilă, vor duce la pierderea acestui domeniu C-terminal important din punct de vedere funcțional (Figura 2).

structura proteică schematică a CHAMP1

pozițiile mutațiilor de novo identificate în acest studiu sunt marcate cu săgeți verticale și sunt prezentate în roșu; mutațiile identificate în studiul de descifrare a tulburărilor de dezvoltare sunt prezentate în negru. Abrevierile sunt după cum urmează: ZnF, domeniul zinc-deget; n, n Terminal; C, C terminal.