compartimentul mieloid al sistemului imunitar înnăscut constă dintr-un număr de tipuri de celule ale căror funcții includ eliminarea celulelor deteriorate și apoptotice, prezentarea antigenului, imunosupresia și protejarea gazdei de microorganisme străine.

monocitele reprezintă un subset foarte plastic de celule care compun sistemul imunitar înnăscut. Aceste celule sunt capabile să traverseze vasculatura și, atunci când sunt expuse la citokine specifice, suferă diferențiere în diferite tipuri de celule. Monocitele circulante sunt clasificate fie ca non-clasice, fie clasice și se pot distinge prin modelul lor de expresie a receptorului de suprafață celulară. Monocitele clasice din circulație prezintă CD14 + + + Hi / CD16 – / lo și sunt prezente în special în locurile de infecție sau boală (1,2).

monocitele umane non-clasice din circulație prezintă expresia suprafeței CD16+++Hi/CD14+ / lo (1). După activare, monocitele suferă mai multe modificări funcționale morfologice și biochimice, rezultând diferențierea monocitelor în noi tipuri de celule, cum ar fi macrofagele (3).

într—o paradigmă denumită activare clasică, monocitele umane prezintă plasticitate fenotipică care poate fi inițiată prin expunerea la interferonul citokinic stimulator al răspunsului Th1-inkt (IFN-inkt) sau factorul de necroză tumorală int (TNF-inkt), precum și la lipopolizaharida endotoxină (LPS) (4,5). Acest mecanism de activare clasică generează macrofage M1, care funcționează pentru a produce mediatori proinflamatori care asigură protecția gazdei împotriva bacteriilor și virușilor (6). Monocitele umane pot fi, de asemenea, diferențiate de macrofagele M2 prin expunerea la citokine care promovează răspunsul Th2, cum ar fi interleukina—10 (IL-10) și factorul de creștere transformant-XV (TGF-XV) (4,7). Macrofagele M2 exprimă niveluri ridicate de CD206 (receptor de manoză) și CD163, produc niveluri scăzute de citokine pro-inflamatorii și promovează vindecarea rănilor și remodelarea matricei.

celulele dendritice (DCs) sunt un alt set de celule imune derivate din monocite a căror funcție este de a prezenta antigene celulelor T pentru a iniția un răspuns imun adaptiv pe bază de celule T. DC-urile pot fi clasificate în mare parte în trei subgrupuri: clasic (CDC), plasmacitoid (PDC) și derivat de monocite (modc). CDC-urile se găsesc de obicei în țesutul limfoid, splina, ganglionii limfatici și măduva osoasă. pdc-urile seamănă cu celulele plasmatice și se găsesc de obicei în circulația sângelui (8). Monocitele pot fi diferențiate în DCs, care sunt adesea denumite DCS derivate din monocite (modc), după expunerea la factorul de stimulare a coloniilor macrofage granulocite (GM-CSF) și IL-4 (9,10). modc-urile au fost raportate pentru a exprima markerii de suprafață celulară CD80, CD83, CD86 și CD1a in vitro (11-13). În timp ce modc diferă de macrofage în formă și funcție celulară, ele împărtășesc expresia mai multor antigene de suprafață celulară, inclusiv CD11c, CD206 și CD1a (14).

Mai multe grupuri au raportat diferențierea cu succes a monocitelor CD14 + umane în macrofage; cu toate acestea, multe dintre aceste protocoale publicate sunt diferite. O variație comună între aceste metode este includerea (15) sau omiterea (16) a IL-6. O altă diferență între protocoale este calendarul tratamentului. Această lipsă de coerență între protocoale este problematică.

pentru a aborda aceste probleme, am examinat și comparat includerea și omiterea IL-6 în tratamentul cu citokine utilizat în metodologiile comune de diferențiere a monocitelor umane. Am constatat că, în absența IL-6, aceste strategii produc celule cu un grad scăzut de omogenitate, ceea ce poate da rezultate experimentale ambigue. În al doilea rând, pentru a aborda în continuare această problemă, am dezvoltat o nouă strategie in vitro pe etape, cu includerea IL-6. Am constatat că această strategie a îmbunătățit foarte mult omogenitatea celulară a macrofagelor M1 și M2, precum și a modc-urilor care au fost diferențiate de monocitele CD14+ umane. Această îmbunătățire a metodologiei va oferi cercetătorilor modele mai bune pentru investigarea sistemului imunitar și a stărilor de boală.

materiale și metode

preparate celulare

Buffy coats au fost colectate din sângele integral al a cinci sau mai mulți donatori de sex masculin sănătoși care au fost adunați. Celulele mononucleare din sângele periferic (Pbmc) au fost preparate din straturi buffy prin Ficoll-Paque (densitate 1.077 g/mL) (17-1440-02; GE Healthcare Bio-sciences, Piscataway, NJ) centrifugare cu gradient de densitate la 400 XCT la 18 XCT timp de 35 min pentru a separa constituenții din sânge. Celulele au fost spălate de mai multe ori cu ajutorul a 1 PBS-uri de la mie și numărate cu ajutorul unui contor de celule Nexcelom auto T4 plus (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA). Odată numărate, monocitele CD14 + au fost izolate din Pbmc-uri prin etichetare magnetică folosind microbile conjugate MAB CD14 (130-050-201; Miltenyl Biotec, San Diego, CA) urmată de separare folosind coloane magnetice (130-042-401 și 130-042-302; Miltenyl Biotec) conform instrucțiunilor producătorului, cu o singură excepție: la colectarea celulelor CD14+ din coloana magnetică, celulele au fost eliminate inițial folosind tampon de 5 mL bazându-se doar pe gravitație (fără utilizarea pistonului furnizat). După clătirea inițială de 5 mL, s-a adăugat un tampon suplimentar de 5 mL și s-a spălat ușor cu ajutorul pistonului furnizat.

culturi celulare

monocitele CD14+ umane au fost însămânțate la o densitate celulară de 2,0–3.0 105 celule / ml în mediu RPMI 1640 cu 2 mm / L L-glutamină (Life Technologies, Frederick, MD) suplimentat cu 10% FBS inactivat termic (Sigma, Carlsbad, CA), 100 U/mL penicilină (Life Technologies) și 100 mg/mL streptomicină (Life Technologies) la 37 CTC într-un incubator umidificat cu 5% CO2. Pentru a diferenția celulele în macrofage M1, citokinele utilizate au fost GM-CSF (20 ng/mL) (PeproTech, Rocky Hill, NJ), IFN-XV (20 ng/mL), IL-6 (20 ng/mL) și LPS de endotoxină (20 ng/mL). Pentru diferențierea macrofagelor M2, citokinele utilizate au fost factorul de stimulare a coloniilor macrofage (m-CSF), IL-4, IL-6 și IL-13 la o concentrație de 20 ng/mL (PeproTech). modc-urile au fost generate prin adăugarea de GM-CSF (100 ng/mL) și IL-4 (20 ng/mL). Calendarul fiecărei strategii este descris în continuare în Figura 1.

citometria în flux

macrofagele polarizate și DCs au fost cultivate timp de 9 zile pe vase de 10 cm2 (bd Falcon, Billerica, MA). În ziua 9, au fost colectate medii și celule neaderente; celulele aderente au fost spălate cu ajutorul PB-urilor 1 inq, îndepărtate folosind tampon de disociere celulară (tehnologii de viață) și apoi adăugate la mediile colectate/celulele neaderente care urmează să fie spălate. Celulele suspendate au fost centrifugate și spălate de două ori (1% PBS, 0,5% BSA, 2 mm EDTA), numărate și apoi incubate cu anticorpi primari conjugați cu fluorofor împotriva CD206 (FITC), CD36 (pe), CD163 (pe-Cy7), e-cadherin (AlexaFluor-488), CD86 (PE), CD1a (FITC), CD83 (PE), CD80 (PE), CD124 (PE) și CD64 (FITC) în întuneric timp de 45 min la 4 C. fluorescența a fost detectată de un sortare de celule S3TM (Bio-Rad, Hercules, ca).

testul de endocitoză

macrofagele umane polarizate au fost placate în lamele de sticlă cu 4 puțuri (MA nunc Lab-tek II, Thermo Scientific, Waltham, MA) la o densitate de 3.0 0,105 celule/mL în ziua 7 și au continuat să fie cultivate cu citokine adecvate pentru restul de 2 zile. Bisimida de perilen (PBI-12-Man) (17) a fost un cadou amabil De La Ke-Rang Wang la Universitatea Hebei. Celulele au fost cultivate cu 10% / mL PBI-12-om timp de 30 min la 37% C, apoi spălate cu 1% PBS. Celulele au fost fixate folosind 70% etanol și montate cu DAPI (P36962; Life Technologies). Pentru a vizualiza endocitoza omului PBI-12, diapozitivele au fost excitate și emise la 585 nm. Imaginile cu fluorescență roșie au fost cuantificate folosind software-ul de scanare cu diapozitive Metafer (MetaSystems, Boston, MA). Testarea statistică a fost pe format folosind software-ul MATLAB R2015a (Mathworks, Inc., Natick, MA). Testele Rank-sum au fost efectuate pentru a testa semnificația statistică univariată între eșantioane.

imunofluorescența

macrofagele au fost diferențiate folosind metodele descrise anterior timp de 7 zile și apoi transferate în lamele camerei de sticlă cu 4 puțuri nunc Lab-Tek II cu citokinele corespunzătoare. Celulele au fost lăsate să crească în următoarele 7 zile; la 14 zile după placarea inițială, celulele au fost fixate folosind 70% etanol și montate folosind Muntele anti-decolorare Prolong Diamond cu DAPI. Celulele au fost vizualizate folosind contrastul de fază și microscopia fluorescentă pe EVOS FL Auto (Life Technologies).

rezultate și discuții

strategii și Condiții pentru diferențierea monocitelor CD14+ umane

am început prin evaluarea strategiilor care au fost cele mai eficiente în producerea de populații omogene de macrofage M1 și M2 umane, precum și de modc-uri. Monocitele CD14 + umane au fost izolate și însămânțate pe plăci de cultură tisulară pentru a fi diferențiate în macrofage sau modc in vitro. Am testat apoi trei condiții specifice de tratament pentru a determina metoda care a dat cele mai uniforme populații de macrofage și moDC. Pentru prima condiție, am cultivat celule cu adăugarea numai a GM-CSF sau M-CSF timp de 9 zile (Figura 1). Această condiție este denumită „numai” (figura 1). A doua strategie de tratament a fost de a expune continuu celulele la mediul citokinelor aplicabil în ziua 0, de a umple mediile, citokinele și LP-urile în ziua 5 și de a analiza celulele în ziua 9. Această condiție este denumită „continuă” (Figura 1). A treia strategie a fost de a stimula monocitele CD14 + fie cu GM-CSF, fie cu M-CSF timp de 5 zile, urmată de adăugarea de medii proaspete care conțin LP pentru macrofagele M1 umane și toate citokinele aplicabile pentru un anumit grup de tratament (GM-CSF, IFN-XV și IL-6 pentru macrofagele M1 sau M-CSF, IL-4, IL-13 și IL-6 pentru macrofagele m2). Această strategie de tratament a fost denumită „etapizată” (Figura 1). Tratarea monocitelor CD14 + cu 100 ng / mL de GM-CSF și IL-4 Timp de 5 zile și înlocuirea mediilor și a tuturor citokinelor în modc-urile generate în ziua 5. Modc – urile au fost apoi stimulate cu IL-6 și LPS timp de 24 de ore înainte de analiză (Ziua 8) pentru a promova maturarea și activarea DC. Această metodă de cultură a fost denumită „stimulată” (Figura 1). Modc – urile care nu au primit niciodată expunere la IL-6 și LPS au fost denumite „ne-stimulate” (Figura 1). După 9 zile de cultură în condițiile specifice descrise mai sus, au fost analizate expresia receptorilor de suprafață celulară și funcționalitatea celulelor.

expunerea la IL-6 crește eficiența polarizării M2 in vitro

studiile anterioare au arătat că expunerea macrofagelor la citokina IL-6 nu numai că distorsionează diferențierea monocitelor de la o celulă dendritică la un fenotip macrofagic, dar că expunerea la IL-6 crește, de asemenea, profilul expresiei ARNm asociat cu macrofagele M2 (15,18). Pentru a confirma aceste constatări și pentru a testa efectul IL-6 asupra polarizării M1 și M2, monocitele CD14+ umane în condiții de cultură continuă și fazată au fost tratate cu sau fără IL-6. Examinarea expresiei markerului de suprafață a macrofagelor m2 în celulele diferențiate M1 nu a arătat modificări semnificative atunci când a fost cultivat cu IL-6 (Figura 2), sugerând că tratamentul cu IL-6 nu șuntează macrofagele polarizate M1 spre un fenotip m2.

în schimb, analiza grupurilor de cultură macrofage m2 continue și fazate a arătat că tratamentul IL-6 a crescut expresia markerilor de suprafață ai macrofagelor M2. În populațiile de macrofage M2, atât expresia CD206, cât și CD36 au rămas ridicate și au apărut nealterate atunci când au fost expuse la IL-6 (Figura 2, a și b). Cu toate acestea, CD163 și e-cadherin au prezentat creșteri semnificative ale nivelurilor de expresie a suprafeței și omogenității populației atunci când au fost tratate cu IL-6 (Figura 2, C și D). Acest lucru este demonstrat de o scădere a vârfurilor CD163 și e-cadherin cu exprimare scăzută (săgeți roșii în Figura 2, C și D) și trecerea rezultată către o populație omogen de înaltă exprimare.

IL-6 este adesea folosit pentru a induce maturarea moDC (18,19). Pentru a determina dacă tratamentul cu IL-6 ar putea duce la modc-uri nedorite în cadrul populațiilor polarizate de macrofage, a fost examinată expresia mature DC surface marker (CD83). Analiza citometrică în flux a demonstrat că niciuna dintre condițiile de cultură M1 sau M2 nu a promovat o creștere semnificativă a expresiei CD83 (figura 2e). Acest lucru sugerează că nu a existat nicio contaminare cu moDC în cadrul acestor populații de macrofage sau că orice modc contaminante au fost insensibile la IL-6.

polarizarea fazată duce la creșterea expresiei markerilor canonici M1, M2 și moDC de suprafață celulară

pentru a confirma că monocitele CD14+ umane au fost complet diferențiate fie în macrofage, fie în modc până în ziua 9, citometria în flux a fost utilizată pentru a analiza markerii de suprafață celulară și pentru a evalua diferențele morfologice (Figura 3, A-C). Monocitele CD14 + umane au fost diferențiate (Figura 1) pentru a evalua ce strategie ar produce o expresie ridicată a markerilor de suprafață adecvați de tip celular. Un panou de markeri de suprafață celulară a fost testat pentru fiecare dintre tipurile de celule. Panoul nostru de marcare a suprafeței celulare M1 a constat din markerii canonici CD86 și CD80 (Figura 3, A-C). Pentru panoul de macrofage M2 s-au utilizat CD206, CD163, CD124 (receptor IL-4-XV), e-cadherin și CD36 (receptor de captare Clasa B) (Figura 3, A-C). Pentru modc-uri, CD83, CD86 și CD1a au fost utilizate. Nivelurile de expresie a suprafeței pentru toți markerii testați au fost determinate pentru toate tipurile de celule (figura suplimentară S1). Intensitatea mediană a fluorescenței (IFM) a fost calculată și prezentată ca modificare a pliului în raport cu martorul netratat corespunzător (vezi tabelele din Figura 3).

interesant este faptul că analiza markerilor de suprafață celulară M2, CD36 și IL-4RA, în macrofagele polarizate numai GM-CSF M1 a evidențiat creșteri dramatice (figura 3a). La compararea celulelor tratate numai cu GM-CSF cu toate grupurile de tratament M1, grupul tratat numai cu GM-CSF a avut o expresie CD36 semnificativ mai mare. Aceste celule numai GM-CSF au exprimat, de asemenea, niveluri scăzute ale markerilor asociați M1 CD86 și CD80. În mod similar, starea continuă a produs celule care nu numai că au fost scăzute în CD86 și CD80, dar au fost, de asemenea, ridicate în expresia CD36 și IL-4RA. În schimb, când monocitele CD14+ umane au fost diferențiate în condițiile etapizate M1, CD86 și CD80 au fost reglate în mod vizibil, în timp ce expresia CD36 și IL-4RA a rămas scăzută. Analiza citometrică în flux suplimentară a expresiei markerului de suprafață celulară a relevat faptul că macrofagele M1 au avut o expresie mai mică a CD206, CD36 și CD163 în raport cu macrofagele M2 atât sub expunere treptată, cât și continuă (figurile suplimentare s1 și S4). În plus, aceste condiții variate de cultură generează celule cu trăsături morfologice distincte și structură (figura 3A). În timp ce celulele tratate numai cu GM-CSF par a fi mai mari, datele de împrăștiere înainte (FSC) au evidențiat diferențe minime de dimensiune între grupuri (figurile suplimentare S2 și S3). Compararea complexității interne (SSC) între condițiile de tratament a evidențiat o creștere a granularității în grupurile GM-CSF și pe etape (figura suplimentară s2). Împreună, aceste rezultate arată că numai GM-CSF și tratamentul continuu produc celule care exprimă niveluri scăzute de markeri M1 și niveluri ridicate ale anumitor markeri m2, precum și prezintă modificări morfologice.

condițiile de cultivare a macrofagelor M2 au dat rezultate puțin mai ambigue decât cele găsite cu condițiile de cultivare a macrofagelor M1 (figura 3b). În raport cu grupul numai M-CSF, grupurile fazate și continue au prezentat niveluri crescute de Expresie ale CD206. În schimb, nivelurile de suprafață ale IL-4RA au fost semnificativ mai mari în condiții numai M-CSF, comparativ atât cu cele continue, cât și cu cele pe etape. Expresia e-cadherinei a rămas uniformă între grupuri, în timp ce CD163 a fost semnificativ mai mare atât în grupurile numai M-CSF, cât și în grupuri pe etape. O observație notabilă este că grupul de expunere continuă a fost în mod constant mult mai puțin omogen în ceea ce privește expresia markerului de suprafață celulară. Acest lucru este ilustrat de distribuția bimodală și de varianța mare a nivelurilor de Expresie găsite pe histogramă. În plus, se pot observa diferențe morfologice dramatice între grupurile de tratament. Pe baza imaginilor de contrast de fază, grupul numai M-CSF a produs celule care par a fi mai mici și foarte granulare (figura 3b). Analiza citometrică în flux demonstrează că aceste celule au dimensiuni similare( FSC), cu toate acestea, există o creștere a granularității celulare în condițiile de tratament pe etape și continue (figura suplimentară s2). În cele din urmă, privarea de glutamină a modificat polarizarea M2, demonstrând că produsele metabolice sunt necesare în cadrul acestei strategii (figura suplimentară S5). În total, aceste date sugerează că condițiile pe etape produc cea mai mare eficiență pentru polarizarea macrofagelor M2.

am examinat apoi expresia markerului de suprafață a modc-urilor care nu au fost stimulate sau stimulate cu IL-6 și LPS 24 h înainte de analiza citometrică în flux. Stimularea cu IL-6 și LPS a dus la o creștere a expresiei CD80, CD83 și CD86 (figura 3c). Marker DC Matur cd83 expresia suprafeței celulare a crescut dramatic la activare folosind IL-6 și LPS în ziua 8 în raport cu grupul ne-stimulat. Acest lucru a confirmat faptul că IL-6 și LPS au reușit să promoveze maturarea celulelor dendritice (figura suplimentară S1L). Expresia CD1a a rămas uniformă între grupurile ne-stimulate și stimulate. Interesant este că DC-urile stimulate au rămas în suspensie, cu toate acestea, par să înceapă să se agregeze și să adere unul la celălalt (figura 3c). Aceste rezultate confirmă constatările anterioare privind polarizarea moDC și oferă un control suplimentar pentru analiza markerilor de suprafață pentru a identifica populațiile modc nedorite în diferitele condiții de cultură a macrofagelor.

macrofagele M2 generate de expunerea la citokine pe etape posedă funcționalitate asociată M2

receptorul de manoză (CD206) este un receptor endocitar și de reciclare care este foarte exprimat în populațiile noastre de macrofage M2 în condiții de tratament pe etape. Apoi am vrut să evaluăm absorbția ENDOCITARĂ mediată de CD206 în macrofagele noastre. Acest lucru a fost determinat folosind PBI-12-Man, un agent biocompatibil care fluoresce la legarea la receptorul de manoză (17). După un tratament de 1 oră al macrofagelor M1 și M2 cu PBI-12-Man, fluorescența roșie a PBI-12-Man a fost predominant intracelulară în macrofagele M2 în condiții de tratament etapizat și continuu (Figura 4, a și b). Această constatare sugerează că legarea suprafeței celulare la CD206 și endocitoză are ca rezultat localizarea veziculară. Acest lucru este de acord cu datele anterioare din citometria în flux, care au demonstrat că, în condiții de tratament pe etape, macrofagele M2 au prezentat o expresie mai mare a suprafeței celulare a CD206 în raport cu populația de macrofage M1. Interesant, am constatat că celulele numai GM-CSF au prezentat niveluri ridicate de endocitoză PBI-12-om (Figura 4, a și b). Acest lucru se corelează cu datele noastre citometrice de flux (Figura 2), care au demonstrat că condițiile de cultură numai GM-CSF produc celule M1 cu expresia markerului de suprafață asociată cu M2. În total, demonstrăm că aceste celule aveau caracteristicile normale ale macrofagelor și că CD206 era funcțional în populația de macrofage M2.

după 14 zile în cultură, macrofagele M2 au prezentat, de asemenea, capacitatea de a fuziona, ajungând la peste 200 de milimetri în dimensiune și conținând mai mulți nuclei pe celulă (figura 4c). Acestea semănau cu celule gigant multi-nucleate (Mngc) despre care s-a raportat că posedă abilități fagocitare și alte abilități (20). În plus, Mngc-urile au fost asociate cu materiale străine în organism, tuberculoză și cancer (20-23). Această fuziune celulară a fost găsită exclusiv în populațiile noastre de macrofage M2 și a fost mult mai semnificativă în starea fazată M2. În timp ce grupurile numai M-CSF au avut unele celule multinucleate (figura 4C), dimensiunea și numărul lor au fost mult mai mici decât grupul pe etape. Având în vedere capacitatea acestor celule de a îndeplini această funcție asociată macrofagelor, aceste rezultate indică în continuare că condițiile de cultură pe etape produc macrofage foarte asemănătoare M2.

aici am descris noul nostru protocol fazat pentru polarizarea macrofagelor. Am constatat că includerea IL – 6 și calendarul tratamentului de polarizare pe etape sunt absolut critice în generarea celor mai multe macrofage asemănătoare M1 și M2 in vitro. Această constatare a fost testată riguros în comparație cu alte metode de polarizare. Din acest motiv, credem că metoda de polarizare pe etape oferă un pas substanțial înainte. Acest lucru va oferi cercetătorilor standarde experimentale unificate pentru a produce populații omogene de macrofage pentru a le utiliza in vitro și capacitatea de a compara rezultatele lor. În timp ce acest protocol oferă o serie de îmbunătățiri în comparație cu strategiile actuale de polarizare, credem că cercetarea suplimentară și optimizarea timpilor de expunere și a cocktailului de citokine ar fi utile. Acest lucru ne va ajuta să înțelegem în continuare rolurile complexe ale macrofagelor M1 și M2 în diferite forme de progresie a bolii și să avansăm dezvoltarea de noi terapii.