rezultate și discuții

Hanc-urile provin din epiderma capului și necesită funcția genei lb. Studiile anterioare (5, 11, 17, 19) au descris rolul genelor lb în procesele de specificare a destinului celular. În Drosophila, experimentele de câștig și pierdere a funcției au arătat că genele lb specifică identitatea unui subset de celule cardiace și musculare și că această funcție rezultă din expresia mezodermică foarte restrânsă, specifică liniei lb. În plus, analiza precisă a lbe (Fig. 1) și modelul de Expresie lbl (datele nu sunt prezentate) la debutul fuziunii inimii a relevat un grup triunghiular de celule lb-pozitive situate chiar anterior la vârful inimii (Fig. 1 A, vârf de săgeată). Pentru a produce o descriere mai precisă a poziției acestor celule în ceea ce privește glandele limfatice asociate inimii și glandele inelare, am marcat dublu embrioni pentru lb și markeri specifici ai glandelor (Fig. 1 B și C). Precursorii glandei limfatice au relevat cu anticorpi anti-șarpe flancați de fiecare parte a vârfului inimii (Fig. 1B) dar nu se suprapun cu zona etichetată de lb. În mod similar, dubla colorare a liniei de capcană l(2)1857, care exprimă în mod specific LacZ în primordia embrionară a glandei inelare (15), demonstrează că celulele lb-pozitive sunt situate imediat în fața glandei inelare (Fig. 1C).

pentru a determina originea celulelor lb-pozitive asociate inimii, am urmărit expresia lb în partea anterioară a embrionilor încă din stadiul incipient. În stadiile embrionare care preced fuziunea inimii, nu am putut detecta expresia lb asociată cu partea anterioară a două primordii cardiace. Această constatare a sugerat că celulele lb-pozitive nu sunt specificate inițial în zona inimii și pot reprezenta celule de origine diferită care se asociază cu celulele cardiace în etapele ulterioare. Într-adevăr, la etapa târzie 11, un grup de celule lb-pozitive în epiderma capului dorsal (Fig. 2A) pot fi detectate. Aceste celule încep să invagineze puțin mai târziu și formează partea principală a epidermei pliate (Fig. 2B). Poziția și momentul acestei invaginații seamănă cu o pliere a epidermei capului, dând naștere părții posterioare a pungii dorsale numită sacul frontal (20). Pentru a verifica dacă celulele care exprimă lb corespund vârfului sacului frontal, am folosit linia escargot-LacZ n516 care exprimă lacZ în celulele care formează punga dorsală (20). Pete duble din etapa 14 (Fig. 2B) și etapa 16 (Fig. 2C) embrionii N516 care utilizează anticorpi anti-Lbe și anti-galactozidază demonstrează clar că lb și esg sunt coexprimate în vârful sacului frontal invaginant. O vedere dorsală a regiunii capului embrionar (Fig. 2D) confirmă faptul că aceste celule prezintă același aranjament triunghiular ca și celulele lb-pozitive asociate inimii prezentate anterior (comparați Fig. 2D și 1).

luate împreună, aceste date indică faptul că celulele care exprimă lb situate imediat în fața inimii provin din epiderma capului și migrează spre vârful inimii în timpul invaginării sacului frontal. Această observație ridică o întrebare suplimentară cu privire la rolul genelor lb în specificarea acestui grup de celule. Am arătat anterior că genele lb joacă un rol important în specificarea unui subset de precursori cardiaci și musculari (11, 19). Analiza funcțională a genei lb ortholog lbx1 de șoarece (21, 22) a relevat, de asemenea, implicarea sa în controlul specificării și migrării direcționate a precursorilor musculaturii apendiculare. Mai mult, cele mai recente date indică faptul că Lbx1 la șoareci specifică o subpopulație a celulelor crestei neuronale cardiace necesare dezvoltării cardiace normale (23).

pentru a testa dacă Drosophila lb este necesară pentru specificarea celulelor asociate inimii, am analizat formarea pungii dorsale în embrioni deficienți pentru ambele gene lb (vezi materiale și metode). Folosind sonda ARN esg ca marker, am demonstrat că la embrionii lbdef expresia esg în partea distală a sacului frontal care poartă celulele asociate inimii este absentă (comparați Fig. 2 E și G cu F și H). În plus, după cum arată vederile dorsolaterale ale embrionilor din stadiul 14 (Fig. 2 G și H), distanța dintre sacul de gălbenuș și cele mai distale celule esg pozitive este mărită semnificativ la embrionii cu deficit de lb. Această constatare, susținută de observația optică Nomarski care dezvăluie că partea posterioară a sacului frontal a modificat morfologia (datele nu sunt prezentate), a indicat că Hanc-urile nu sunt specificate sau nu migrează corect în embrionii lbdef. Deoarece deficitul analizat acoperă și genele adiacente bap și C15, am testat formarea sacului frontal în embrioni mutanți bap și embrioni Arm-GAL4>UAS-Arnaic15. Atât în embrionii bap208, cât și în Arnaic15, sacul frontal colorat cu esg a avut o formă normală (datele nu au fost prezentate), excluzând astfel influența genelor bap și C15 asupra diferențierii sau migrării celulelor asociate inimii. Aceste date sugerează cu tărie că modelul anormal al celulelor sacului frontal distal esg-pozitiv în embrionii lbdef rezultă din pierderea funcției lb.

componente mezodermice și Nonmesodermice implicate în modelarea Regiunii de ieșire cardiacă. Experimentele noastre imunostimulante au arătat că celulele lb-pozitive care ancorează inima se află foarte aproape de cardioblastele care exprimă lb (Fig. 1). Deoarece cele mai multe cardioblaste anterioare exprimă staniu (5), am marcat dublu embrioni cu anticorpi anti-staniu și anti-LBE pentru a vizualiza pozițiile respective ale vârfului inimii și partea cea mai distală a sacului frontal. În mod surprinzător, aceste două structuri se suprapun cu aproximativ trei lungimi de celule atunci când sunt observate din partea dorsală (Fig. 3A). Mai mult, vederea confocală laterală a regiunii inimii anterioare (Fig. 3B) arată clar că vârful sacului frontal, care constă din celule care exprimă lb nemesodermice, este atașat direct la inimă. Mai precis, am observat că partea anterioară a aortei (care se suprapune parțial celulelor lb asociate inimii) se îndoaie ventral, formând o zonă distinctă morfologic corespunzătoare regiunii de ieșire cardiacă. Această morfologie sugerează că ar putea exista o componentă celulară suplimentară care să favorizeze îndoirea ventrală a inimii. Am decis să căutăm prezența unui mușchi localizat ventral atașat la vârful aortei. Vederea laterală a embrionului, dublu colorată pentru lanțul greu de miozină (Myo) și Lbe (Fig. 3C), arată clar că ieșirea inimii este într-adevăr atașată de un mușchi al capului, pe care propunem să-l numim COM. Analiza mai precisă a secțiunilor confocale a arătat că primordiul cardiac este, de fapt, legat de două com-uri strâns situate care se extind de la esofag și se atașează de ambele părți ale regiunii de ieșire cardiacă (vârfuri de săgeată deschise în Fig. 3D). În mod surprinzător, acești mușchi ai capului embrionar nu au fost descriși anterior cunoștințelor noastre. Lipsa documentației publicate pentru COMs se datorează probabil morfologiei și originii mușchilor somatici ai capului în embrionul Drosophila nu au fost analizate sistematic. Folosind singura descriere disponibilă a musculaturii capului adult făcută de Miller (24), nu am putut identifica mușchii capului adulți care ar putea corespunde com-urilor embrionare prezentate aici.

interesant, colorarea dublă Myo / Lbe a arătat, de asemenea, că Hanc-urile nonmesodermice sunt atașate ambelor celule cardiace (Fig. 3E) și Com (Fig. 3D). Deoarece Hanc-urile exprimă lb și se asociază selectiv cu cea mai anterioară pereche lb-pozitivă de celule cardiace (Fig. 3E și 4 D-F), speculăm că stabilirea acestui contact poate implica interacțiuni celulare de tip homofil. Testarea moleculelor de adeziune celulară implicate în semnalizarea intercelulară între celulele homotipice (25, 26) va ajuta la definirea mecanismelor care stau la baza stabilirii conectivității între Hanc-urile care exprimă lb și celulele cardiace.

pentru a vizualiza dispunerea spațială a vârfului aortei, A Com-urilor și a Hanc-urilor care exprimă lb, am folosit analiza 3D asistată de computer și reconstrucția scanărilor confocale. Această abordare a confirmat pe deplin observațiile noastre, dezvăluind că, pe lângă Hanc-uri, regiunea de ieșire a inimii este strâns atașată de o pereche de COM-uri (Fig. 3F). Acești mușchi se suprapun vârful inimii de pe ambele părți și contribuie la îndoirea ventrală.

pentru a înțelege modul în care contactul dintre inimă, COMs și HANCs este stabilit în timpul dezvoltării, am monitorizat aceste structuri în embrionii din stadiul 14 timpuriu și târziu (Fig. 3 G și H). Datele noastre indică faptul că atât celulele cardiace lb-pozitive, cât și Hanc-urile care exprimă lb atrag comunicațiile extinse.

contactul dintre COMs și HANCs pare să preceadă ușor atașamentul COM la vârful aortei și este văzut la începutul etapei 14 (Fig. 3G). În acel moment, fillopodia COM se extinde în direcția celulelor cardiace lb-pozitive (Fig. 3G) și să se atașeze definitiv de aceste celule în stadiul final 14 la debutul fuziunii cardiace (Fig. 3H). Deoarece com-urile intră în contact cu celulele cardiace și Hanc-urile înainte ca Hanc-urile să se atașeze de inimă, speculăm că com-urile, pe lângă îndoirea vârfului inimii, facilitează contactul cu Hanc-urile. Stabilirea contactului între mușchii somatici și locurile lor de atașare epidermică (celulele tendonului) a fost studiată extensiv (27), dezvăluind rolul cheie al benzii factorului de transcripție a degetului de zinc (28) și a unei proteine care leagă ARN-ul cum (29). Am folosit ambii markeri pentru a testa dacă Hanc-urile și celulele cardiace la care com-urile atașează proprietățile de afișare ale celulelor asemănătoare tendonului. Etichetarea dublă efectuată pe embrioni WT cu anti-Lbe/anti-bandă și pe embrioni how-lacZ cu anticorpi anti-LBE/anti-Lacz a arătat că Hanc-urile și celulele cardiace care intră în contact cu COM nu exprimă markeri ai celulelor tendinoase (datele nu sunt prezentate). Această constatare indică faptul că celulele lb-pozitive atrag com-urile utilizând un mecanism diferit de cel utilizat de celulele tendonului. Cei mai interesanți candidați pentru ghidarea com-urilor sunt Fanta proteică secretată care posedă motivele de legare a proteinelor multiple și receptorii săi Robo și Robo2 (30). Slit și Robo au apărut recent ca componente pivot care controlează procesele de atracție și repulsie în timpul morfogenezei mușchilor somatici (31), sugerând că ar putea fi implicați și în atracția COM.

cele mai anterioare celule cardiace care exprimă lb joacă un rol Central în modelarea Regiunii de ieșire cardiacă. Observația că atât com-urile, cât și Hanc-urile au ales să se atașeze la cele mai anterioare celule cardiace lb-pozitive ne-a determinat să testăm dacă dereglarea expresiei lb în inimă ar putea influența modelarea regiunii de ieșire cardiacă. Pentru a efectua acest test, am folosit sistemul de Expresie orientat Gal4/UAS (16). Au fost utilizate două linii efectoare GAL4 diferite, 24B-GAL4 și Tin-GAL4 (Fig. 4 A și C). Linia 24B-GAL4 permite exprimarea țintită în toate celulele cardiace și musculare (Fig. 4A) cu un nivel uniform și ridicat de exprimare în cele mai anterioare celule ale inimii (săgeata din Fig. 4A). Linia Tin-GAL4 (oferită cu amabilitate de R. Bodmer) induce expresia transgenă UAS selectiv în patru cardioblaste din fiecare hemisegment (acestea includ celulele lb-pozitive), dar nivelul de inducție în cele mai anterioare celule cardiace este mai mic (săgeata din Fig. 4C) decât cea a liniei 24B-GAL4. Pentru a extinde expresia cardiacă lb, ambele linii efectoare GAL4 au fost traversate cu linia UAS-lbe. Expresia cardiacă ectopică lb determinată de linia Tin-GAL4 a fost mai slabă decât expresia lb endogenă din inimă și nu au fost observate modificări evidente induse de câștig-funcție în modelarea regiunii de ieșire cardiacă (datele nu sunt prezentate). În schimb, embrionii 24B-GAL4>UAS-lbe au prezentat o expansiune marcată a expresiei lb în inimă (Fig. 4G), ceea ce duce la contactul anormal al COMs cu vârful inimii. Mai precis, am constatat că com-urile se atașează direct la cele mai anterioare celule cardiace care formează fluxul cardiac (asteriscul din Fig. 4G) și nu la a doua pereche de celule cardiace ca în WT (Fig. 4D). Conexiunea modificată a COMs rezultă cel mai probabil din semnalele atractive ectopice generate de expresia cardiacă mărită a lb. În consecință, îndoirea ventrală a celei mai anterioare părți a inimii a fost mai pronunțată (comparați Fig. 4 D și G). De asemenea, am observat o morfologie modificată a com-urilor (vârf de săgeată deschis în Fig. 4 D și G), care ar putea rezulta din expresia musculară ectopică 24B-GAL4 a lb. Contactul dintre Hanc și celulele cardiace nu a fost afectat de condițiile experimentale de exprimare greșită. Pentru a testa dacă expresia cardiacă lb este necesară pentru atragerea COMs, am profitat de influența de reglementare negativă descrisă anterior a lui even-skipped (eve), care este capabilă să reprime în mod specific lb în celulele cardiace (5). Din nou, liniile efectoare 24B-GAL4 și Tin-GAL4 au fost folosite pentru a conduce expresia eve în inimă. Am constatat că ambii șoferi încrucișați cu linia UAS-eve (Tin-GAL4 cu penetrare mai mică) duc la reprimarea activității lb în inimă (Fig. 4 H și I). În ciuda defectelor de specificare greșită, primordia cardiacă se formează în mod normal în câștigul UAS-eve al embrionilor funcției (ref. 5 și Fig. 4B), permițându-ne să monitorizăm com-urile și Hanc-urile într-un context în care expresia cardiacă a lb este epuizată. Datele noastre arată că în astfel de embrioni epuizați de lb (vezi absența expresiei cardiace lb în Fig. 4 H și I) com-urile nu se atașează la vârful inimii. Am observat că com-urile s-au extins anterior și s-au atașat de hanc-urile invaginante (Fig. 4 H și I), care nu mai sunt capabile să ancoreze corect vârful inimii. Principala ramură COM care se atașează în mod normal la regiunea de ieșire cardiacă (comparați Fig. 4 E și F cu H și I) a fost absent sau fuzionat cu ramura atașată HANC. Astfel, credem că forma anormală a COM și pierderea completă a contactului său cu vârful inimii sunt cauzate de epuizarea cardiacă lb. Această ipoteză este susținută de faptul că aceleași fenotipuri au fost observate la embrionii cu expresie ectopică cardiacă (Tin-GAL4) și cardiacă plus musculară (24B-GAL4) a eve (comparați Fig. 4 H și I). Contactul modificat și poziționarea com-urilor au apărut la embrionii din stadiul 14 târziu, când lanțul greu de miozină nu este încă detectabil în cardioblaste (Fig. 4 E și H). Analiza embrionilor din stadiul 15 a relevat, în plus, că pierderea expresiei cardiace lb este însoțită de reglarea descendentă a tubulinei de la centa3 (vezi Fig. 4 F și i) în regiunea de ieșire cardiacă, indicând faptul că expresia lb în inimă are un impact important asupra morfogenezei cardiace finale. Aceste date completează rapoartele recente care descriu rolurile morfogenetice ale unui membru al familiei receptorului COUP-TF, Seven-up, exprimat în perechea posterioară de cardioblaste din fiecare segment și necesar pentru formarea ostiei în segmentele abdominale A5–A7 (32, 33). În acest context, demonstrarea rolului lb în modelarea regiunii de ieșire cardiacă crește posibilitatea ca în segmentele abdominale lb să joace un rol similar în stabilirea contactului dintre celulele cardiace și mușchii Alari care ancorează inima. Această ipoteză rămâne de investigat.

Mai mult, fenotipurile prezentate (Fig. 4) sugerează că expresia lb epuizată experimental în inimă influențează emisia sau recepția semnalelor atractive de către celulele cardiace și, în consecință, duce la întreruperea contactului cu COMs. Același atractiv muscular sau similar este probabil să fie produs sau primit de Hanc-uri lb–pozitive, sugerând astfel că lb reglează expresia genelor implicate în contactul celulă-celulă. Interesant, în omologul lb de șoarece, s-a constatat că gena lbx1 este necesară pentru migrarea direcționată a unui subset de precursori ai mușchilor (21, 22), indicând faptul că ar putea exista mecanisme de mișcare celulară conservate care sunt controlate de genele lb.

luate împreună, prin analiza embrionilor în care expresia lb cardiacă a fost extinsă sau epuizată experimental, am demonstrat că lb este necesară pentru atașarea corectă a Hanc-urilor și Com-urilor și, în consecință, pentru modelarea corectă a regiunii de ieșire cardiacă. Această constatare oferă informații despre semnificația funcțională a diversificării antero–posterioare a precursorilor cardiaci în cadrul fiecărui segment al inimii Drosophila.

poate Hancs să reprezinte un prototip Drosophila al celulelor crestei neuronale? Morfogeneza inimii Vertebrate implică două tipuri diferite de celule, primordia inimii mezodermice și o subpopulație a celulelor crestei neuronale care migrează din regiunea capului. În acest articol, am arătat că în Drosophila un grup de celule nonmesodermice originare din epiderma capului (pe care am numit-o HANCs) contribuie la morfogeneza finală a inimii. Ca și în celulele creastei neuronale vertebrate, Hanc-urile suferă mișcări direcționate, intră în contact cu celulele cardiace și participă la modelarea regiunii de ieșire cardiacă. Am demonstrat că genele homeobox lb cunoscute a fi implicate în diversificarea precursorilor cardiaci (5, 11) sunt exprimate în Hanc și sunt necesare pentru specificarea lor. În mod similar, ortologul lb, gena Lbx1, s-a dovedit recent necesar pentru specificarea unui subset de celule de creastă neuronală cardiacă la șoarece (23), indicând faptul că genele lb/Lbx1 joacă un rol conservat în specificarea componentelor nonmesodermice ale inimii. În acest punct de vedere, Hanc-urile ar putea fi într-adevăr comparate cu celulele creastei neuronale vertebrate. Cu toate acestea, datele noastre indică, de asemenea, că Hanc-urile prezintă cel puțin două caracteristici specifice numai pentru Drosophila: (i) se mișcă ca parte a ectodermului capului pliat și nu ca celule de creastă neuronală delaminate; și (ii) formează un complex funcțional cu COM-uri, care nu au structuri omoloage la vertebrate. Astfel, sunt necesare analize suplimentare pentru a elucida rolul exact al Hanc-urilor și potențialele lor funcții asemănătoare celulelor crestei neuronale.