rezumat

sunt disponibile diverse tehnici pentru izolarea Candidei în cavitatea bucală. Astfel de metode joacă un rol important în diagnosticul și gestionarea candidozei orale. Importanța crescândă a Candidei este în parte legată de apariția infecției cu HIV și de utilizarea mai răspândită a chimioterapiei imunosupresoare. Împreună cu Candida albicans a existat o recunoaștere mai mare a importanței speciei nonalbicans Candida în candidoza orală. Identificarea tulpinilor infectante de Candida este importantă deoarece izolatele speciilor de Candida diferă foarte mult, atât prin capacitatea lor de a provoca infecții, cât și prin susceptibilitatea lor la agenți antifungici. Astfel, această revizuire oferă o imagine de ansamblu asupra metodelor fiabile de izolare candidală și identificarea izolatelor din cavitatea bucală.

1. Introducere

termenul Candida provine din cuvântul latin candid, adică alb. Sporii de Candida sunt o formă comensală, inofensivă a unei ciuperci dimorfe care devine pseudohypha invazivă și patogenă atunci când există o perturbare a echilibrului florei sau în debilitarea gazdei .

traducerea acestui comensal endogen la parazitul cauzator de boală poate fi asociată cu alți factori decât atributele patogene ale organismului însuși, care este mai degrabă unic în comparație cu majoritatea celorlalte boli infecțioase, unde virulența organismelor considerate a fi factorul cheie în patogeneză. Prin urmare, speciile Candida sunt strict oportuniste. S-ar putea afirma că nici formele superficiale, nici cele sistemice ale infecțiilor cu Candida nu ar putea fi inițiate în absența patologiei subiacente .

există multe specii de Candida (Tabelul 1), dar cea mai răspândită care este recuperată din cavitatea bucală, atât în stare comensală, cât și în cazuri de candidoză orală, este C. albicans. Se estimează că această specie reprezintă peste 80% din toate izolatele de drojdie orală.

în ultimii ani a existat un interes crescut pentru infecțiile cauzate de agentul patogen oportunist Candida. Importanța crescândă a Candidei este în parte legată de apariția infecției cu HIV și de utilizarea mai răspândită a chimioterapiei imunosupresoare . Identificarea tulpinilor infectante de Candida este importantă deoarece izolatele speciilor de Candida diferă foarte mult, atât prin capacitatea lor de a provoca infecții, cât și prin susceptibilitatea lor la agenți antifungici .

împreună cu C. albicans a existat o recunoaștere mai mare a importanței speciei non-albicans Candida în boala umană. C. glabrata și C. krusei sunt specii care au primit atenție datorită rezistenței lor sporite la anumiți agenți antifungici. C. dubliniensis este o specie patogenă recent identificată, descrisă pentru prima dată în 1995 când a fost coisolată cu C. albicans din cazuri de candidoză orală la persoanele infectate cu HIV .

această revizuire oferă o imagine de ansamblu asupra metodelor fiabile de izolare candidală și identificarea izolatelor din cavitatea bucală.

2. Atributele patogene ale Candidei

tranziția Candidei de la un organism comensal inofensiv la un organism patogen este complexă și este legată de schimbări subtile de mediu care duc la exprimarea unei serii de factori de virulență (Tabelul 2). Este efectul combinat atât al gazdei, cât și al factorilor candidali care contribuie în cele din urmă la dezvoltarea candidozei orale .

indiferent de tipul de candidoză, capacitatea speciilor Candida de a persista pe suprafețele mucoasei persoanelor sănătoase este un factor important care contribuie la virulența acesteia. Acest lucru este deosebit de important în cavitatea bucală, unde organismul trebuie să reziste acțiunii mecanice de spălare a unui flux relativ constant de salivă către esofag .

nu este recunoscut un singur factor de virulență predominant pentru Candida, deși există o serie de factori care au fost implicați în promovarea procesului de infectare. Acestea includ atribute implicate în aderența Candidei la suprafețele orale (de exemplu, hidrofobicitatea relativă a suprafeței celulare și prezența moleculelor specifice de Adezină), capacitatea de a rezista mecanismelor de apărare imună a gazdei (de exemplu, comutarea fenotipică de înaltă frecvență și tranziția morfologică) și eliberarea enzimelor hidrolitice (de exemplu., secretat aspartil proteinaze și fosfolipaze) care pot induce deteriorarea celulelor gazdă .

3. Candidoza orală

Samaranayake a propus o clasificare în care leziunile candidozei orale au fost împărțite în două grupe principale: Grupul I sau candidoze orale primare limitate la leziuni localizate în cavitatea bucală fără implicarea pielii sau a altor mucoase; grupul II sau candidoze orale secundare, unde leziunile sunt prezente atât în locurile orale, cât și în cele extraorale, cum ar fi pielea (Tabelul 3). Leziunile din grupa I constau din triada clasică—variante pseudomembranoase, eritematoase și hiperplastice—iar unele au sugerat subdivizarea ulterioară a acestora din urmă în tipuri asemănătoare plăcii și nodulare .

4. Diagnosticul candidozei orale

diagnosticul candidozei orale se poate face adesea în funcție de natura caracteristicilor clinice de prezentare, deși trebuie luate probe microbiologice, dacă este posibil, pentru a identifica și cuantifica orice Candida care poate fi prezentă și pentru a furniza izolate pentru testarea sensibilității antifungice.

5. Metode de izolare

tehnicile disponibile pentru izolarea Candidei în cavitatea bucală includ utilizarea unui frotiu , a unui tampon simplu , a unei culturi de amprentă , colectarea salivei întregi , clătirea orală concentrată și biopsia mucoasei. Fiecare metodă prezintă avantaje și dezavantaje deosebite, iar alegerea tehnicii de eșantionare este guvernată în primul rând de natura leziunii care urmează să fie investigată (Tabelul 4). În cazul în care o leziune accesibilă și definită este evidentă, este adesea preferată o abordare directă de eșantionare, cum ar fi utilizarea unui tampon sau a unei amprente, deoarece aceasta va furniza informații despre organismele prezente la leziune. În cazurile în care nu există leziuni evidente sau în cazurile în care leziunea este dificil de accesat, este mai acceptabilă o probă indirectă bazată pe cultivarea probelor de salivă sau o clătire orală.

estimarea cantitativă a încărcăturii fungice se poate face folosind amprente, clătire orală concentrată și cultivarea clătirii orale, ca mijloc de diferențiere între transportul comensal și existența patogenă a Candidei orale, cu sarcini mai mari considerate probabile în aceasta din urmă .

6. Microscopie directă

caracteristicile morfologice ale speciilor Candida (Tabelul 5) trebuie examinate pentru identificare. Un frotiu are valoare în diferențierea dintre drojdie și formele hifale, dar este mai puțin sensibil decât metodele culturale . Prepararea epruvetei cu hidroxid de potasiu (KOH) evidențiază hife septate nepigmentate cu ramificare dihotomică caracteristică (la un unghi de aproximativ 45%). În metoda KOH-Calcofluor fluorescent-pete caracteristicile fungice precum hifele, celulele de drojdie și alte elemente fungice vor fluoresce .

un frotiu luat de pe site-ul lezional este fixat pe lamelele microscopului și apoi colorat fie prin pata gram, fie prin tehnica periodic acid Schiff (PAS). Folosind aceste metode, hifele și drojdiile candidale apar fie Albastru închis (Gram-pată), fie roșu/violet (PAS) .

în cazul candidozei hiperplastice cronice, este necesară o biopsie a leziunii pentru detectarea ulterioară a Candidei invadatoare prin colorare histologică folosind fie petele de argint de metenamină pas, fie Gomori. Demonstrarea elementelor fungice din țesuturi se face deoarece acestea sunt vopsite profund de aceste pete. Prezența blastosporilor și hifelor sau pseudohifelor poate permite histopatologului să identifice ciuperca ca specie de Candida și, având în vedere prezența altor caracteristici histopatologice, să facă un diagnostic de candidoză hiperplastică cronică .

7. Cultură de laborator

7.1. Tampon

un tampon al unui situs lezional este o metodă relativ simplă de detectare a creșterii și poate fi obținută estimarea semicantitativă a Candidei. Metoda de eșantionare implică frecarea ușoară a unui tampon steril de bumbac peste țesutul lezional și apoi inocularea ulterioară a unui mediu de izolare primar, cum ar fi agarul dextroză Sabouraud (SDA) .

7.2. Clătire orală concentrată

tehnica de clătire orală implică pacientul care deține 10 mL de soluție salină sterilă tamponată cu fosfat (0,01 M, pH 7,2) în gură timp de 1 minut. Soluția este apoi concentrată (de 10 ori) prin centrifugare și un volum cunoscut, de obicei 50 ect, inoculat pe un mediu de agar folosind un sistem de placare în spirală. După 24-48 ore de incubare la 37 CTC, creșterea este evaluată prin enumerarea coloniilor și exprimată ca unități de formare a coloniilor candidale per mL (cfu mL-1) de clătire .

7.3. Cultura de imprimare

metoda de imprimare utilizează un tampon steril de spumă de dimensiuni cunoscute (de obicei 2,5 cm2), înmuiat anterior într-un mediu lichid adecvat, cum ar fi bulionul Sabouraud, imediat înainte de utilizare. Tamponul este apoi plasat pe locul țintă (mucoasă sau proteză intraorală) timp de 30 de secunde și apoi transferat într-un agar pentru Cultură .

8. Medii de cultură

cel mai frecvent utilizat mediu de izolare primară pentru Candida este SDA care, deși permite creșterea Candidei, suprimă creșterea multor specii de bacterii orale datorită pH-ului scăzut. încorporarea antibioticelor în SDA va crește și mai mult selectivitatea sa . De obicei SDA este incubat aerobically la 37 C pentru 24-48 ore. Candida se dezvoltă ca colonii convexe cremă, netedă, pastă pe SDA și diferențierea între specii este rareori posibilă . Se estimează că mai multe specii de Candida apar în aproximativ 10% din probele orale, iar în ultimii ani capacitatea de a detecta speciile nonalbicane a devenit din ce în ce mai importantă .

în ultimii ani, au fost dezvoltate alte medii diferențiale care permit identificarea anumitor specii de Candida pe baza aspectului și culorii coloniei după cultura primară. Avantajul acestor medii este că prezența mai multor specii de Candida într-o singură infecție poate fi determinată, ceea ce poate fi important în selectarea opțiunilor de tratament ulterioare . Exemple de acestea includ agar Pagano-Levin sau Agari cromogeni disponibili în comerț, și anume, CHROMagar Candida, Albicans ID, Fluroplate sau Candichrom albicans .

Pagano-Levin agar distinge între speciile Candida pe baza reducerii clorurii de trifeniltetrazoliu. Mediul produce colonii de culoare palidă de C. albicans, în timp ce coloniile altor specii de Candida prezintă grade diferite de colorare roz. Agarul Pagano-Levin are o sensibilitate similară cu SDA, dar este superior pentru detectarea mai multor specii din probă, CHROMagar Candida identifică C. albicans, C. tropicalis și C. krusei pe baza culorii și aspectului coloniei, în timp ce Albicans ID și Fluroplate s-au dovedit benefice pentru identificarea prezumtivă a C. albicans . Specificitatea identificării este raportată a fi de 95% Pentru CHROMagar Candida și 98,6% pentru Albicans ID și fluroplate agars . Utilizarea CHROMagar Candida ca agar primar de izolare a fost citată ca o abordare care permite discriminarea C. dubliniensis nou descrisă de C. albicans. Pe CHROMagar Candida, C. dubliniensis se dezvoltă ca colonii verzi mai închise în comparație cu cele ale C. albicans . Cu toate acestea, discriminarea dintre aceste două specii folosind Cromagar pare să scadă la subcultura și depozitarea izolatelor. Eșecul C. dubliniensis de a crește pe medii de agar la temperatura ridicată de incubație de 45 centicc a fost recent sugerat ca un test alternativ pentru a discrimina aceste două specii .

9. Identificarea speciilor de Candida

identificarea drojdiilor pe baza mediilor de cultură primare poate fi confirmată printr-o varietate de teste suplimentare bazate în mod tradițional pe caracteristicile morfologice (Tabelul 5) și fiziologice ale izolatelor.

9.1. Criterii morfologice

testul cu eprubetă este metoda standard de laborator pentru identificarea C. albicans. Testul implică inducerea unor excrescențe hifale (tuburi germinative) atunci când sunt subculturate în ser de cal la 37 centicc timp de 2-4 ore. Aproximativ 95% din izolatele C. albicans produc tuburi germinale, o proprietate împărtășită și de C. stellatoidea și C. dubliniensis .

C. albicans și C. dubliniensis pot fi, de asemenea, identificate din alte specii pe baza capacității lor de a produce caracteristici morfologice cunoscute sub numele de chlamydospori. Chlamydosporii sunt structuri sferice refractile generate la capetele hifelor în urma culturii izolatelor pe un mediu sărac din punct de vedere nutrițional, cum ar fi agar de făină de porumb. Izolatele sunt inoculate într-un model de trapă încrucișată pe agar și suprapuse cu o acoperire sterilă. Agarii sunt incubați timp de 24-48 ore la 37 C și apoi examinați microscopic pentru prezența chlamydosporului .

9.2. Criterii fiziologice / identificarea biochimică

identificarea biochimică a speciilor Candida se bazează în mare parte pe utilizarea carbohidraților. Testarea tradițională ar fi implicat cultura izolatelor de testare pe un agar bazal lipsit de o sursă de carbon. Soluțiile de carbohidrați ar fi apoi plasate în puțurile agarului însămânțat sau pe discurile de hârtie de filtru situate pe suprafața agarului. Creșterea în vecinătatea sursei de carbon ar indica utilizarea. Sistemele comerciale se bazează pe același principiu, dar carbohidrații de testare sunt adăpostiți în puțuri de plastic situate pe o bandă de testare. Creșterea în fiecare puț este citită prin modificări ale turbidității sau modificări de culoare în anumite sisteme de kit. Codurile numerice obținute din rezultatele testelor sunt utilizate pentru identificarea organismului testat pe baza comparației bazei de date .

9.3. Serologie

testele serologice sunt frecvent utilizate pentru a stabili semnificația clinică a speciilor de Candida izolate. Creșterea titrurilor de anticorpi lgG la C. albicans poate reflecta candidoza invazivă la persoanele imunocompetente. Detectarea anticorpilor IgA și IgM este importantă pentru identificarea unei infecții acute. Persoanele imunosupresate prezintă adesea variabilitate în producția de anticorpi și, în acest caz, se recomandă utilizarea unui test de detectare a antigenului. Teste precum enzyme linked immunosorbent assay (Elisa) și radio immuno assay (Ria) pentru detectarea antigenului candidial, fie mannanul peretelui celular, fie constituenții citoplasmatici sunt acum disponibili în țările dezvoltate .

diagnosticul serologic este adesea întârziat, iar testele încă nu au sensibilitate și specificitate. Mai mult, producția de anticorpi la pacienții imunocompromiși este variabilă, ceea ce complică diagnosticul . Acest lucru se datorează faptului că antigenii fungici și metaboliții sunt adesea eliminați rapid din circulație, iar prezența anticorpilor nu implică întotdeauna o infecție cu Candida, în special la pacienții cu boală gravă sau care iau medicamente imunosupresoare .

testele serologice nu sunt în mod normal un instrument de diagnostic pentru candidoza orală. Cu toate acestea, astfel de teste pot fi un instrument prognostic la pacienții cu candidoză orală severă care răspund slab la terapia antimicotică .

9.4. Metode de identificare moleculare

identificarea prin analiza variabilității genetice este o abordare mai stabilă decât utilizarea metodelor bazate pe criterii fenotipice. Pentru identificarea Candidei pe baza variației genetice sunt analizate diferențele cariotipului electroforetic și polimorfismele lungimii fragmentelor de restricție (RFLP) utilizând electroforeza în gel sau hibridizarea ADN-ADN .

abordările PCR specifice speciilor au fost, de asemenea, utilizate pentru identificarea speciilor Candida. Au fost raportate mai multe gene țintă pentru discriminarea speciilor Candida, deși cele mai frecvent amplificate sunt secvențele operonului ARN ribozomal. Identificarea poate fi obținută pe baza dimensiunilor produsului PCR obținute în urma rezoluției prin electroforeză în gel sau a variației secvenței produsului PCR determinată fie prin secvențiere directă, fie prin utilizarea analizei fragmentelor de restricție în urma tăierii secvențelor PCR cu endonucleaze de restricție .hibridizarea fluorescenței in situ cu metoda acidului nucleic peptidic (PNA Fish) este o nouă tehnică de detectare care vizează secvențe specifice speciilor foarte conservate în ARNr abundent de C. albicans vii. Celulele individuale pot fi detectate direct fără a fi nevoie de amplificare . Această tehnică atinge o sensibilitate de 98,7-100%, cu o specificitate de 100%, permițând discriminarea C. albicans de C. dubliniensis similar fenotipic .

Tehnologia moleculară poate fi utilizată și pentru identificarea tulpinilor de specii de Candida, deși utilizarea tehnicilor precum electroforeza în gel cu câmp pulsat (PFGE), analiza ADN polimorfic amplificat aleatoriu (RAPD) și PCR de amplificare a secvenței repetate (REP) sunt în mare parte rezervate investigațiilor epidemiologice în cercetarea candidozei orale .

10. Concluzie

în ultimii ani s-a acordat un accent mai mare pentru identificarea fiabilă a speciilor de Candida din probele clinice umane. O reprezentare schematică pentru izolarea și identificarea candidală este prezentată în Figura 1. Deoarece Candida este microflora rezidentă, sunt necesare metode adecvate de izolare pentru a stabili prezența în gură împreună cu numărul lor. De asemenea, este important să se identifice tulpinile infectante de Candida, deoarece izolatele speciilor Candida diferă foarte mult, atât prin capacitatea lor de a provoca infecții, cât și prin susceptibilitatea lor la agenți antifungici. Sunt disponibile diverse tehnici fenotipice pentru identificarea Candidei izolate, inclusiv utilizarea testelor de cultură morfologică, a mediilor diferențiale de agar și a testelor de asimilare biochimică. Aceste metode sunt completate cu tehnici moleculare recente rezervate în mare parte investigațiilor epidemiologice.

Figura 1

Reprezentarea schematică a izolării și identificării speciilor de Candida din cavitatea bucală.