rezultă

ALDH1 în pancreasul embrionar și Adult.

pe baza studiilor anterioare care documentează niveluri ridicate de activitate enzimatică ALDH1 în progenitorii epiteliali neuronali, hematopoietici și mamari (17-19), am caracterizat tiparele temporale și spațiale ale expresiei proteinei ALDH1 în pancreasul embrionar și adult de șoarece (Fig. 1). Folosind e-cadherina ca marker al celulelor epiteliale pancreatice, am constatat că proteina ALDH1 este mai întâi detectabilă în epiteliul pancreatic în curs de dezvoltare pe E12.5 (Fig. 1A). În acest moment, expresia este limitată la vârfurile tubulilor ramificați, propuse recent pentru a reprezenta un domeniu progenitor multipotențial (20). Un model similar de exprimare a fost raportat anterior pentru transcrierile Aldh1a1 (21). Expresia în vârfurile tubulare (și nu în trunchiurile centrale) persistă prin E14.5 (Fig. 1 B și B’) și este ulterior reglat în jos în diferențierea celulelor acinare. În pancreasul adult, expresia ALDH1 epitelială este cel mai frecvent observată în celulele epiteliale ductale centroacinare și terminale (Fig. 1 C-E). Celulele care exprimă ALDH1 mezenchimale (e-cadherin-negative) au fost, de asemenea, detectate în jurul insulelor endocrine și acini exocrini (Fig. S1).

pentru a caracteriza în continuare expresia ALDH1 și activitatea enzimatică ALDH1 în celulele ductale terminale adulte/centroacinare, am utilizat preparate din unități periferice acinar-ductale proaspăt izolate din pancreasul exocrin de șoarece digerat de colagenază (22). Important, aceste unități periferice izolate acinar-ductale sunt semnificativ epuizate de elemente de canal și endocrine mari. Comparativ cu pancreasul total, unitățile acinare-ductale periferice au prezentat o depleție >de 400 de ori în transcrierile insulinei, evaluată prin RT-PCR (Fig. S2A). Când s-a efectuat analiza FACS pe unități acinare-ductale periferice recoltate de la șoareci transgenici Ins1:DsRed care exprimă proteine fluorescente roșii în celule XV, doar 3 din 10.000 de celule (0,03%) din acest preparat au fost pozitive pentru DsRed.

caracterizarea tridimensională suplimentară a expresiei proteinei ALDH1 a fost realizată folosind etichetarea fluorescentă integrală a unităților acinar-ductale periferice izolate. Proteina ALDH1 a fost localizată în combinație cu e-cadherin ca marker al celulelor epiteliale și fie cu aglutinină dolichos biflorus conjugată FITC (DBA), fie cu aglutinină de arahide conjugată FITC (PNA), markeri ai celulelor ductale și, respectiv, acinare. Imagistica multicanal a confirmat o localizare predominant centroacinară / ductală terminală a celulelor epiteliale care exprimă ALDH1 în pancreasul adult (Fig. S3). Celulele care exprimă ALDH1 au fost cel mai adesea interpuse între epiteliul ductal terminal și celulele acinare mai periferice. În plus, celulele epiteliale unice care exprimă ALDH1 au fost, de asemenea, observate imediat adiacente epiteliului ductal terminal (Fig. S3 A și B). Au fost identificate atât celule ALDH1-pozitive DBA-pozitive, cât și DBA-negative, în timp ce celulele PNA-pozitive ALDH1-pozitive au fost identificate doar rar.

izolarea celulelor ductale Centroacinare și terminale care exprimă ALDH1.

în speranța izolării celulelor care exprimă ALDH1 din pancreasul șoarecilor adulți, am profitat de un substrat fluorogen cunoscut sub numele de „Aldefluor” (StemCell Technologies), care a fost utilizat anterior în izolarea pe bază de FACS a celulelor stem epiteliale hematopoietice, neuronale și mamare (17-19). Înainte de a încerca izolarea pe bază de FACS a celulelor epiteliale pancreatice care exprimă ALDH1, am aplicat mai întâi acest reactiv pentru a vizualiza celulele vii care exprimă ALDH1 în unități acinare-ductale periferice (Fig. 2). Așa cum se arată în Fig. 2 E și F, aceste studii au confirmat localizarea centroacinară / ductală terminală a celulelor Aldefluor-pozitive cu abundență scăzută în pancreasul șoarecilor adulți. Celulele ductale centroacinare/terminale Aldefluor pozitive s-au distins cu ușurință de celulele acinare adiacente datorită dimensiunii lor mici și lipsei granulelor de zymogen. Exemple suplimentare de imagistică cu celule vii utilizând reactivul Aldefluor sunt furnizate în Fig. S4. Aceste constatări au sugerat că imunofluorescența anti-ALDH1 și Citofluorescența pe bază de Aldefluor au etichetat o populație ductală centroacinară/terminală similară și au sugerat în continuare că aceste celule ar putea fi izolate cu succes de FACS.

am urmărit apoi caracterizarea și sortarea pe bază de FACS a celulelor unice disociate de unitățile acinar-ductale periferice. Ca mijloc inițial de stabilire a închiderii specifice a celulelor care exprimă ALDH1, am utilizat un inhibitor farmacologic al activității enzimatice ALDH1 (DEAB). Așa cum este descris în Fig. 2 A–D, această strategie a permis izolarea unei populații de celule cu abundență redusă caracterizată prin niveluri ridicate de activitate enzimatică ALDH1 sensibilă la DEAB, cuprinzând 0,9% 0.2% din toate celulele sortate din pancreasul șoarecilor adulți. Folosind un anticorp E-cadherin pentru a identifica simultan celulele epiteliale, s-a constatat că celulele Aldefluor (+) e-cadherin (+) reprezintă 0,5% 0,13% din toate celulele sortate din pancreasul șoarecilor adulți (Fig. 2D).

folosind RT-PCR cantitativ pentru a compara populațiile Aldefluor-pozitive, e-cadherin-pozitive (A+E+), Aldefluor-negative, e-cadherin-pozitive (A−E+), Aldefluor-pozitive, e-cadherin-negative (A+E−) și Aldefluor-negative, e-cadherin-negative (A−E−) izolate din pancreasul șoarecilor adulți, am constatat că populația A+E+ este semnificativ îmbogățită pentru codificarea transcrierilor aldh1a1 și aldh1a7 și epuizate de transcrieri pentru alte două izoforme aldh1, aldh1a2 și Aldh1a3 (Fig. 3G). Aldh8a1 nu a fost detectat în niciuna dintre probe. Comparativ cu populația A−E+, celulele A+E+ au fost epuizate modest de transcrieri pentru Pdx1 (P < 0,09), amilază (P < 0,001) și Citokeratină-19 (P < 0,01) (markeri exprimați în celule diferențiate, celule acinare și, respectiv, celule ductale). În schimb, celulele A+E + au fost caracterizate prin expresia La nivel înalt a Ptf1a, în ciuda faptului că au fost epuizate atât de transcrieri de amilază, cât și de proteine de amilază (Fig. 3G și Fig. S5). În plus, aceste celule au fost îmbogățite pentru Transcrieri care codifică Sca-1, SDF1, c-Met, Nestin, Sox9, Hey1 și Hey2, markeri asociați anterior cu populațiile progenitoare din pancreas și alte țesuturi. Folosind etichetarea imunofluorescentă pe preparatele de citospină ale celulelor sortate FACS, am confirmat îmbogățirea marcată a proteinelor ALDH1 și Sox9 și epuizarea amilazei în celulele A+E+ (Fig. S5). În plus, am efectuat, de asemenea, analize FACS pentru a determina frecvența cu care celulele Aldefluor (+) au fost, de asemenea, pozitive pentru markerii celulelor stem, cum ar fi proteina CD133 și SCA-1, și am observat că peste 90% din celulele Aldefluor (+) au coexprimat în plus ambii markeri ai celulelor stem. În schimb, doar 0,11% din celulele Aldefluor (+) au fost, de asemenea, pozitive pentru markerul endotelial vascular PECAM, în timp ce 0,08% au fost pozitive pentru markerul hematopoietic CD45. Când s-a efectuat analiza FACS pe unități acinare-ductale periferice recoltate de la șoareci transgenici Ins1-DsRed care exprimă proteine fluorescente roșii în celule de tip VIII, toate celulele Aldefluor (+) s-au dovedit a fi negative pentru dsRed.

testul Pancreatosferei funcției progenitoare Endocrine și Exocrine.

ca ecran inițial pentru activitatea progenitoare, am testat celulele Aldefluor (+) și Aldefluor (-) pentru capacitatea de a forma pancreatosfere (Fig. 3), similar cu testul de neurosferă utilizat în mod obișnuit pentru identificarea progenitorilor neuronali (23). În aceste teste, celulele ductale centroacinare/terminale A+E+ au fost capabile în mod unic să formeze sfere în cultura suspensiei. Celulele A+E + au afișat o eficiență de formare a sferei>de 100 de ori mai mare decât omologii lor a−e+ (Fig. 3 A și B și tabelul S1). Cu eficiență mai mică, celulele unice A+E + au fost chiar capabile să formeze sfere atunci când sunt placate la densitate clonală (o celulă pe godeu) în plăci cu 96 de puțuri (tabelul S1). Niciuna dintre populațiile e-cadherin-negative nu a prezentat o capacitate semnificativă de formare a sferei. Când sunt cultivate pe o perioadă de 5 până la 7 zile, pancreatosferele derivate din celulele A+E+ au prezentat o expresie puternică a e-cadherinei (Fig. 3C), confirmând identitatea lor epitelială, iar celulele individuale din sfere au început să acumuleze cantități considerabile de amilază sau insulină și insulină C-peptidă (Fig. 3 D și E). La 5 zile, 50% din pancreatosfere au prezentat expresia amilazei, în timp ce aproximativ 30% au prezentat imunoreactivitate la peptida C a insulinei. Sferele individuale au fost în general pozitive fie pentru insulină, fie pentru amilază, dar nu pentru ambele. Subseturile mici de celule din sfere au menținut expresia ALDH1 în perioada culturii și au demonstrat, de asemenea, expresia nucleară a proteinei Sox9 (Fig. 3 F și G), sugerând posibila întreținere a unui bazin de progenitori cu auto-reînnoire. Această capacitate aparentă de auto-reînnoire a fost susținută în continuare de faptul că pancreatosferele generate de celulele ductale Centroacinare/terminale Aldefluor (+) ar putea fi supuse disocierii enzimatice seriale, menținându-și capacitatea de formare a sferei pe minimum trei pasaje secvențiale la intervale de 7 zile. În plus, celulele din sfere au fost foarte proliferative, după cum s-a evaluat prin încorporarea peste noapte a EdU adăugată fie la începutul, fie la sfârșitul perioadei de cultură (Fig. 3H).

pe baza capacităților progenitoare distincte afișate de celulele A+E+, am examinat în continuare populațiile de celule sortate pentru exprimarea Ngn3, un marker al celulelor progenitoare endocrine (Fig. S2B). În concordanță cu studiile anterioare (7), nu am putut detecta expresia semnificativă a Ngn3 nici în pancreasul adult total, nici în oricare dintre populațiile de celule proaspăt sortate. Cu toate acestea, odată ce celulele A+E+ au fost plasate în cultură, au început să genereze Expresie detectabilă a Ngn3 imediat înainte de debutul expresiei insulinei, confirmând în continuare capacitatea progenitoare endocrină a celulelor epiteliale centroacinare și ductale terminale care exprimă ALDH1.

Pancreatosferele derivate din celulele ductale / Centroacinare terminale Aldefluor (+) prezintă secreție de insulină receptivă la glucoză.

detectarea celulelor care exprimă insulina și peptida C a insulinei în pancreatosfere cultivate a determinat evaluarea dacă aceste celule au fost capabile de secreție de insulină receptivă la glucoză, o caracteristică a celulelor funcționale de tip implant. Ca un control pozitiv, am folosit celule Ins-1 (clona 832/13) o linie de celule imortalizate de tip imortalizat utilizate în mod obișnuit pentru studiile secreției de insulină ca răspuns la concentrațiile fiziologice de glucoză. După incubarea peste noapte fie a pancreatosferelor, fie a celulelor Ins-1 în glucoză 0, 5 și 11 mM, atât supernatanții mediilor de cultură, cât și lizații celulari au fost recoltați și testați pentru peptida C a insulinei secretate și celulare, utilizând un test pe bază de ELISA. Pancreatosfere derivate din celulele ductale Centroacinare/terminale Aldefluor (+) secretate C-peptidă într-o manieră dependentă de glucoză, cu sensibilitate la glucoză similară cu cea afișată de celulele Ins-1 (Fig. 3I).

Aldefluor (+) celulele ductale / Centroacinare terminale adulte pot contribui la liniile endocrine și Exocrine embrionare.

ca un test și mai strict pentru activitatea progenitorului pancreatic, am microinjectat celule Aldefluor (+) și Aldefluor (–) izolate în muguri pancreatici dorsali microdisectați izolați din embrioni de șoarece E12.5 și am testat capacitatea de a contribui productiv la dezvoltarea descendențelor endocrine și exocrine (Fig. 4). Această abordare a fost utilizată recent pentru a documenta activitatea progenitoare pentru celulele care exprimă Ngn3 care apar în urma ligării ductului pancreatic (7). Pentru a urmări linia celulelor donatoare derivate din adulți și a le distinge de omologii lor derivați din embrioni, am izolat celulele Aldefluor (+) și Aldefluor (-) din pancreasul șoarecilor care poartă un pCAG omniprezent exprimat:mcherry transgene, așa cum este descris schematic în Fig. 4A (pCAG:șoarecii mCherry au fost furnizați cu amabilitate de Michael Wolfgang, Universitatea Johns Hopkins). În comparație cu celulele Aldefluor ( – ), celulele Aldefluor (+) au avut un potențial crescut dramatic de a contribui la apariția liniilor endocrine în interiorul mugurilor dorsali maturi, așa cum s-a demonstrat prin coexpresia mCherry cu oricare dintre peptidele C (Fig. 4 B–E) sau glucagon (Fig. 4 F-I). Folosind etichetarea e-cadherinei suprapuse pentru a permite numărarea celulelor individuale mCherry-pozitive, am evaluat cantitativ capacitatea celulelor Aldefluor (+) și Aldefluor (−) adulte de a intra în linii embrionare. Șapte zile după microinjecția celulelor Aldefluor (+) în E12.5 muguri dorsali, expresia glucagonului a fost observată la 11,7% din celulele reziduale mcherry pozitive, cu expresia insulinei C-peptide observată la încă 11,6% (Fig. 5N). În schimb, 2,4% din celulele reziduale de Aldefluor (-) pozitive mCherry au exprimat glucagon și doar 0,2% au exprimat peptida C a insulinei. Interesant este că populațiile Aldefluor ( + ) și Aldefluor ( – ) au prezentat abilități echivalente de a intra în linii epiteliale nonendocrine, reflectând probabil faptul că majoritatea populației Aldefluor ( – ) era formată din celule acinare deja diferențiate. Frecvențe similare ale pozitivității E-cadherinei, amilazei și PNA au fost observate în celulele reziduale mcherry-pozitive derivate fie din populațiile Aldefluor ( + ), fie Aldefluor ( – ) (Fig. 4 J-N).

Expansion of ALDH1-Expressing Centroacinar and Terminal Duct Cells Following Chronic Epithelial Injury.

pentru a evalua comportamentul in vivo al celulelor centroacinare și ductale terminale care exprimă ALDH1, am evaluat modelele de exprimare a ALDH1 în stabilirea inflamației cronice și a metaplaziei regenerative induse prin administrarea secvențială a caeruleinei în doze mici. După cum s-a raportat anterior (15), tratamentul șoarecilor adulți cu trei injecții de caeruleină (50 hectoxg/kg) pe săptămână timp de 3 săptămâni consecutive a indus o stare de pancreatită cronică urmată de regenerare și reparare aproape completă. Acest proces se caracterizează prin infiltrate inflamatorii, expansiune stromală și formarea complexelor tubulare metaplastice regenerative, care includ complexe tubulare de tip 1 care s-au dovedit anterior a fi derivate din celule acinare și complexe tubulare de tip 2 (TC2), care s-au dovedit anterior a fi derivate nonacinare și care apar probabil din celulele canalului terminal proliferativ (15). Spre deosebire de abundența relativ scăzută a ductului terminal care exprimă ALDH1 și a celulelor centroacinare observate în pancreasul adult normal (Fig. 5 A și B), conducta terminală care exprimă ALDH1 (Fig. 5 C și D) și centroacinar (Fig. 5 E și F) celulele au fost semnificativ extinse în stabilirea pancreatitei cronice induse de caeruleină. De remarcat, complexele tubulare de tip 2 au fost compuse predominant din celule care exprimă ALDH1 (Fig. 5H), în timp ce complexele tubulare de tip 1 nu au prezentat dovezi ale expresiei ALDH1 (Fig. 5G).