design de studiu

studiu VX-765: WT injectat cu vehicul în vârstă de cinci luni (WT + vehicul; n = 18) și șoareci J20 (J20 + vehicul: n = 14) și VX-765-injectat șoarecii (J20 + VX-765: n = 13) șoarecii au fost evaluați longitudinal în cinci momente diferite de timp: valoarea inițială înainte de tratament (valoarea inițială netratată J20 a fost grupată împreună; n = 19), După trei injecții IP pe săptămână de VX-765 sau vehicul (Tratamentul 1), după șase injecții suplimentare pe parcursul a 2 săptămâni (tratamentul 2), după o perioadă de spălare de 4 săptămâni (WO) și după alte trei injecții în 1 săptămână (tratamentul 3) (Fig. 1a). Toate animalele testate au fost incluse în analize, cu excepția cazului în care (a) animalul a murit în timpul experimentului sau (b) animalul nu a răspuns comportamental. Au fost utilizate în total 25 de litri, repartizate pe patru cohorte diferite și testate în momente diferite. Trei dintre aceste cohorte au fost supuse testelor NOR și open field, în timp ce cohorta 4 a fost utilizată pentru Barnes maze. După ce animalele au fost testate inițial pentru a confirma că animalele J20 aveau deficit comportamental, animalele J20 au fost repartizate aleatoriu fie la tratamentul vehiculului, fie la tratamentul cu VX-765, independent de performanța comportamentală. Dintre toate animalele utilizate, patru șoareci J20 nu au prezentat deficiențe comportamentale la începutul experimentului și nu au fost utilizați. Doi șoareci de vehicule J20 + nu s-au mișcat deloc în timpul experimentului și datele lor comportamentale au fost excluse; cu toate acestea, aceste animale au fost păstrate și au fost încă folosite pentru analiza post-mortem.

studiu de validare Casp1: pentru a valida efectele specifice Casp1 ale VX-765, șoarecii J20 au fost generați pe un fond Casp1 -/−. S-au folosit șaptezeci și trei de șoareci (n = 12-13 pe genotip, șase genotipuri diferite), toate fiind crescute prin fertilizare in vitro (FIV) de la 35 de femele donatoare. Detaliile privind reproducerea sunt descrise în secțiunea Studii pe animale de mai jos. Toți șoarecii au fost evaluați comportamental între 7 și 8 luni și niciun animal nu a fost exclus din acest studiu.

toți șoarecii au fost sacrificați și procesați la vârsta de 8 luni. Scorul comportamental a fost orbit de genotipul și tratamentul șoarecilor, iar toate animalele au fost repartizate aleatoriu pentru analize biochimice sau histologice și analizate orbește.

VX-765, VRT-043198 teste IC50 pe caspaze recombinante

studii pe animale

toate procedurile pe animale au urmat liniile directoare ale Consiliului Canadian pentru îngrijirea animalelor și au fost aprobate de Comitetul pentru îngrijirea animalelor al Universității McGill. Linia de șoarece transgenică J20 (stocul JAX nr. 006293, Jackson Laboratories, Bar Harbor, pe mine, Statele Unite ale Americii) exprimă Suedeză (670/671KM NL) și Indiana (717V F) mutatii app umane în cadrul PDGF-colospromoter. Șoarecii masculi J20 au fost folosiți ca crescători, iar sperma lor a fost utilizată pentru extinderea coloniei FIV.

genotipurile au fost determinate prin biopsie de coadă și RT-PCR. Șoarecii au fost adăpostiți în grup (2-4 animale pe cușcă) în cuști standard macrolon sub un ciclu invers de lumină/întuneric de 12 ore și condiții de mediu controlate. Hrana și apa erau disponibile ad libitum.VX – 765 (Adooq Bioscience, Irvine, CA) a fost dizolvat în 20% cremophor în dH2O (Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada) și administrat intraperitoneal. Șoarecii J20 și WT tratați cu vehicule au primit numai cremophor.

analiza permeabilității barierei hematoencefalice

șoarecii J20 și WT de cinci luni au fost anesteziați cu izofluran și artera carotidă dreaptă a fost separată. O mică incizie a fost făcută de-a lungul peretelui carotidei și un micro-cateter a fost introdus în intrarea arterei carotide interne. Cateterul a fost fixat pe loc folosind fir de sutură. VX – 765 (50 mg kg−1) a fost perfuzat la 50 XlX min−1 (90-120 XlX volum total). Micro-cateterul a fost lăsat încă 5 minute pentru a permite difuzia, după care sângele a fost colectat prin puncție intra-cardiacă. Șoarecele a fost perfuzat transcardial cu soluție salină rece ca gheața, iar hipocampul și cortexul au fost disecate. Probele au fost trimise la platforma de Biofarmacie (Universit Irak De Montreal) pentru cromatografie lichidă și analiza spectrometriei de masă tandem.

analiza comportamentală

câmp deschis: activitatea locomotorie a fost măsurată cu ajutorul unui sistem automat de urmărire HVS2100 (hvs Image, Hamptom, MAREA BRITANIE). Șoarecii au fost plasați în camera de câmp deschis (40 cutie de plexiglas de 40 cm, fără tavan și podea albă) și au fost lăsați să exploreze timp de 5 min.

recunoașterea obiectelor noi (NOR): șoarecii au fost pre-expuși la două obiecte identice în camera de câmp deschis timp de 5 minute. La două ore după pre-expunere, șoarecii au fost plasați înapoi în cameră și expuși la un obiect familiar și la un obiect nou timp de 5 minute. Șoarecii au fost expuși la un obiect specific o singură dată în diferite sesiuni de testare, iar plasarea obiectelor noi a fost contrabalansată în cadrul fiecărui grup de tratament. Au fost evaluate atingerile procentuale ale obiectului nou în timpul fazei de testare și indicele de discriminare ((# touches novel − # touches familiar)/atingeri totale).

Barnes maze: platforma Barnes maze (cu diametrul de 91 cm, ridicată la 90 cm de podea) a constat din 20 de găuri (fiecare cu diametrul de 5 cm). Toate găurile au fost blocate, cu excepția unei găuri țintă care a dus la o cutie de evacuare încastrată. Indicii spațiale, lumina strălucitoare și zgomotul alb au fost folosite pentru a motiva șoarecii să găsească evadarea în timpul fiecărei sesiuni. Pentru faza de adaptare, fiecare șoarece a explorat platforma timp de 60 s. orice șoarece care nu a găsit cutia de evacuare a fost ghidat către ea și a rămas acolo timp de 90 s. pentru faza de achiziție, fiecare proces a urmat același protocol, cu scopul de a instrui fiecare șoarece să găsească ținta și să intre în caseta de evacuare în decurs de 180 s. șoarecii au rămas în cutie pentru încă 60 s. patru încercări pe zi, la aproximativ 15 minute distanță, au fost efectuate timp de 4 zile consecutive. În testul sondei (ZIUA 5), fiecare șoarece a efectuat un studiu de 90 de secunde. Ținta era încă localizată în aceeași poziție, dar cutia de evacuare a fost blocată. S-au măsurat latența și erorile pentru atingerea țintei, plus numărul de lovituri de șoarece la fiecare dintre găuri (preferința țintă). Labirintul Y a fost compus dintr-un labirint simetric în formă de Y, cu trei brațe la 120 de milimetri unul de celălalt, desemnate A, B și C. animalele au fost plasate la capătul distal al brațului A și li s-a permis să exploreze labirintul timp de 5 minute. Au fost înregistrate intrările totale ale brațului și alternanța spontană, definite ca intrări consecutive în trei brațe diferite. A fost determinată alternanța procentuală.

prelucrarea țesuturilor

pentru imunohistochimie, șoarecii (n = 4-6 pe grup) au fost anesteziați cu izofluoran și perfuzați transcardial cu soluție salină rece ca gheața urmată de paraformaldehidă 4% rece ca gheața (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, SUA) în soluție salină tamponată cu fosfat de 0,1 m. Creierele au fost Post-fixate în formalină tamponată neutră 10% (Thermo Fisher Scientific, Mississauga, ON, Canada) timp de 16 ore și transferate în etanol 70%. Creierele au fost implantate cu parafină și secționate la 4 centimetri.

pentru western blot și ELISA (n = 4-8 pe grup), șoarecii anesteziați au fost dislocați cervic, hipocampul și cortexul au fost disecate și imediat înghețate pe gheață uscată. Proteinele au fost extrase în volum/greutate de 5 hectolitri cu tampon de testare radioimunoprecipitare (RIPA) (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1% NP-40, 150 mM Naci, 0,25% Na-deoxicolat, 1 mm EDTA, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 1 mm PMSF, 10 ilft ml−1 de Cocktail inhibitori de proteaze (Sigma-Aldrich)) pe gheață cu un omogenizator de țesut (OMNI International, Kennesaw, GA, SUA). Probele au fost centrifugate (20.000 centi g, 4 centi C) timp de 20 min, supernatantul recuperat și proteina cuantificată prin metoda BCA. Peleta insolubilă RIPA a fost extrasă în continuare în acid formic 70% în dH2O, evaporată și resolubilizată în Tris-HCl de 200 mM, pH 7,5.

colorarea Imunohistologică

epitopii au fost demascați fie în citrat (10 mm citrat Tris-Na, pH 6,0), fie în EDTA (10 mM bază Tris, 1 mm EDTA, 0,05% între-20, pH 9.0) tampon de recuperare a antigenului și imunosteinizat folosind Dako Autostainer plus Procesor automat de diapozitive și sistem EnVision Flex (Dako, Burlington, ON, Canada). În urma deparafinizării și rehidratării, secțiunile au fost tratate cu peroxidază, blocate în blocul proteic fără ser și imunosteinizate cu următorii anticorpi diluați în diluantul de anticorpi EnVision Flex: 1:2000 rabbit anti-Iba1 (Wako 019-19741, Richmond, VA, SUA), 1:8000 rabbit anti-GFAP (Dako Z-0334), 1:2000 rabbit anti-A 1:1000 antisinaptofizină de șoarece (Sigma-Aldrich s5768). Secțiunile au fost tratate cu anticorpul secundar conjugat de șoarece sau iepure adecvat furnizat de kit și vizualizate cu DAB. Secțiunile au fost hematoxilina contracarată, deshidratată și acoperită cu Permount (Fisher Scientific). Secțiunile au fost scanate digital cu MIRAX SCAN pentru analiză (Zeiss, Don Mills, ON, Canada). După deparafinizare și rehidratare, diapozitivele au fost colorate cu tioflavină apoasă 1% filtrată (Sigma-Aldrich).

analiza Imunohistologică cantitativă

celulele Iba1-pozitive din cortex și porțiunea anterioară a regiunii CA1 a hipocampului au fost cuantificate folosind o versiune modificată a cadrului de numărare areală48. Pe scurt, fiecare al cincilea diapozitiv a fost cuantificat (rezultând patru secțiuni pe creier). Au fost realizate mai multe imagini cu 80 de imagini cu MIRAX în zona de interes și numărul de celule Iba1-pozitive a fost numărat manual. A fost estimată densitatea numerică (numărul de celule mm−3) în regiunea anterioară CA1 și cortex. Un număr minim de 150 de accesări pe zonă au fost necesare pentru a face o estimare fiabilă. Secțiuni suplimentare au fost numărate dacă nu am reușit să atingem numărul nostru minim. Cuantificarea a fost efectuată orb pentru tratament și genotip. Software-ul ImageJ (NIH, Bethesda, MD, SUA) a fost utilizat pentru a măsura o acumulare de centimi, GFAP și colorare imunopozitivă a sinaptofizinei în regiunea CA1 și cortex. Au fost analizate patru secțiuni pe creier și au fost luate mai multe imagini în fiecare secțiune pentru a acoperi regiunea CA1 și cortexul. Pragul a fost ajustat în mod egal în toate creierele pentru a evidenția zona colorată, iar particulele au fost analizate pentru a determina suprafața totală de colorare. Rezultatele sunt exprimate ca suprafață totală colorată pentru fiecare suprafață totală analizată (inqutm2 mm−2). Imaginile reprezentative au fost decupate doar pentru a se conforma constrângerilor de dimensiune și nu au suferit nicio post-procesare.

Western blotting

s-au preparat probe de proteine de șoarece (25-100 hectolitri) în Laemmli (5% 2-hectolitri−mercaptoetanol, 1 mm Na3VO4, 1 mm NaF, 1 mm PMSF, 10 hectolitri ml-1 de Cocktail inhibitori de proteaze (Sigma-Aldrich)), fierte timp de 5 minute și separate prin electroforeză în gel de poliacrilamidă (PAGE). Probele au fost probate cu următorii anticorpi primari, diluați fie în lapte uscat 5% degresat în soluție salină tamponată Tris și 0,1% tampon de blocare Tween-20 sau PBS (Termoscientific): 1:1000 mouse anti-human a Inqu1-16 (6E10) (BioLegend 803001, San Diego, CA, SUA), 1:2000 rabbit anti-APP c-terminus (Sigma-Aldrich A8717), 1:1000 Rabbit anti-neprilysin (Abcam ab79423), 1:500 rabbit anti-IDE (Abcam ab32216), 1:1000 rabbit Anti-Caspase-3 (semnalizare celulară 9665), 1:1000 mouse Antiactiv Caspase-8 (semnalizare celulară 8592), 1:1000 rabbit anti-Caspase-3 caspase-9 (celula de semnalizare 9504), și 1:5000 mouse-ul anti-actină (Sigma-Aldrich a5441). Bloturile au fost detectate cu anticorp secundar 1:5000 legat de HRP (GE Amersham NA9310, Montreal, QC, CA) sau 1: 5000 anti-iepure (Dako P0217) urmat de ECL (GE Amersham). Benzile imunoreactive au fost vizualizate folosind sistemul ImageQuant LAS 4000 (Fujifilm SUA, Valhalla, NY, SUA), iar analizele densitometrice au fost efectuate cu software-ul de analiză Image Gauge (Fujifilm SUA). Luminozitatea / contrastul bloturilor brute au fost ajustate în mod egal pe întreaga imagine cu software-ul Adobe Photoshop CS5 (Adobe Systems, Ottawa, ON, CA) pentru a genera imagini reprezentative. Nu a fost făcută nicio modificare suplimentară. Software-ul CanvasTM X (Acd system, Plantation, FL, SUA) a fost folosit pentru a crea cifre finale. Raw blots pentru western blots sunt disponibile în figura suplimentară 11.

ELISA

citokine pro – și anti-inflamatorii, precum și un nivel de un sfert din creier de șoarece au fost determinate folosind kituri de testare imun electrochimiluminiscență de la Meso Scale Discovery (Rockville, MD, SUA). Standardele și eșantioanele au fost pregătite în conformitate cu protocoalele producătorului și au fost rulate în dublu exemplar. Panoul proinflamator al mouse-ului ten-plex a fost utilizat pentru hipocampul mouse-ului și cortical și probe. Pentru măsurarea plasmei de șoarece s-a folosit un singur kit IL-1 de la IL-1. Panoul proinflamator uman cu patru plex a fost utilizat pentru probele HPN (vezi mai jos). Setul uman cu patru panouri, un set 6e10, a fost folosit pentru hipocampul și cortexul mouse-ului și pentru probele HPN.

extracția ARN și sinteza ADNc

ARN-ul Total a fost extras din hipocampul și cortexul șoarecelui (n = 3 pe grup) cu Qiazol (Qiagen, Valencia, CA, SUA) urmată de omogenizare cu un ac de calibru 20. Mini kitul miRNeasy, inclusiv etapa de tratament cu Dnază pe coloană, a fost utilizat pentru purificarea ARN-ului total (Qiagen). Calitatea și cantitatea ARN au fost determinate folosind un spectrofotometru (DS-11 FX+, DeNovix, Wilmington, DE, SUA). Five hundred nanograms of total RNA was reverse transcribed for each sample (with avian myeloblastosis reverse transcriptase (AMV-RT)) (Roche, Mannheim, Germany).

PCR and real-time PCR

HAPP transgene PCR amplification was performed using Taq DNA polymerase (New England Biolabs, Whitby, ON, Canada) using the following primers: (hAPP) 5′-AACACAGAAAACGAAGTT-3′ and 5′-CCGATGGGTAGTGAAGCA-3′ (480-bp amplicon)31, (Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase, HPRT) 5′-GTAATGATCAGTCAACGGGGGAC-3′ and 5′-CCAGCAAGCTTGCAACCTTAACCA-3′ (177-pb amplicon) (Carcinogenesis). Produsele au fost vizualizate pe geluri de agaroză 2% colorate RedSafe (FroggaBio, North York, ON, Canada). Experimentele PCR în timp Real au fost efectuate cu SYBR Green Taq Mastermix (Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD, SUA) pe o mașină aplicată Biosystems 7500 Fast real-Time PCR system (Applied Biosystems, Foster City, CA, SUA). Amplificarea genelor a fost efectuată cu următorii primeri: (18s) 5 ‘- GTAACCCGTTGAACCCCAT-3’ și 5 ‘- CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3’; (IDE) 5 ‘- ACTAACCTGGTGGTGAAG-3 ‘și 5′ – GGTCTGGTATGGGAAATG-3′; (Neprilysin) 5′-TCTTGTAAGCAGCCTCAGCC – 3′ și 5′-CTCCCCACAGCATTCTCCAT-3’. Rezultatele sunt exprimate ca valori de inducție ori normalizate la genele de referință medii HPRT și 18S folosind metoda Pfaffl.

plasticitatea sinaptică a mouse-ului RT2-Profiler PCR array

plasticitatea sinaptică a mouse-ului RT2 Profiler PCR Array (PAMM-126z, Qiagen) profilează expresia a 84 de gene implicate în modificările sinaptice în timpul învățării și memoriei și cinci gene de menaj (; Proteina de șoc termic 90 alfa (citosolic), Hsp90ab1) cu PCR în timp real. ARN-ul Total (465 ng pentru fiecare probă) a fost transcris invers (care a inclus o etapă de eliminare a ADN-ului genomic) urmând protocolul producătorului (Trusa de sinteză a ADNc în prima catenă, Qiagen). Reacția PCR în timp real a fost efectuată într-un ciclor în timp real ABI 7500 (bloc rapid) (biosisteme aplicate) folosind mixul master PCR RT2 SYBR Green/ROX (Qiagen). Condițiile de ciclism au fost următoarele: 2 min la 50 XCT, 10 min la 95 XCT, 40 cicluri, 15 s fiecare la 95 XCT și 1 min la 60 XCT. Pragul și linia de bază au fost stabilite manual conform instrucțiunilor producătorului. Datele au fost normalizate la media geometrică a celor cinci gene de menaj și analizate prin metoda Ct comparativă (2-CENTICTCT).

cultura celulelor neuronale și testul degenerării axonale

țesutul cortical fetal vechi de douăsprezece până la șaisprezece săptămâni au fost obținute de la laboratorul de cercetare a defectelor congenitale (Universitatea din Washington, Seattle, SUA) în conformitate cu un protocol aprobat de Consiliul de revizuire instituțională McGill. HPN au fost cultivate din creiere care au fost disociate cu tripsina, tratate cu deoxiribonucleaza I, și filtrate prin 130, 70 și 30 nylon mesh21. Celulele disociate au fost centrifugate timp de 10 min la 300 centi g și omogenizate în mediu esențial minimal (mem) cu săruri Earle și suplimentate cu 5% BCS decompletate, 1 centi penicilină-streptomicină, 1 mM piruvat de sodiu și 2 mM L-glutamină (Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA). Celulele au fost însămânțate la o densitate de 3 celule 106 ml−1 pe 5 plăci de cultură tisulară cu șase godeuri acoperite cu poli−L-lizină (Sigma-Aldrich), cu 5 ml-1. Mediul MEM a fost schimbat la fiecare 2 zile, iar proliferarea astrocitelor a fost limitată cu tratament antimitotic fluorodeoxiuridince (FdU) (1 mM, Sigma) în primele 4 zile. Culturile neuronale au fost cultivate cu 7-10 zile înainte de efectuarea experimentelor. Au fost testate patru preparate neuronale diferite la momente diferite. Unul dintre preparatele neuronale nu a fost stabil și cultura, inclusiv serul + control care nu a primit niciun medicament, a murit în mijlocul experimentului. Prin urmare, au fost utilizate trei preparate neuronale diferite de la trei donatori genetic diferiți.

toxicitatea VX-765 a fost evaluată cu bromură de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazoliu (MTT). Neuronii au fost tratați cu 25-200 MMV VX-765 sau 0,1% DMSO (cea mai mare concentrație de DMSO utilizată) timp de 72 ore. neuronii au fost apoi incubați cu 0,5 MMV ml−1 MTT (Sigma-Aldrich) timp de 4 ore la 37 mmvc (5% CO2). Cristalele de formazan au fost dizolvate în 100 ilqql DMSO timp de 30 min. Absorbanța a fost măsurată la 560 și 670 nm folosind cititorul de plăci Synergy H4.

degenerarea axonală a fost indusă fie prin transfecția APPWT, fie prin stresul de deprivare serică. VX – 765 a fost administrat fie ca strategie de pretratare (cu 1 oră înainte de stresor), fie ca strategie de tratament postbeading (48 ore după stresor). Neuronii au fost transfectați de Gene gun (BioRad, Mississauga, ON, Canada) cu margele de aur acoperite cu pBudCE41-eGFP pentru vizualizarea fluorescenței. Neuronii care au fost stresați de APPWT au fost transfectați cu pBudCE41-eGFP/APPWT. Pe scurt, neuronii au fost tratați cu mediu suplimentat cu 25 sau 50 de centimetrii VX-765, 5 centimetrii Casp1 inhibitor Z-YVAD-fmk sau DMSO. Imaginile fluorescente au fost realizate la fiecare 24 de ore (până la 72 de ore post-tratament) cu un microscop Nikon Eclipse Ti (Nikon, Mississauga, ON, CA) și o cameră Photometrics coolSNAP HQ2 CCD (Photometrics, Tucson, AZ, SUA) utilizând software-ul Nis Elements ar 3.10 (Nikon). Procentul neuronal beading a fost măsurat prin numărarea numărului de neuroni eGFP-pozitivi cu margele peste numărul total de neuroni eGFP-pozitivi la fiecare punct de timp. Un minim de 150 de neuroni egfp pozitivi au fost numărați pentru fiecare afecțiune. S−au prelevat probe de mediu condiționat (suplimentat cu 1 mm Na3VO4, 1 mM NaF, 1 mM PMSF, 10 ilft ml-1 Cocktail inhibitori de proteaze (Sigma-Aldrich)), iar neuronii au fost recoltați în tampon de liză celulară (50 mm HEPES, 0,1% CHAPS, 0,1 mm EDTA) pentru analiză.

analize statistice

numărul de animale sau experimente independente și analizele statistice utilizate (comparații ANOVA și post-hoc) sunt toate indicate în legendele figurii. Toate valorile sunt exprimate ca valoare medie a s.e.m., cu valorile F și p indicate în legendele figurii. Toate analizele statistice au fost efectuate cu ajutorul software-ului GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, La Jolla, CA, SUA).