rezumat

a fost elaborată o metodă directă și foarte specifică de chemiluminiscență imunosorbentă legată de enzime (CL-ELISA) pentru monitorizarea cloramfenicolului (CAP) în produse cosmetice. Anticorpul anti-cloramfenicol (mAb) adoptat în această lucrare pentru imunotestare directă s-ar putea lega în mod specific de CAP, cu reactivitate încrucișată neglijabilă (CR) (mai puțin de 0,01%) cu majoritatea analogilor CAP, inclusiv tiamfenicol (TAP) și florfenicol (FF) înrudite structural. Limita de detecție (LOD), măsurată prin IC10, a fost de 0,0021 ng mL−1. Intervalul de detecție (IC20-IC80) a fost cuprins între 0,00979 și 0,12026 ng mL−1. În probele de produse cosmetice cu vârf, recuperările medii au variat de la 82,7% la 99,6%, cu variații pe parcursul zilei și pe parcursul zilei mai mici de 9,8 și, respectiv, 8,2%. Mai mult, cu ajutorul MAB anti-CAP etichetat cu HRP, metoda ar putea fi procesată în modul de imunoreacție directă rapidă. Această metodă CL-ELISA ar putea fi aplicată pentru detectarea specifică, rapidă, semicantitativă și cantitativă a PAC în produsele cosmetice, facilitând controlul precis al calității contaminării cu PAC.

1. Introducere

cloramfenicolul (CAP) este un membru al familiei amfenicolului de agenți antibacterieni și au fost produși de streptococul venezuelean (structura prezentată în Figura 1) . Cloramfenicolul este de obicei efectuat ca un antibiotic cu spectru larg, cu activitate antimicrobiană eficientă. Poate fi, de obicei, împotriva unei varietăți răspândite de bacterii Gram-pozitive și Gram-negative, inclusiv organismele anaerobe . Datorită activității ridicate, cloramfenicolul este aplicat pe scară largă în industria zootehnică, acvicultură și cosmetică pentru prevenirea și tratamentul infecțiilor bacteriene. În publicațiile recente, cloramfenicolul a fost raportat a fi utilizat pentru tratamentul epifoliculitei, acneei și a altor afecțiuni ale pielii. Cloramfenicolul a fost, de asemenea, adoptat pe scară largă în produsele cosmetice ca antiseptic pentru a inhiba creșterea microorganismelor .

Figura 1

cu toate acestea, investigațiile recente au arătat că antibioticele amfenicol au prezentat efecte adverse potențiale asupra sănătății umane . Prin urmare, aplicațiile cloramfenicolului sunt interzise în multe țări, inclusiv în statele membre ale UE, SUA și China . Deși există reglementări oficiale pentru aceste antibiotice, cloramfenicolul este încă adăugat ilegal în produsele cosmetice, datorită costului redus și efectului antibacterian excelent. Pentru a asigura siguranța produselor cosmetice și pentru a menține sănătatea umană, este emergent să se dezvolte metode sensibile, fiabile și disponibile pentru detectarea cloramfenicolului la nivelurile de urmărire din probele cosmetice.

au fost raportate numeroase metode analitice pentru CAP și detectarea antibioticelor conexe, cum ar fi cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC) , cromatografia de gaze (GC) și cromatografia lichidă-spectrometria de masă tandem (LC-MS/MS) . Cu toate acestea, aceste metode necesită în principal instrumente scumpe, proceduri complicate de pretratare și personal bine instruit și nu au fost potrivite pentru screeningul rapid al unui număr mare de probe. Testele imunologice bazate în principal pe recunoașterea specifică anticorp-antigen au fost adoptate pentru screening-ul rapid și rapid al analiților țintă. Substratul Chemiluminescent cu caracter de sensibilitate ridicată ar putea fi utilizat într-o platformă de testare imunosorbentă legată de enzimă chemiluminescentă directă (CL-ELISA). Comparativ cu protocoalele colorimetrice convenționale, sensibilitatea imunotestelor ar putea fi îmbunătățită de cel puțin 2~3 ori cu chemiluminescent ca substrat.

literaturile anterioare despre detectarea IMUNOTESTĂRII CAP nu pot distinge CAP de analogii săi din familia amfenicolului (Figura 1), inclusiv tiamfenicol (TAP) și florfenicol (FF), din cauza anticorpilor specifici cu lățime mare . În aceste cercetări, este dificil să se determine dacă capacul de contaminare, analogii săi sau suma acestora atunci când un rezultat pozitiv. În această cercetare, am utilizat un anticorp monoclonal anti-CAP cu specific ridicat (mAb) care se poate lega de specificitatea CAP și de valorile CR neglijabile pentru majoritatea analogilor testați. Pe baza acestui mAb, a fost dezvoltată o metodă CL-ELISA foarte specifică și directă pentru determinarea cantităților de urme de capac în produsele cosmetice. Acest protocol dezvoltat nu are nevoie de reacție complexă de conjugare indirectă cu anticorp secundar marcat cu HRP. Cu substratul chemiluminescent, sensibilitatea ar putea fi îmbunătățită semnificativ (diagrama schematică prezentată în Figura 2). Cu utilizarea MAB anti-CAP marcat cu HRP, testul a fost efectuat în modul de imunoreacție directă rapidă fără proceduri complexe de imunoreacție. Această metodă CL-ELISA poate fi aplicată pentru detectarea specifică, rapidă, semicantitativă și cantitativă a PAC în produsele cosmetice, iar această lucrare va contribui la controlul și reglarea calității PAC.

Figura 2

2. Materiale și metode

2.1. Produse chimice și reactivi

cloramfenicol (CAP), ciprofloxacină (CIP), florfenicol, (FF), penicilină (stilou), ractopamină (RAC), salbutamol (SAL), sulfadiazină (SUL) și tiamfenicol (TAP) au fost achiziționate de la Sigma Aldrich (Puritate 99%, St.Louis, MO, SUA). Antigenul conjugat CAP și anticorpul cap marcat cu HRP au fost obținute de la ZeYang Co. (Beijing, China). Soluția de substrat de chemiluminescență supersignală a fost achiziționată de la Thermo Fisher (SUA). Sistemul de sinteză Milli-Q A fost obținut de la Millipore (Bedford, MA, SUA) pentru purificarea apei. Alți reactivi (grad analitic) au fost achiziționați de la Beijing Reagent corp. (Beijing, China).

2.2. Echipamente și instrumente

Costar alb opac 96-well plăci microtitter polistiren (Costar Inc., Milpitas, CA, SUA) au fost folosite în această lucrare. Cititorul de microplăci SpectraMax M5 a fost obținut de la dispozitive moleculare (CA, SUA). Centrifuga MIKRO 22R a fost obținută de la Hettich Laborapparat (Tuttlingen, Germania).

2.3. Tampoane și soluții

pentru acest test CL-ELISA dezvoltat, au fost pregătite diferite tampoane și soluții pentru imunotest.

soluție salină tampon fosfat (PBS, 0,01 M, pH 7,4): 8,0 g de NaCI, 2,9 g de Na2HPO4, 0,2 g de KH2PO4 și 0,2 g de KCl au fost dizolvate în 1 L de apă deionizată.tampon de blocare (pH 7,4): 0,5% cazeină în 0,01 M PBS.tampon de acoperire (pH 9,6): 1,59 g de Na2CO3 și 2,93 g de NaHCO3 au fost dizolvate în 1 L de apă deionizată.

tampon de diluare enzimatică (pH 7,4): 5% ser fetal bovin în 0,01 M PBS.tampon de spălare (pbst): 0,01% între-20 în 0,01 M PBS.

2.4. Procedura competitivă Chemiluminescentă Elisa (CL-ELISA)

au fost adoptate Plăci de microtitrare Costar alb opac cu 96 de puțuri de polistiren pentru reacția imunotest. 100 oqtl de antigen conjugat cu capac a fost dizolvat în tampon de acoperire la o concentrație finală la 0,00042 ng mL−1 care a fost adăugat și incubat la 4 OQC timp de 20 h pentru acoperire. După spălarea cu tampon de spălare timp de trei ori, s-a adăugat tampon de blocare (150 ect. pe godeu) în fiecare godeu și s-a incubat pentru a ocupa locurile active în exces la 37 ect.C timp de 1,5 h. plăcile acoperite au fost depozitate la 4 ect. c înainte de utilizare.

pentru analiza capacului, plăcile de microtitrare acoperite au fost precondiționate la temperatura camerei timp de 30 min. Apoi, la fiecare godeu s-au adăugat la rândul lor 30 unkticli de probe prelucrate sau standard CAP și 70 unkticli de anticorp anti-CAP marcat cu HRP (2,46 ng mL−1) diluat cu tampon de diluare enzimatică. Plăcile au fost incubate la 37 centimetric C timp de 30 min pentru reacție competitivă directă. După spălarea plăcii cu tampon de spălare de cinci ori, s-a adăugat o soluție de substrat de chemiluminescență Supersemnală (100 ilqql/godeu) și s-a măsurat intensitatea chemiluminiscenței fiecărui godeu cu ajutorul unui cititor de microplăci SpectraMax M5.

2.5. Curba Standard

zece niveluri de concentrație diferite au fost testate pentru evaluarea curbelor de calibrare. Cea mai mare concentrație a fost la 1000 ng mL−1, iar următoarele concentrații au fost diluate în serie cu o treime din cea anterioară. Fiecare concentrație a fost efectuată de trei ori conform protocolului CL-ELISA.

B / B0 este definit pentru raportul de chemiluminescență al rezultatelor. Aici, B reprezintă intensitatea chemiluminescenței concentrației standard diferite a capacului, iar B0 reprezintă intensitatea chemiluminescenței fără standardul capacului în fiecare test.

curbele Standard au fost evaluate prin trasarea B/B0 la diferite concentrații standard CAP și montarea datelor la următoarea ecuație logistică cu patru parametri folosind Origin (versiunea 7.5, OriginLab, Northampton, MA, SUA):în această ecuație, A reprezintă asimptota superioară (raportul de chemiluminescență B / B0 fără standardul CAP). B este panta curbei la punctul de inflexiune. C, reprezentând 50% din absorbanța maximă, este valoarea X la punctul de inflexiune. Și D este asimptota inferioară (semnal de fundal).

2.6. Pregătirea probelor pentru analiza CL-ELISA

probele cosmetice (2,00 g 0,02 g) au fost cântărite cu precizie și transferate în tuburi de centrifugă din polipropilenă de 50 mL. Apoi, s-au adăugat 20 mL de PBS și s-au vortexat timp de 30 s, apoi ultra-Sonicare timp de 3 minute pentru extragerea capacului. Fiecare probă a fost centrifugată la 12000 g timp de 10 min la 4 CTC, iar supernatantul a fost colectat și filtrat printr-o membrană de 0,22 CMC. Treizeci de microlitri alicote din supernatantul fiecărei probe au fost adăugate pe o placă acoperită cu 96 de puțuri pentru analiză în conformitate cu procedura CL-Elisa dezvoltată.

2.7. Precizia și precizia

probele cosmetice cu loțiune de grund negativ au fost confirmate anterior de analizele UPLC-MS / MS. Apoi, fiecare probă a fost ghimpată cu capac standard la trei concentrații diferite de 5, 20 și 100 ng L−1. Analiza a fost procesată în conformitate cu protocolul CL-ELISA dezvoltat cu cinci replici fiecare (n = 5). Concentrațiile probelor au fost calculate în funcție de curba de calibrare, iar precizia și precizia au fost evaluate pe baza recuperărilor tuturor probelor.

3. Rezultate și discuții

3.1. Specificitatea testului

specificitatea metodei a fost evaluată prin evaluarea gradului de reactivitate încrucișată (CR) cu compuși legați structural de CIP, FF, PEN, RAC, SAL, SUL și TAP. Valorile CR au fost evaluate cu următoarea ecuație:În această ecuație, IC50 este concentrația inhibitoare pe jumătate maximă a unei substanțe. Rezultatele specificității mAb anti-CAP au fost prezentate în tabelul 1. Din rezultate, s-au obținut valori neglijabile ale CR (mai puțin de 0,01%) pentru toți analogii investigați în această cercetare, inclusiv cele mai legate de TAP și FF. Se poate concluziona că acest test CL-ELISA dezvoltat ar putea fi aplicat pentru detectarea specifică a capacelor.

3.2. Optimizarea procedurii CL-ELISA

raportul antigen-anticorp într-un sistem de reacție competitiv influențează semnificativ imunoreacția. În acest protocol CL-ELISA, raportul antigen-anticorp a fost evaluat și optimizat. Raportul Antigen-anticorp al 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, și 30: 70 au fost investigate. Rezultatele au fost optimizate în conformitate cu IC50 și RLUmax (unități de lumină relativă maximă) și au fost prezentate în tabelul 2. Valoarea IC50 a crescut semnificativ odată cu creșterea raportului de anticorpi. Când raportul antigen-anticorp a fost de 70:30, s-a obținut cel mai sensibil rezultat cu cea mai mică valoare IC50. În plus, o proporție mare de anticorpi a condus la o valoare ridicată a RLUmax. Cu toate acestea, pentru raportul antigen-anticorp testat, toate valorile RLU au fost adecvate pentru detectarea PAC. Datorită sensibilității ridicate a substratului chemiluminescent, nu a existat nicio diferență aparentă a valorii RLUmax. In order to obtain the most optimized and sensitive result, an antigen to antibody ratio of 70:30 was adopted in this research.

3.3. Sensibilitatea

IC50, LOD (măsurată prin IC10) și intervalul de detecție (IC20−IC80) au fost obținute din curba de calibrare sigmoidală pentru a evalua sensibilitatea protocolului CL-ELISA propus (Figura 3). În această cercetare, LOD a fost de 0,0021 ng mL-1, în timp ce valoarea IC50 a fost de 0,016 ng mL−1 pentru CAP. Domeniul de detecție al acestei metode a fost de 0,00979−0,12026 ng mL−1. Comparativ cu imunotestele stabilite, această metodă a prezentat o sensibilitate mai mare și o LOD mai mică pentru CAP .

Figura 3

3.4. Precizia și precizia

pentru investigarea preciziei și preciziei, au fost calculate mai întâi recuperările de capac în probele fortificate. Iar precizia și precizia au fost evaluate cu cinci replici fiecare în trei zile de validare. La trei niveluri fortificate de 5, 20 și 100 ng L−1, recuperările medii pentru CAP în probele cosmetice cu loțiune de primer cu vârf au variat de la 82,7% la 99,6%. Variațiile Intraday și interday au fost mai mici de 9,8% și, respectiv, 8,2% (rezultatele au fost prezentate în tabelul 3).