utilizarea analogilor ATP prin CDK-uri proiectate

am generat CDK-uri ‘Shokat’ mutante care conțin schimburi de aminoacizi la un reziduu voluminos conservat în buzunarele lor de legare ATP. În cazul CDK2 și CDK3, aceasta a fost o schimbare fenilalanină-alanină în poziția 80, denumită CDK2 (F80A). De asemenea, am sintetizat 12 analogi ATP pentru a determina dacă CDK-urile proiectate pot utiliza acești analogi pentru a fosforila proteina retinoblastomului recombinant (Rb) in vitro și am constatat că au utilizat cel mai eficient N6-(2-feniletil)-ATP (PE-ATP) (figura 1a și datele nu sunt prezentate). Deși atât tipul sălbatic, cât și ciclina e-CDK2 (F80A) au folosit ATP normal pentru a fosforila proteina glutation-S-transferază (GST)-Rb, numai kinaza F80A ar putea folosi PE-ATP. Rezultate similare au fost obținute cu ciclina e-CDK3, dar în acest caz mutantul F80A nu mai putea utiliza ATP normal, deși baza structurală pentru această observație este neclară (figura 1a). Aceste studii au confirmat că kinazele de tip sălbatic și cele proiectate prezintă specificitățile ATP dorite.

în timp ce CDK-urile mutante au utilizat eficient PE-ATP pentru a fosforila Rb in vitro, experimente similare care utilizează pe-ATP marcat radioactiv în lizatele celulare au eșuat, deoarece fosfatul marcat a fost scindat din PE-ATP printr-o activitate ATPază în lizați (datele nu sunt prezentate). Prin urmare, am trecut la forma tiofosfatică a analogului ATP (PE-ATP-XV-s), care nu a fost hidrolizat de lizați (figura 1b). Deși kinazele folosesc adesea ATP-XV-s mai puțin eficient decât ATP normal, tiofosforilarea are mai multe avantaje în acest context. În primul rând, tiofosfații sunt mai stabili și rezistenți la fosfataze . În al doilea rând, deoarece nu există evenimente de tiofosforilare preexistente în celule, etichetarea tiofosfatului oferă markeri unici pentru proteinele fosforilate de kinaza mutantă. În cele din urmă, grupul tiofosfat are proprietăți chimice similare cu gruparea sulfhidril și este susceptibil de modificări chimice. Am exprimat și am purificat complexele solubile de tip sălbatic și ciclină a-CDK2 (F80A) din bacterii și am efectuat un test similar de kinază Rb pentru a testa capacitatea lor de a utiliza PE-ATP-XV-S. După cum se arată în figura 1C, deși ambele kinaze pot utiliza ATP sau ATP-XV-s pentru a fosforila proteina GST-Rb (așa cum este indicat prin deplasarea sa de electromobilitate), numai mutantul F80A poate utiliza PE-ATP-XV-S. Astfel, am folosit PE-ATP-XV-s pentru toate studiile noastre ulterioare.

purificarea într-o singură etapă a peptidelor tiofosforilate

utilizarea analogilor CDK și ATP facilitează fosforilarea substratului foarte specific: următoarea provocare este cum să le identificăm într-un lizat complex. Am căutat să folosim etichetele tiofosfatului pentru a capta și îmbogăți covalent peptidele tiofosforilate după fosforilarea și digestia lizatelor. Cu toate acestea, o problemă cheie a fost distingerea chimică a tiofosfopeptidelor și a peptidelor care conțin cisteină. Deși a fost descrisă o metodă chemoselectivă pentru îmbogățirea tiofosfopeptidelor, abundența copleșitoare a reziduurilor de cisteină într-un amestec complex de proteine face dificilă această abordare . Am folosit o metodă simplă de captare și eliberare pentru a izola selectiv peptidele tiofosforilate în lizatele celulare tripsinizate (figura 2a). Proteinele din lizat au fost fosforilate in vitro cu ciclina a-CDK2 (F80A) și PE-ATP-XV-S. amestecul de proteine a fost ulterior digerat și peptidele rezultate au fost amestecate cu Tiopropil Sefaroză 6b , o rășină disulfură activată care captează atât peptidele care conțin cisteină, cât și tiofosfopeptidele printr-o reacție de schimb disulfură. Deoarece eluția tradițională de ditiotreitol (DTT) eliberează ambele tipuri de peptide legate, am utilizat diferențele calitative dintre peptidele tiofosfate legate de rășină și peptidele care conțin cisteină la legătura fosforotiolatesulfură și, respectiv, legătura alchildisulfură. La valori ridicate ale pH-ului, legătura fosforotiolatesulfură este hidrolizată și alchildisulfura rămâne intactă . Tratarea rășinii cu o bază puternică (cum ar fi hidroxidul de sodiu) eliberează în mod specific tiofosfopeptide (și, de asemenea, le transformă în fosfopeptide normale), dar nu peptidele care conțin cisteină, prin hidrolizarea legăturii fosforotiolatesulfură (figura 2b). Deoarece peptidele legate prin cisteină nu sunt eluate în etapa finală, nu putem recupera tiofosfopeptidele care conțin cisteină. Mai mult, eluția are ca rezultat pierderea semnăturii tiofosfatului prin transformarea tiofosfopeptidei într-o fosfopeptidă. Metoda noastră de izolare a tiofosfopeptidelor diferă modest de cea a lui Blethrow și colab. prin aceea că capturăm tiofosfopeptidele folosind chimie de schimb disulfură (rășină disulfură) în loc de alchilare (rășină iodoacetamidă) și le eluăm selectiv cu hidroliză de bază, mai degrabă decât oxidare.

pentru a testa fezabilitatea acestei abordări, am fosforilat GST-Rb cu ciclina a-CDK2 (F80A) și PE-ATP-XV-s și am aplicat procedura noastră de purificare la o digestie de tripsină a amestecului de reacție. Peptidele izolate au fost analizate prin spectrometrie de masă tandem electrospray (ESI-MS/MS) folosind un spectrometru de masă cu capcană Ionică. Peptidele au fost identificate prin potrivirea spectrelor de masă tandem cu o bază de date a secvenței de proteine umane (cu secvența GST-Rb adăugată) folosind software-ul SEQUEST . Substratul GST-Rb conține cinci cisteine, precum și șapte site-uri SP/TP, care sunt site-uri favorizate pentru fosforilarea CDK . Am recuperat mai multe fosfopeptide conținând numai și toate locurile de fosforilare așteptate (Tabelul 1). Mai mult, nu am recuperat peptide care conțin cisteină și foarte puține peptide nespecifice. Acest lucru a oferit o dovadă a principiului pentru testele noastre la scară largă.

identificarea substraturilor ciclinei A-CDK2 umane în lizatele celulare

scopul nostru a fost de a identifica substraturi a-cdk2 la scară largă a proteomilor. Pentru a reduce complexitatea eșantionului, am fracționat întregul lizat celular al celulelor HEK293 în 11 fracții folosind cromatografie cu schimb de ioni și precipitare cu sulfat de amoniu (fișier de date suplimentar 1). Apoi am efectuat teste in vitro de kinază pe fiecare fracție. Ca un control pozitiv, am adăugat, de asemenea, o cantitate mică de GST-Rb la fiecare reacție. După digerarea amestecului de reacție cu tripsina, am aplicat protocolul nostru de purificare pentru a izola tiofosfopeptidele din amestecurile peptidice. Peptidele recuperate au fost supuse cromatografiei lichide-analiza MS / MS și căutarea bazei de date. Am recuperat un număr variabil de peptide și cel puțin o fosfopeptidă Rb din fiecare dintre fracțiile de lizat (fișier de date suplimentar 2).

CDKs fosforilează proteinele într-o manieră direcționată spre prolină fie pe serină, fie pe treonină, iar numeroase studii susțin ideea că motivul S/T-P-X-R / K reprezintă motivul consensului CDK. Din fosfopeptide am identificat un total de 203 proteine: 180 de candidați au fost fosforilați în cadrul motivelor SP sau TP (orientate spre prolină; fișier de date suplimentar 3). Aceste substraturi candidate reprezintă o gamă largă de procese biologice, inclusiv controlul ciclului celular, metabolismul ADN și ARN, translația și structurile celulare (Figura 3). Un total de 96 din 222 (43%) din siturile direcționate prin prolină s-au conformat consensului CDK cunoscut (cu un reziduu încărcat pozitiv în poziția +3). Interesant este că aproximativ 24% din siturile direcționate prin prolină (53/222) conțineau un reziduu încărcat pozitiv fie în pozițiile +4, fie +5, sugerând că acest motiv poate fi favorizat și de CDK2. Într-adevăr, Blethrow și colab. de asemenea, a remarcat faptul că un număr substanțial de substraturi de ciclină B-CDK1 conțin site-uri fără consens. În cazul peptidelor care conțin situsuri neconsensuale, am constatat că aproximativ 50% din proteinele corespunzătoare au purtat cel puțin un motiv K/RXL, respectiv un motiv K/Rxlx, respectiv un motiv K / Rxlx, respectiv un motiv K / Rxlx, distal față de situsurile de fosforilare, și aproape toate au purtat cel puțin un motiv minim RXL (fișier de date adițional 3). Acest lucru este în concordanță cu ideea bine stabilită că aceste motive promovează legarea ciclinei a-CDK2 de substraturi . În plus față de selectarea pentru fosforilări cu motive de consens CDK, am identificat 28 de proteine care au fost implicate anterior ca substraturi CDK (marcate cu caractere aldine în fișierul de date suplimentare 3) . Astfel, aproape 15% dintre candidații noștri au fost găsiți anterior ca ținte CDK, susținând în continuare ideea că metodele noastre au capturat și îmbogățit substraturile CDK2. În cele din urmă, 43% Din fosforilările pe care le-am găsit au fost identificate anterior în analize fosfoproteomice pe scară largă, in vivo, indicând faptul că aceste fosforilări nu se limitează la condițiile noastre de lizat .

atât studiile noastre, cât și cele raportate de Blethrow și colab. au fost utilizate scheme similare de izolare a fosfopeptidelor și cicline-CDK-uri conexe și am anticipat că ar putea exista suprapuneri substanțiale în substraturile dezvăluite de ambele studii. Într-adevăr, am găsit aproape 50% (30/68) din substraturile ciclinei B-CDK1 în lista noastră de candidați ciclinei a-CDK2; astfel, aceste metode sunt robuste și reproductibile (fișier de date suplimentar 4). Cu toate acestea, există, de asemenea, diferențe substanțiale între cele două liste, iar acestea au rezultat probabil din mai mulți factori, inclusiv diferențe procedurale, tipuri diferite de celule, identificarea incompletă a peptidelor prin SM și specificitatea substratului conferită de subunitățile ciclinei și/sau kinazei. Unele dintre aceste diferențe pot reflecta, de asemenea, diferitele funcții biologice ale ciclinei a-CDK2 și ciclinei B-CDK1. De exemplu, am găsit nouă proteine implicate în traducerea proteinelor și/sau funcția ribozomului, dar niciuna dintre aceste proteine nu a fost găsită cu ciclina B-CDK1, în ciuda abundenței lor relativ ridicate.

deși am identificat un număr de substraturi CDK2 cunoscute, nu am identificat unele substraturi CDK2 descrise anterior. Unii dintre factorii enumerați mai sus pot explica, de asemenea, eșecul de a găsi substraturi CDK2 cunoscute în analizele noastre. În plus, substraturile deja fosforilate de CDK endogene nu ar fi fost tiofosforilate in vitro. De asemenea, este posibil ca unele proteine nu au fost solubilizate în timpul preparării lizat și/sau etapa Sonicare și excluse din analizele noastre. În cele din urmă, este posibil ca complexele proteice mari să fi fost perturbate de procedurile de fracționare înainte de reacția kinazei și ca proteinele care sunt fosforilate de CDK2 numai în contextul acestor complexe să nu fie descoperite prin metodele noastre.

am recuperat, de asemenea, patru fosfopeptide corespunzătoare ciclinei a și CDK2 și 27 de fosfopeptide suplimentare cu site-uri care nu sunt direcționate către prolină (fișier de date suplimentar 5). Am suspectat că aceste fosfopeptide au rezultat din auto-fosforilarea ciclinei a-CDK2 și fosforilarea de fond de către alte kinaze, iar altele au raportat fosforilare de fond similară . Pentru a testa aceste posibilități, am efectuat o reacție de kinază de control folosind ciclina a-CDK2 (F80A) și PE-ATP-XV-s fără lizat celular adăugat și recuperat trei din cele patru peptide ciclină a-CDK2 (fișier de date suplimentar 5). Mai mult, atunci când am efectuat o reacție similară ‘numai kinază’ în prezența lui XV-32P-ATP, am observat încorporarea 32P în ambele proteine într-o manieră dependentă de doză (fișier de date suplimentar 6). Aceste experimente au confirmat că a existat auto-fosforilarea de fond a ciclinei a-CDK2 în testele originale.

am efectuat, de asemenea, reacții kinazice de control utilizând fracțiile de lizat, GST-RB ‘spike-in’ și PE-ATP-XV-s fără adăugarea de ciclină a-CDK2. Aceste reacții de control’ No-kinază ‘ au fosforilat 7 din cele 27 de fosfopeptide care nu sunt direcționate către prolină din lista noastră (fișier de date suplimentar 5), sugerând că majoritatea, dacă nu toate, aceste fosfopeptide au rezultat din fosforilarea de fond de către kinaze care sunt capabile să utilizeze analogul ATP într-o măsură limitată. De exemplu, majoritatea acestor peptide conțin situsuri de fosforilare direcționate către reziduuri acide care sunt motive de cazeină kinază 2. Cazeina kinaza 2 este unică prin faptul că poate utiliza GTP precum și ATP; astfel, site-ul activ poate găzdui analogii ATP voluminoși, cum ar fi pe-ATP . Important, nu am recuperat nicio fosfopeptidă Rb din aceste experimente de control, indicând faptul că nu a existat nicio activitate CDK nespecifică în testele noastre. De asemenea, am recuperat 44 de peptide nemodificate, dintre care 12 conțineau reziduuri de cisteină. Majoritatea acestor peptide provin din mai multe fracții de lizat (fișier de date suplimentar 2). Bănuim că acestea au rezultat din legarea nespecifică de nivel scăzut a peptidelor la rășină, în ciuda condițiilor stricte de spălare, iar în cazul peptidelor care conțin cisteină, dintr-o cantitate mică de hidroliză a legăturii alchildisulfură în timpul etapei de eluție. Pe scurt, metodele noastre au fost extrem de selective, iar studiile noastre au identificat un grup surprinzător de mare de substraturi candidate de ciclină a-CDK2, dintre care majoritatea nu au fost identificate anterior ca ținte CDK.

validarea substraturilor candidate ca ținte ciclină a-CDK2

am folosit mai multe strategii pentru a valida unii dintre candidații noi din lista noastră ca substraturi ciclină a-CDK2. Deoarece identificările noastre de proteine s-au bazat pe secvențe peptidice, am început prin a confirma că ciclina a-CDK2 a fosforilat trei candidați de lungime întreagă și nativi care au fost imunoprecipitați prin etichete epitope din 293 celule transfectate (EF2, TRF2 și RAP1). Deoarece aceste proteine nu au fost prezente pe lista ciclinei B-CDK1 , am determinat dacă sunt fosforilate și de ciclina B-CDK1. Fiecare candidat CDK2 a fost fosforilat atât de ciclina a-CDK2, cât și de ciclina B-CDK1, deși EF2 a fost fosforilat într-o măsură mai mică decât TRF2 sau RAP1 (figura 4a). De asemenea, am exprimat TRF2, RAP1 și proteina ribozomală RL12 ca fuziuni GST și le-am purificat din Escherichia coli. Când am utilizat ciclina a-CDK2 pentru a fosforila TRF2 și RAP1 in vitro, proteinele au fost foarte fosforilate, iar analizele SM au arătat că aceste fosforilări au avut loc pe aceleași site-uri pe care le-am identificat inițial (figura 4b). De asemenea, am folosit ciclina a-CDK2 și ciclina B-CDK1 pentru a fosforila GST-RL12 și am constatat că ambele CDK au fosforilat și rl12 in vitro (figura 4c). Aceste studii confirmă astfel că peptidele identificate în ecranul nostru reprezintă proteine care pot fi fosforilate de ciclina a-CDK2, cel puțin in vitro. Deși am găsit diferențe calitative în capacitatea ciclinei a-CDK2 și a ciclinei B-CDK1 de a fosforila proteine specifice, în fiecare caz candidații au fost fosforilați de ambele CDK. Deoarece preparatul enzimatic pe care l-am utilizat în aceste studii conținea un exces de CDK2 liber (F80A), am luat în considerare posibilitatea ca unele fosforilări de substrat să poată rezulta din asocierea ciclinelor endogene cu CDK2 (F80A) care a fost fie monomerică, fie care s-ar fi putut disocia de ciclina a în timpul condițiilor de testare. Am constatat că cantitatea de activitate a ciclinei B-CDK2 (F80A) din aceste extracte a fost neglijabilă în comparație cu ciclina a-CDK2 (F80A) și nu am putut detecta nicio activitate a ciclinei e-CDK2 (F80A) (fișier de date suplimentar 7). Cu toate acestea, nu putem exclude posibilitatea ca unele peptide să fi fost fosforilate de CDK2 (F80A) în complex cu o ciclină endogenă, iar specificitatea oricărui substrat candidat pentru ciclina a față de alte cicline care activează CDK2 trebuie validată așa cum este descris mai jos.

validarea RL12 ca substrat în vivoCDK2

studiile de mai sus au validat mai mulți candidați noi identificați în ecranul nostru ca substraturi CDK2 in vitro. Cu toate acestea, pentru a determina dacă un substrat nou este, de asemenea, fosforilat de CDK2 in vivo, am efectuat o analiză mai cuprinzătoare a proteinei ribozomale RL12. Am amestecat mai întâi imunoprecipitate de ciclină a-CDK2 și rl12 etichetate cu epitop, exprimate în celule umane în prezența de 32P-ATP și am constatat că ciclina a-CDK2 a fosforilat RL12 in vitro (figura 5a). Fosforilarea a fost în mare parte abolită într-un mutant rl12 unde fosfoserina identificată S38 a fost înlocuită cu o alanină și a fost restaurată când S38 a fost înlocuit cu o treonină (figura 5b). Apoi am folosit cartografierea fosfopeptidelor pentru a identifica peptida care conține S38 și am confirmat că a fost direct fosforilată de CDK2 in vitro (figura 5c). Pentru a testa dacă RL12 este, de asemenea, fosforilat in vivo într-o manieră dependentă de CDK2 în același loc, am etichetat metabolic celule cu 32P-ortofosfat și imunoprecipitat tip sălbatic sau RL12-s38a din celule supraexprimând fie ciclina e-CDK2, catalizat inactiv ciclina e-CDK2, sau inhibitorul CDK p21 (pentru a inhiba CDK endogene) . Deoarece nu putem studia fosforilarea endogenă RL12 din cauza lipsei unui anticorp anti-RL12 adecvat, aceste studii au examinat fosforilarea rl12 ectopic in vivo (aceste condiții de transfecție au dus la o supraexprimare de aproximativ cinci până la zece ori a ARNm RL12 (fișier de date suplimentar 8). Am constatat că rl12 de tip sălbatic, dar nu RL12-s38a, a fost fosforilat in vivo (figura 5D). Această fosforilare a fost îmbunătățită în celulele care supraexprimă ciclina e-CDK2, dar nu ciclina inactivă e-CDK2 și a fost diminuată în celulele care supraexprimă inhibitorul CDK p21 (care inhibă ciclina-CDK endogenă; Figura 5d). În cele din urmă, am utilizat cartografierea fosfopeptidelor și analizele fosfoaminoacide ale proteinei rl12 imunoprecipitate din celulele marcate și am confirmat că fosforilarea RL12 de către ciclina e-CDK2 in vivo a avut loc și pe S38 (figura 5e). Rl12 S38 fosforilarea in vivo a fost, de asemenea, raportată în studiile privind fosfoproteomii .

deși am validat fiecare dintre candidații noi pe care i-am testat până acum, arătând că proteinele de lungime completă sunt fosforilate de CDK2, unii candidați de pe lista noastră se vor dovedi probabil că nu sunt substraturi de ciclină a-CDK2 relevante fiziologic. De exemplu, reacțiile kinazei au fost efectuate în lizați, iar compartimentarea subcelulară in vivo poate restricționa accesul CDK2 la unii candidați. Mai mult, este posibil ca alte kinaze celulare să fie redundante cu sau mai importante decât CDK2 în ceea ce privește substraturile individuale in vivo. Prin urmare, este esențial ca candidații să fie evaluați riguros într-un context cât mai fiziologic posibil. În acest scop, în studiile în curs de desfășurare, folosim o abordare de direcționare a genelor pentru a muta un subset al acestor situsuri de fosforilare în genele endogene pentru a studia semnificația lor fiziologică.