screeningul markerului de suprafață celulară umană

celulele hESC și hPSC-RPE au fost disociate în celule unice folosind TrypLE timp de 5-10 minute. Veziculele optice au fost disociate în celule unice folosind TrypLE Select (Gibco, Invitrogen) timp de 10 minute, urmate de disociere fizică printr-un ac de 20 G. Pentru a permite analiza simultană a acestor populații diferite în aceeași probă, hESC, hPSC-celule RPE, și vezicula optică celulele au fost marcate cu CellTrace™ CFSE (0.25 µM) timp de 7 min la 37 °C sau CellTrace™ Violet (5 µM) timp de 20 min la 37 °C în urma protocolul producătorului (Thermo Fisher Scientific). Apoi, cele trei tipuri de celule au fost colorate cu ajutorul panourilor de Screening bd Lyoplate (bd Biosciences), urmând protocolul producătorului. Codul de bare al celulelor a permis să se facă distincția cu ușurință între cele trei grupuri de celule și să se minimizeze variabilitatea eșantionului în timpul screeningului. Probele au fost analizate pe plăci cu 96 de puțuri pe un LSRFortessa echipat cu lasere de 405, 640, 488, 355 și 561 nm (bd Biosciences) sau un CytoFLEX echipat cu lasere de 405, 638, 488 și 561 nm (Beckman Coulter). Celulele neviabile au fost excluse din analiză utilizând 7-AAD (7-aminoactinomicină D) colorant acid nucleic (bd Biosciences). Analiza datelor a fost efectuată utilizând software-ul FlowJo v. 10 (Tree Star). Ecranul de marcare a suprafeței celulare a fost efectuat o dată pentru veziculele optice 3D și o dată pentru ziua 60 hPSC-RPE.

culturi celulare

liniile HESC HS980 și HS983 au fost anterior derivate și cultivate în condiții fără xeno și definite30 (Swedish Ethical Review Authority: 2011/745:31/3). Donatorii și-au dat consimțământul informat pentru derivarea și utilizarea ulterioară a liniilor hESC. Linia WA09/H9 HESC a fost obținută de la Wicell și a fost adaptată la cultura fără alimentator pe hrLN-521 (10 hectolitri/mL, Biolamina). Celulele au fost menținute prin propagare clonală pe plăci acoperite cu hrLN-521 în mediu NutriStem hPSC XF (industrii biologice), într-un incubator 5% CO2/5% O2 și au fost transmise enzimatic la un raport 1:10 la fiecare 5-6 zile.liniile hiPSC CTRL-7-II, CTRL-9-II, CTRL-12-I și CTRL-14-II au fost furnizate cu amabilitate de instituția Karolinska iPSC core facility (autoritatea suedeză de revizuire etică: 2012/208-31/3, 2010/1778-31/4). Donatorii și-au dat consimțământul informat pentru derivarea și utilizarea ulterioară a liniilor hiPSC. Celulele au fost menținute prin propagare clonală pe plăci acoperite cu hrLN-521 (Biolamina) în mediu NutriStem hPSC XF (industrii biologice), într-un incubator de 5% CO2/5% O2 și trecute enzimatic la un raport 1:10 la fiecare 5-6 zile.

pentru trecere, culturile confluente au fost spălate de două ori cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) fără Ca2+ și Mg2+ și incubate timp de 5 min la 37 C, 5% CO2 / 5% O2 cu TrypLE Select. Enzima a fost apoi îndepărtată cu grijă și celulele au fost colectate în mediu NutriStem hPSC XF proaspăt preîncălzit prin pipetare ușoară pentru a obține o suspensie monocelulară. Celulele au fost centrifugate la 300 de grame la sută timp de 4 minute, peleta a fost omogenizată în mediu NutriStem hPSC XF proaspăt preîncălzit, iar celulele au fost placate pe un vas proaspăt acoperit cu hrLN-521. La două zile după trecere, mediul a fost înlocuit cu mediu NutriStem hPSC XF proaspăt preîncălzit și schimbat zilnic.

diferențierea monostratului hPSC-RPE

un protocol pas cu pas care descrie protocolul de diferențiere poate fi găsit la Protocol Exchange36. hESC sau hiPSC au fost placate la o densitate de celule de 2,4 104 celule/cm2 pe vase acoperite cu laminină (20 hectogg/mL) folosind Mediu NutriStem hPSC XF. S-a adăugat inhibitor de Rho-kinază (y-27632, Millipore) la o concentrație de 10 MMCT în primele 24 de ore, în timp ce celulele s-au menținut la 37 MMCT, 5% CO2/5% O2. Dupa 24 de ore, mediul hPSC a fost inlocuit cu mediul de diferentiere NutriStem hPSC XF fara factor de crestere bazic al fibroblastelor (bFGF) si factor de crestere transformant-sec. Din ziua 6 după placare, 100 ng/mL de Activin A (R&sisteme D) a fost adăugat la mass-media. Celulele au fost hrănite de trei ori pe săptămână și păstrate timp de 30 de zile. Monostraturile au fost apoi tripsinizate folosind TrypLE Select (Gibco, Invitrogen) timp de 10 min la 37 C, 5% CO2. Enzima a fost îndepărtată cu grijă și celulele au fost colectate în mediu NutriStem hPSC XF proaspăt preîncălzit, fără bFGF și TGF, prin pipetare ușoară, pentru a obține o suspensie monocelulară. Celulele au fost centrifugate la 300 sect g timp de 4 min, peleta a fost omogenizată, trecută printr-un filtru celular (sect 40 sect m, bd Biosciences), iar celulele au fost însămânțate pe vase acoperite cu laminină (hrLN-111 și hrLN-521 la 20 mg/mL) la diferite densități celulare cuprinse între 1,4 sect 106 și 1,4 sect 104 sect/cm2. Celulele replatate au fost hrănite de trei ori pe săptămână în următoarele 30 de zile cu NutriStem hPSC XF medium fără Bfgf și TGF XV. Pentru diferențierea hPSC-RPE in vitro în suspensie 3d EBs, am urmat protocolul nostru publicat anterior10. Pe scurt, celulele stem pluripotente au fost cultivate până la confluența pe rhLN-521 și răzuite manual pentru a produce EBs folosind un vârf de pipetă de 1000 unkticli. EBs au fost apoi cultivate în suspensie în plăci de fixare scăzute (Corning) la o densitate de 5-7 celule 104/cm2. Diferențierea s-a efectuat în mediul NutriStem Hesc XF la comandă, în care bFGF și TGF au fost eliminate prin schimbarea mediilor de două ori pe săptămână. Zece micromoli de inhibitor de Rho-kinază (Y-27632, Millipore) au fost adăugați la culturile de suspensie numai în primele 24 de ore. după 5 săptămâni de diferențiere, zonele pigmentate au fost tăiate mecanic din EBs folosind un bisturiu. Celulele au fost apoi disociate folosind TrypLE Select, urmate de spălarea printr-un ac și o seringă de 20 G. Celulele au fost însămânțate printr-o strecurătoare de celule (int.40 int. m, bd Biosciences) pe vase acoperite cu LN la o densitate celulară de 0.6-1. 2 104 celule / cm2 și hrănite de două ori pe săptămână cu același mediu de diferențiere menționat mai sus. Imaginile de câmp luminoase au fost achiziționate cu un microscop Nikon Eclipse te2000-s și o cameră Canon SX170 IS a fost utilizată pentru a capta pigmentarea din partea de sus a puțurilor.

PCR cantitativ în timp real

ARN-ul Total a fost izolat folosind Mini Kit-ul RNeasy plus și tratat cu Dnază fără Rnază (ambele din Qiagen). ADN-ul complementar (ADNc) a fost sintetizat folosind 1 hectar de ARN total în amestec de reacție de 20 unktil, conținând hexameri aleatori și revers transcriptază superscript III (Gibco, Invitrogen), conform instrucțiunilor producătorului.

citometria în flux

sortarea celulelor a fost efectuată pe culturi hPSC-RPE după 21 sau 30 de zile de diferențiere. Celulele au fost incubate cu anticorpii conjugați menționați pe gheață timp de 30 min. Controalele FMO au fost incluse pentru fiecare condiție pentru a identifica și celulele gate-negative și pozitive. Celulele colorate au fost apoi sortate folosind un sortator de celule de fuziune bd FACS aria (bd Biosciences) folosind FACSDiva Sofware v8.0.1.

imediat după sortare, 70.000 de celule diluate în 100 ilct de 2% FBS și 1 mm EDTA (Sigma) au fost citospinate timp de 5 minute la 400 r.p.m. pe lamele de sticlă. Diapozitivele au fost lăsate să se usuce peste noapte la temperatura camerei, urmate de fixarea cu Formaldehidă Fără metanol 4% la temperatura camerei timp de 10 min și colorarea imunofluorescenței.

imunofluorescență

Histologie și imunostimulare tisulară

imediat după eutanasie prin injecție intravenoasă de 100 mg / kg pentobarbital (vet Allfatal. 100 mg/mL, Omnidea), ochii au fost enucleați, iar zona de injectare a blebului a fost marcată cu colorant pentru marcarea țesuturilor verzi (TMD) (produse Histolab). S-a efectuat o injecție intravitroasă de soluție de fixare de 100 ecql (FS) constând din formaldehidă tamponată 4% (Solvenco AB) înainte de fixarea în FS timp de 24-48 ore și încorporarea în parafină. Secțiunile seriale cu patru micrometri au fost produse prin zona marcată cu TMD și la fiecare patru secțiuni au fost colorate cu hematoxilină–eozină.

pentru imunostimulare, diapozitivele au fost deparafinizate în xilen, deshidratate în alcooli gradați și clătite cu Ddh2o și soluție salină tamponată cu Tris (TBS, pH 7,6). Recuperarea antigenului a fost realizată în tampon de citrat de 10 mM (citrat trisodic dihidrat, Sigma-Aldrich, pH 6,0) cu 1:2000 Tween-20 (Sigma-Aldrich) la 96 centimetric C timp de 30 min, urmată de răcire de 30 min la temperatura camerei. Lamele au fost spălate cu TBS și blocate timp de 30 min cu 10% ser normal de măgar (Abcam) diluat în TBS conținând 5% (g/v) IgG și albumină serică bovină fără protează (Jackson Immunoresearch) într-o cameră umidificată. Anticorpii primari diluați în tamponul de blocare au fost incubați peste noapte la 4 ct: proteina aparatului mitotic nuclear uman (NuMA) (1:200, Abcam ab84680), BEST-1 (1:200, Millipore MAB5466), CD140b/PDGFRB (1:100, Santa Cruz Biotechnology sc-432) și CD56/NCAM1 (1:100, Santa Cruz Biotechnology sc-7326, clone ) (date suplimentare 2). Anticorpii secundari (magar anti-iepure IgG (H + L) Alexa Fluor 555 A31572 și măgar anti-șoarece IgG (H + L) Alexa Fluor 647 A31571, ambele de la Thermo Fisher Scientific) (date suplimentare 2) diluat 1:200 în tampon de blocare au fost incubate 1 h la temperatura camerei. Secțiunile au fost montate cu Vector Vectashield cu DAPI ((4′,6-diamidino-2-fenilindol)) mediu de montare (Vector Laboratories) sub o lamelă de acoperire de 24 de 50 mm2.

pentru imunohistochimie, diapozitivele au fost deparafinizate urmate de recuperarea antigenului (soluție ER2, pH 9, 20 min, Leica Biosystems) și colorarea (Protocolul IHC F) pentru CD140b/PDGFRB (1:100, Santa Cruz Biotechnology sc-432) și CD56 / NCAM1 (1:100, Santa Cruz Biotechnology sc-7326, clonă ) anticorpi (date suplimentare 2) pe instrumentul Bond RXM (Leica Biosystems).

imaginile au fost realizate cu microscopul inversat cu fluorescență Olympus Ix81 sau cu microscopul confocal cu scanare punctuală Zeiss Lsm710-NLO. Analiza post-achiziție a imaginilor a fost realizată cu ajutorul software-ului ImageJ.

testul de fagocitoză

POS-urile bovine marcate cu izotiocianat de fluoresceină au fost izolate și date cu amabilitate de Dr.E. F. Nandrot de la Institut de la Vision, Paris37. celulele hPSC-RPE au fost cultivate pe membrană transwell (0,33 cm2, Corning) acoperită cu hrLN-521 20 hectolitri/mL timp de 1 lună după însămânțare. Celulele au fost incubate la 37 de Centimetre C sau 4 Centimetre C timp de 16 ore cu 2,42 de Centimetre 106 decongelate POS/Transwell diluate în DMEM (Mediu vultur modificat Dulbecco) sau medii independente de CO2 (ambele de la Thermo Fisher Scientific), respectiv. După incubare, celulele au fost stinse cu soluție albastră de Trypan 0.2% (Gibco, Invitrogen) timp de 10 minute la temperatura camerei, fixat cu 4% Formaldehidă Fără metanol (Polysciences) la temperatura camerei timp de 10 minute și permeabilizat cu 0,3% Triton X-100 în D-PBS timp de 15 minute. Colorarea cu phalloidină a rodaminei (1:1000, 20 min la temperatura camerei, Biotinum 00027) (date suplimentare 2) a fost utilizată pentru a vizualiza limitele celulare. Nucleele au fost colorate cu Hoechst 33342 (1:1000, 20 min la temperatura camerei, Invitrogen).

imaginile au fost obținute cu microscopul confocal Zeiss Lsm710-NLO. Analiza post-achiziție a imaginilor a fost realizată folosind Imaris (Bitplane), iar cuantificările POS s-au făcut cu software-ul CellProfiler 2.1.1. Module utilizate: LoadImages, ColorToGrey, IdentifyPrimaryObjects, MeasureObjectSizeShape, SaveImages, și ExportToSpreadsheet. Obiectele au fost identificate printr-un diametru tipic de unități de 10-40 pixeli folosind două clase, Global, Otsu, metoda de pragare a varianței ponderate cu 0,01 și 1,0 limite inferioare și superioare și 2,1 factor de corecție, cu obiecte aglomerate distinse prin intensitate.

testul Imunosorbent legat de enzime

celulele hPSC-RPE au fost cultivate pe membrane Transwell (0,33 cm2, Millipore) acoperite cu diferite substraturi. Supernatanții din ambele părți apicale și bazale hPSC-RPE (adică compartimentele superioare și inferioare ale transwell, respectiv) au fost colectate la 60 de ore după schimbarea mediului. Nivelurile de secreție PEDF au fost măsurate în triplicate pentru fiecare afecțiune cu kituri umane PEDF ELISA disponibile în comerț (BioVendor RD191114200R) au fost utilizate, în conformitate cu instrucțiunile producătorului, după 60 de zile de cultură. Sreadings densitatea optică au fost măsurate folosind SpectraMax 250 cititor de microplăci (dispozitive moleculare). Rezultatele sunt prezentate ca valori medii sem.

măsurătorile TEER

celulele RPE de rezistență electrică Transepitelială placate pe Transvells (0,33 cm2, Millipore) au fost măsurate folosind sistemul de rezistență electrică Millicell volt-ohm meter (Millicell ERS-2, Millipore), conform instrucțiunilor producătorului. Culturile de șaizeci de zile au fost echilibrate în afara incubatorului la temperatura camerei timp de 15-20 de minute înainte de experiment. Măsurătorile au fost efectuate în medii de cultură nemodificate în trei exemplare pentru fiecare condiție, la trei poziții diferite ale fiecărui godeu. Mediile au fost utilizate pentru analize suplimentare. Rezistența de fond a fost determinată dintr-o inserție de cultură goală în același mediu acoperit cu substratul corespunzător, dar fără celule, și scăzută din condiția experimentală respectivă. Măsurătorile sunt raportate ca rezistență în ohmi ori suprafața în centimetri pătrați (centimetrii pătrați) (centimetrii cm2). Rezultatele sunt prezentate ca valori medii sem.

microscopie electronică de scanare

celulele hPSC-RPE au fost cultivate pe inserții transwell acoperite cu LN521 (20 hectolitri / mL) timp de 60 de zile. Acestea au fost fixate prin imersie în 2,5% glutaraldehidă în tampon fosfat de 0,1 m, pH 7,4. Membrana transwell a fost tăiată și spălată în apă MilliQ înainte de deshidratarea treptată a etanolului și uscarea punctului critic folosind dioxid de carbon (Leica EM CPD 030). Inserțiile au fost montate pe butucuri de specimen folosind file adezive de carbon și pulverizare acoperite cu un strat subțire de platină (Quorum Q150T ES). Imaginile cu microscopie electronică de scanare au fost achiziționate folosind un microscop electronic de scanare cu emisie de câmp Ultra 55 (Zeiss, Oberkochen, Germania) la 3 kV și detectorul se2.

microscopie electronică de transmisie

celulele hPSC-RPE au fost cultivate pe inserții transwell acoperite cu LN521 (20 hectolitri / mL) timp de 60 de zile. Acestea au fost fixate prin imersie în 2,5% glutaraldehidă în tampon fosfat de 0,1 m, pH 7,4. Membrana transwell a fost decupată și în fâșii subțiri, clătită în tampon fosfat de 0,1 m, urmată de postfixare în tetroxid de osmiu 2% în tampon fosfat de 0,1 m, pH 7,4, la 4 centimetric C timp de 2 ore. Benzile de membrană au fost supuse deshidratării etanolului în trepte și în cele din urmă plate încorporate în LX-112. Secțiunile Ultrathin (~50-60 nm) au fost preparate folosind un Leica em UC7 și în contrast cu acetat de uranil, urmat de citrat de plumb. Imagistica prin microscopie electronică de transmisie a fost realizată pe un microscop electronic de transmisie Hitachi HT7700 (Hitachi High-Technologies) operat la 80 kV, iar imaginile digitale au fost achiziționate folosind o cameră Veleta CCD (Olympus Soft Imaging Solutions).

analiza bioinformatică de secvențiere a ARN-ului unicelular

celulele hPSC-RPE de șaizeci de zile au fost disociate folosind TrypLE Select și trecute printr-o strecurătoare de celule (int.40 int. m, bd Biosciences). Acestea au fost omogenizate la o concentrație de 1000 celule/ecqtl în 0,04% BSA în PBS. Celulele au fost transportate la 4 C la unitatea de Genomică cu o singură celulă eucariotă (ESCG, SciLifeLab, Stockholm, Suedia) unde a fost pregătită o bibliotecă ADNc de 3′ pentru secvențierea ARN-ului cu o singură celulă cu platforma 10x Genomics (10x Genomics) folosind software-ul NovaSeq 6000. Cell Ranger 2.1.1 (10x Genomics) conducta a fost folosit pentru a converti Illumina fișiere de apel de bază în format fastq, aliniați secvențiere citește la transcriptom hg19 folosind aligner38 stele, și de a genera matrice de coduri de bare feature. Celulele filtrate de control al calității Cell Ranger (718, 810, 931 și 1129 picături care conțin celule au fost capturate pentru CD140b+GD2 -, CD140b+CD184−, eșantioane replatate 1:20 și respectiv hesc) au fost analizate în R versiunea 3.5.1 (R Core Team)39,folosind Seurat suite versiunea 2.3.440, 41. Ca o suplimentare de control al calității măsură, celule RPE cu a exprimat unic de gene (≥2000 și ≤5000), UMIs (≥10.000 ≤30.000) și procentul de UMI cartografiere la MT gene (≥0.025 să ≤0.10) au fost selectate. În mod similar, hESC cu a exprimat unic de gene (≥2000 și ≤8000), UMIs (≥10.000 de maximum 80.000 de), și procentul de UMI cartografiere la MT gene (≥0.025 să ≤0.10). Această etapă de filtrare a dus la setul final de date de 616, 725, 779 și 905 celule pentru CD140b+GD2−, CD140b+CD184−, replatate 1:20 și, respectiv, eșantioane hESC. Înainte de reducerea dimensionalității prin analiza componentei principale (PC), variația celulă–celulă a expresiei genelor determinată de UMIs, expresia genelor mitocondriale și etapele ciclului celular au fost regresate în timpul procesului de scalare a datelor42. Genele variabile din probele RPE au fost selectate pe baza expresiei și dispersiei medii normalizate (limita de Expresie = 0,0125-5 și limita de dispersie inferioară = 0,5). Pentru selectarea PC-urilor, au fost evaluate constatările PCHeatmap, jackStraw, abaterile standard ale PC-urilor și analiza Clustre43. Primele 15 PC-uri au fost utilizate pentru proiectarea tsne44 și analiza clusterizării (rezoluție = 0,1, perplexitate = 40).

clusterele celulare au fost analizate prin două abordări. Genele diferențiale superioare au fost identificate pentru fiecare cluster folosind testul Wilcoxon ‘ s rank-sum. Expresia genei semnăturii secundare (scorurile modulului) a fost calculată pentru hesc nediferențiat și pentru mai multe tipuri de celule prezente în retina umană. Celulele care exprimă markerii mezodermului au fost subdivizate manual într-un cluster separat folosind caracteristici interactive de complot ale Seurat. Datele sunt încărcate în ArrayExpress (EMBL-EBI)—a se vedea detaliile de mai jos.

animale

după aprobarea de către Comitetul de etică experimentală pentru animale din Stockholm de Nord (DNR N25 / 14), în acest studiu au fost utilizați 10 iepuri albinoși albi din Noua Zeelandă (furnizați de ferma de iepuri Lidk Inktyping, Lidk Inktyping, Suedia) în vârstă de 5 luni, cântărind 3,5 până la 4,0 kg. Toate experimentele au fost efectuate în conformitate cu declarația privind utilizarea animalelor în cercetarea oftalmică și vizuală.

transplant Subretinal

monostraturile hPSC-RPE au fost spălate cu PBS, incubate cu TrypLE și disociate la suspensie cu o singură celulă. Celulele au fost numărate într-o cameră de hemocitometru Neubauer folosind 0,4% albastru de Trypan (Thermo Fisher Scientific corp.), centrifugate la 300 hectolitri g timp de 4 minute, iar peleta celulară a fost resuspendată în PBS proaspăt sterilizat cu filtru la o concentrație finală de 1000 celule/unktil. Suspensia celulară a fost apoi alicotată aseptic în 600 de unități de unktil și ținută pe gheață până la operație.

animalele au fost puse sub anestezie generală prin administrare intramusculară de 35 mg/kg ketamină (Ketaminol, 100 mg/mL, Intervet) și 5 mg / kg xilazină (rompun vet. 20 mg/mL, Bayer Animal Health), iar pupilele au fost dilatate cu un amestec de 0,75% ciclopentolat/2,5% fenilefrină (APL). Microchirurgiile au fost efectuate pe ambii ochi folosind o tehnică transvitreală pars plana cu 2 porturi 25 G (Alcon Accurus, Alcon Nordic) așa cum a fost descrisă anterior45. Suspensia celulară a fost extrasă într-o seringă de 1 mL conectată la un tub prelungitor și la o canulă polytip de 38g (MedOne Surgical Inc). Fără vitrectomie prealabilă, canula a fost introdusă prin trocarul temporal superior. După poziționarea corectă a vârfului, constatată printr-o flare focală a retinei, 50 unqtl de suspensie celulară (echivalent cu 50.000 de celule) a fost injectată lent subretinal ~6 mm sub marginea inferioară a capului nervului optic, formând o bleb uniformă care era clar vizibilă la microscopul de operare. S-a avut grijă să se mențină vârful în bleb în timpul injecției pentru a minimiza refluxul. După îndepărtarea instrumentului, s-a aplicat o presiune ușoară asupra sclerotomiilor fără sutură de auto-etanșare. Două micrograme (100 unqql) de triamcinolonă intravitroasă (Triescence, Alcon Nordic) au fost administrate cu 1 săptămână înainte de operație și nu s-au administrat antibiotice post-chirurgicale.

statistici și reproductibilitate

pentru analizele statistice, s-au efectuat analize bidirecționale ale varianței și comparații multiple post-hoc folosind corecția testului Tukey pentru a evalua diferențele in vitro ale diferitelor densități evaluate și sortare față de condițiile replatate în testele de secreție TEER și PEDF.

toate cuantificările au fost efectuate neblindate. Parametrii statistici, inclusiv definițiile și valoarea exactă a lui n (de exemplu, numărul total de experimente, replicări etc.), abaterile, valorile P și tipurile testelor statistice sunt raportate în cifre, legendele figurii corespunzătoare și în această secțiune. Analiza statistică a fost efectuată utilizând Prism 7 (software GraphPad, versiunea 7.0 c). În toate cazurile, analiza statistică a fost efectuată pe date de la cel puțin trei replici experimentale biologic independente. Comparațiile între grupuri au fost planificate înainte de testarea statistică, iar dimensiunile efectului țintă nu au fost predeterminate. Barele de eroare afișate pe grafice reprezintă media SEM a cel puțin trei experimente independente. Toate micrografele prezentate sunt imagini reprezentative ale a trei experimente independente, cu excepția cazului în care se specifică altfel (de exemplu, Fig. 1c).

rezumat de raportare

informații suplimentare privind proiectarea cercetării sunt disponibile în Rezumatul de raportare privind cercetarea naturii legat de acest articol.