rezumat
cervicita este o boală comună cu transmitere sexuală. În ultimii ani, abuzul de antibiotice în tratamentul cervicitei are ca rezultat apariția bacteriilor rezistente la antibiotice; sunt necesare strategii alternative. În această cercetare, am investigat efectele gelului vaginal Feilin (FVG), o formulă chineză pe bază de plante, asupra tratamentului cervicitei. Două modele de cervicită au fost optimizate utilizând șoarece BALB / c; un model in vitro a fost stabilit în celulele HeLa. În modelul de cervicită indusă de Chlamydia trachomatis, s-a putut observa nivelul ridicat de încărcături bacteriene, inflamația în țesut și citokinele din ser. Odată cu administrarea FVG, încărcăturile bacteriene din mucusul cervical și țesutul cervical ar putea fi inhibate semnificativ în maniere dependente de doză. Leziunea patologică a colului uterin și a vaginului, precum și nivelurile de IL-2, IL-17 și MCP-1 în ser, ar putea fi atenuate de FVG. FVG a redus numărul de incluziuni induse de C. trachomatis în celulele HeLa. În plus, leziunile histologice din modelul de cervicită indusă de Escherichia coli și Staphylococcus aureus ar putea fi reduse prin FVG. Aceste rezultate sugerează că FVG este capabil să trateze cervicita prin inhibarea agenților patogeni și reglarea răspunsurilor imune ale gazdei. FVG poate contribui ca agent alternativ pentru tratamentul cervicitei.
1. Introducere
cervicita este o boală comună cu transmitere sexuală, cu o afecțiune inflamatorie a colului uterin . Infecția colului uterin începe de la tractul genital inferior (vagin) și apoi se dezvoltă în boala inflamatorie pelvină cu infecție ascendentă a tractului genital superior (uter și trompele uterine) și cavitatea peritoneală . Cervicita a apărut frecvent ca o infecție asimptomatică. Secreția mucopurulentă cervicală sau vaginală anormală și ectopia cervicală pot fi semnele și simptomele cervicitei la unii pacienți . Cu toate acestea, cervicita gravă poate duce la infertilitate suplimentară și sarcină ectopică. Cervicita este considerată a fi asociată cu transmiterea infecției cu HIV și cu dezvoltarea carcinoamelor cervicale .
cervicita poate fi indusă de diverși agenți patogeni, cum ar fi Chlamydia trachomatis, Neisseria gonoreea, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Trichomonas, virusul Herpes simplex, citomegalovirusul și adenovirusul . Infecția cu C. trachomatis este raportată a fi cea mai frecventă cauză a cervicitei. Mai mult de 10% dintre femeile cu cervicită sunt diagnosticate ca fiind infectate cu C. trachomatis și numărul acestor infecții continuă să crească în ultimele decenii . C. trachomatis este o bacterie intracelulară obligatorie Gram-negativă. Două forme de C. trachomatis pot fi găsite în ciclul său de dezvoltare. Atașarea corpurilor elementare (EBs) la celulele gazdă mediază invazia C. trachomatis. În interiorul celulelor gazdă, C. trachomatis formează corpurile reticulate (RBs) și apoi RBs se reproduc în vacuolul citoplasmatic și formează în cele din urmă incluziunea .
Chlamydia poate persista mult timp în colul uterin fără simptome. Infecția se poate rezolva spontan fără tratament sau poate provoca cervicită. Clearance-ul C. trachomatis necesită răspunsurile imunității Th1 . Cu toate acestea, răspunsurile imunității adaptive pot avea o natură dublă și pot provoca leziuni tisulare. Tratamentul infecției cu C. trachomatis se bazează pe tratamentul pacienților și al partenerilor lor sexuali cu macrolide. Abuzul de antibiotice și diagnosticul fals pozitiv poate contribui la apariția organismelor rezistente la antibiotice. Bacteriile rezistente la antibiotice, pe de altă parte, duc la eșecul tratamentului . După tratamentul cu antibiotic, 10% -20% dintre pacienți vor suferi de reinfecție în decurs de un an, ceea ce se poate datora absenței imunității protectoare împotriva chlamidiei . Având în vedere aceste condiții, trebuie dezvoltate strategii alternative.
Medicina Tradițională Chineză (TCM) are o istorie lungă în tratarea bolilor ginecologice . Gelul vaginal Feilin (FVG) este dezvoltat dintr-o formulă de Medicină Chineză utilizată clinic, care este utilizată pentru a trata cervicita mucopurulentă. FVG constă din următoarele medicamente pe bază de plante: Gentianae radix et rhizoma, Stemonae radix, cortexul Fraxini, Paeoniae radix rubra, cortexul Dictamni și Glycyrrhizae radix et rhizome. Conform teoriei TCM: FVG poate fi utilizat pentru a trata acumularea de umezeală și materiale toxice induse de descărcări vaginale anormale, cum ar fi leucoreea abundentă, fetidă și gălbuie, mâncărime și durere în jurul organelor genitale externe . Extracția, pregătirea și controlul calității FVG au fost studiate. Concentrațiile de gentiopicrozidă și paeoniflorină în GFF au fost analizate pentru a fi de aproximativ 5,90 mg/g și, respectiv, 8,96 mg/g .
în studiul de față, am testat ipoteza că FVG ar putea trata cervicita în mod eficient. Au fost stabilite modele de cervicită de șoarece pentru a evalua tratamentul FVG. În modelul de șoarece infectat cu C. trachomatis, au fost evaluate încărcăturile bacteriene, leziunea patologică și nivelurile de MCP-1, IL-2 și IL-17 din ser. Incluziunile în celulele HeLa induse de C. trachomatis au fost enumerate in vitro. În plus, după ce a fost infectat cu amestecul de Escherichia coli și Staphylococcus aureus, tratamentul FVG a fost evaluat prin examinarea histologică a colului uterin.
2. Materiale și metode
2.1. Prepararea FVG
cele șase medicamente pe bază de plante au fost extrase de trei ori cu apă clocotită și precipitate cu alcool la 70% (v/v) etanol. Supernatantul a fost concentrat cu vaporizatorul rotativ la o densitate relativă de 1,30-1,35 (50 C) pentru a obține extracția Feilin (FE, 5,62 g/g). Baza de gel a fost amestecul de carbopol 941 și gumă de xantan. Extracția a fost amestecată cu baza de gel pentru a obține FVG. Încărcarea medicamentului cu FVG a fost de 2,5 g/g, 1,25 g/g și 0,625 g/g.
2.2. Tulpinile bacteriene și Celula Gazdă
Chlamydia trachomatis mouse-ul pneumopatie tulpina Nigg II (ATCC® VR-123™), Escherichia coli (ATCC® 25922™) și Staphylococcus aureus (ATCC® 25923™) au fost obținute de la American Type Culture Collection. E. coli și S. aureus au fost cultivate în bulion de nutrienți. Linia de celule epiteliale de col uterin uman HeLa (ATCC CCCCL-2 XV) a fost achiziționată din colecția de Cultură a Academiei Chineze de științe medicale și cultivată în mediul RPMI 1640 care conține 10% FBS la 37 CTC în prezența a 5% CO2. C. trachomatis N a fost propagat în celulele HeLa. Înainte de infecție, celulele hela infectate (105 celule/mL) au fost perturbate și centrifugate. Supernatantul a fost colectat pentru a obține corpuri elementare purificate (EBs), care pot fi utilizate pentru a infecta direct șoarecii și celulele HeLa.
2.3. Infecții și tratament la animale
120 de șoareci balb / c femele (18-20 g) au fost achiziționate de la Charles River Laboratories China (Beijing, China). Animalele au fost adăpostite într-o instalație pentru animale cu barieră BSL2. Toate procedurile experimentale pe animale descrise aici au fost cu permisiunea Institutului Academiei Chineze de științe medicale chineze, Chinese Materia Medica, Comitetul etic. Numărul de referință al aprobării etice este 20162019.
țesutul cervical al șoarecilor BALB / c a fost rănit cu ac unghiular sub anestezie. Șoarecii au fost apoi inoculați cu 50 ilqutl de C. trachomatis N sau amestecul de E. coli și S. aureus (109 CFU/mL). Șoarecii au fost infectați o dată pe zi și repetați timp de trei zile. La 24 de ore după ultima infecție, FVG a fost administrat în vaginul șoarecelui cu ajutorul pipetei (volumul de FVG a fost controlat cu atenție) la doza de 2,2 g/kg, 1,1 g/kg și 0,55 g/kg timp de 12 zile. Supozitoarele Policresulen (PS), ca control pozitiv, au fost amestecate cu bază de gel și administrate în doză de 16,5 mg/kg timp de 12 zile. Grupul de control și grupul model au primit un volum egal de bază de gel. În , , și ziua tratamentului, mucusul cervical a fost colectat cu tamponul. În ziua 15, șoarecii au fost anesteziați, au fost prelevate probe de sânge din aorta ventralis și serul a fost separat. Șoarecii au fost apoi uciși de luxația cervicală sub anestezie, iar colul uterin și vaginul au fost îndepărtate. Schema timpului experimental a fost prezentată în Figura 1.
2.4. Analiza ELISA A C. trachomatis n, IL-2, IL-17 și MCP-1
tampoanele cu mucus cervical au fost dispersate cu un volum egal de PBS, nivelul C. trachomatis N în PBS a fost analizat cu enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit (Meilian, Shanghai, China) în conformitate cu instrucțiunile producătorului (se adaugă 50 µL de probă și 50 µL de detecție a anticorpilor în fiecare godeu și se incubează la 37°C timp de 1 oră; se spală godeurile, se adaugă 100 µL de HRP conjugat în fiecare godeu și se incubează la 37°C, timp de 0,5 ore; se spală godeurile, se adaugă 50 µL de substraturi cromogene în fiecare godeu, și se incubează la 37°C, timp de 0,5 ore; se adaugă 50 µL de soluție de stopare în fiecare godeu; citește absorbanța fiecărei bine la 450 nm). Nivelurile de ser IL-2, IL-17 și MCP-1in au fost determinate de Elisa kit (Meilian, Shanghai, China) conform instrucțiunilor producătorului, așa cum este descris mai sus.
2.5. Analiza RT-PCR a C. trachomatis n
ARN Total a fost extras din colul uterin folosind TRIzol (Invitrogen, California, SUA); expresia genelor țintă a fost analizată folosind un singur pas SYBR Prime Script RT-PCR Kit II (TaKaRa, Beijing, China) cu Piko Real 96 (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, SUA). Grundurile au fost utilizate după cum urmează: 16S rRNA forward primer, 5 ‘- ACC CGT TGG ATT TGA GCG TA-3′; 16S rRNA reverse primer, 5′-GTT GAG CCC CGA GAT TTG AC-3′; gapdh forward primer, 5′-GCT GAG TAT GTC GTG GAG T-3′; gapdh reverse primer, 5′-GTT CAC ACC CAT CAC AAA C-3’. Expresia relativă a genei C. trachomatis N și a genei de șoarece a fost calculată conform metodei.
2.6. Examinarea histologică
țesuturile șoarecilor au fost fixate cu formaldehidă 10%, apoi încorporate în parafină și tăiate în felii pentru colorarea hematoxilinei și eozinei. Secțiunile au fost evaluate vizual de DMLB (Leica Camera AG, Wetzlar, Germania); din fiecare probă au fost pregătite două secțiuni. Pentru clasificarea modificărilor patologice au fost aplicate următoarele criterii.
„-” epiteliul cervical și vaginal nu prezintă hiperplazie și nici o inflamație și țesuturile sunt normale.
„+” epiteliul cervical și vaginal au hiperplazie ușoară; țesutul conjunctiv are o inflamație segmentară ușoară.
„++” epiteliul cervical și vaginal au hiperplazie; țesutul conjunctiv a fost infiltrat de celulele inflamatorii.
„+++” colul uterin și epiteliul vaginului au hiperplazie semnificativă și au fost infiltrarea celulelor inflamatorii; țesutul conjunctiv a fost înconjurat de inflamație difuză și congestie vasculară.
2.7. Infecția cu celule gazdă și pata de Incluziune
celulele HeLa au fost însămânțate în placă cu 6 puțuri cu densitatea de 2 celule 105 / puț și cultivate timp de 48 h. apoi celulele au fost incubate cu C. trachomatis n EBs conținut mediu. Placa a fost centrifugată la 32 CTF pentru 1h și cultivată continuu la 37 CTF în prezența a 5% CO2 pentru 2h. mediul celulelor infectate a fost înlocuit cu FE (500, 250 și 125 CTF/mL) conținut mediu și incubat pentru încă 48 h. După aceea, celulele au fost spălate cu PBS, fixate cu metanol și colorate cu Giemsa. Incluziunile din celulele HeLa au fost capturate de IX71 (Olympus, Tokyo, Japonia) și enumerate.
2.8. Analiza statistică
analizele statistice au fost efectuate cu ajutorul GraphPad Prism v. 6 (GraphPad Software, California, SUA). Toate datele au fost distribuite în mod normal (testul Kolmogorov-Smirnov). Numărul de incluziune și scorurile histologice au fost analizate cu testul U Mann-Whitney; altele au fost analizate cu testul t nepereche. O valoare a lui p < 0,05 a fost considerată semnificativă.
3. Rezultate
3.1. FVG inhibă nivelul de C. trachomatis n în mucusul Cervical
EBs de C. trachomatis germinează și formează RBs după invadarea celulelor gazdă. RBs începe să se înmulțească după 7-21 de zile. Imunotestul enzimatic este o metodă noncultură frecvent utilizată pentru a diagnostica infecția cu chlamydia . Am analizat nivelul de C. trachomatis n în mucusul cervical pentru a evalua severitatea infecției șoarecilor.
în stadiul incipient al infecției cu C. trachomatis N, nu s-a observat nicio modificare semnificativă a încărcăturii bacteriene. La 10 zile după prima infecție, creșterea C. trachomatis N la șoareci ar putea fi testate. În ziua respectivă, nivelul încărcăturii bacteriene a fost semnificativ mai mare decât grupul de control (Figura 2(a)). Cu tratamentul succesiv al FVG (2,2, 1,1, 0,55 g/kg), nivelul de C. trachomatis n la șoareci mucusul cervical ar putea fi puternic inhibat în maniere dependente de doză(figurile 2(c) și 2 (d)).
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
3.2. FVG inhibă sarcina C. trachomatis N în colul uterin
în diagnosticul infecției cu chlamydia, tehnica de amplificare a acidului nucleic, inclusiv reacția în lanț a polimerazei (PCR), este mai sensibilă și mai specifică decât testul imunologic enzimatic . Prin urmare, am testat în continuare sarcina C. trachomatis N la cervixul șoarecilor cu metoda RT-PCR. În ziua 15, expresia ARNr 16S A C. trachomatis N la șoareci a fost semnificativ mai mare decât grupul de control (Figura 3). Tratamentul GFV (2,2, 1,1 g/kg) timp de 12 zile ar putea inhiba puternic sarcina de C. trachomatis N în colul uterin (Figura 3).
3.3. FVG diminuează C. trachomatis cervicita indusă de N și vaginita
infecția cu C. trachomatis la șoareci este un model adecvat pentru studierea infecțiilor tractului genital. Infecția nu reușește să inducă patologia genitală severă a tractului superior . Patologia colului uterin și a vaginului a fost analizată pentru a caracteriza severitatea infecției cu C. trachomatis N.
după cum se arată în Figura 4, în grupul de control, celulele epiteliale și țesutul conjunctiv al colului uterin au fost normale, nu s-a observat hiperplazie sau inflamație. În grupul model, straturile epiteliale de col uterin au hiperplazie, iar celulele inflamatorii au fost infiltrate în epiteliu și țesutul conjunctiv. După tratamentul FVG (1,1 g/kg), leziunea patologică a colului uterin ar putea fi redusă semnificativ (Figura 4).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
după cum se arată în Figura 5, în grupul de control, epiteliul vaginal a fost normal, nu s-a observat hiperplazie sau inflamație. În grupul model, straturile epiteliului vaginal au hiperplazie, iar celulele inflamatorii au fost infiltrate în țesutul epitelial. După tratamentul FVG (2,2, 1,1 g/kg), leziunea vaginului ar putea fi redusă semnificativ (Figura 5).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
3.4. FVG reduce răspunsurile citokinelor serice ale infecției cu C. trachomatis n
citokinele pot fi eliberate de celulele epiteliale și celulele imune după infecția cu C. trachomatis, majoritatea provenind din celulele Th1. Aceste citokine contribuie la răspunsurile imune, dar induc deteriorarea patologică . Nivelurile de citokină din ser au fost testate pentru a susține rezultatele examinării histologice. În această zi, nivelurile de IL-2, IL-17 și MCP-1 au fost semnificativ reglate (Figura 6). Trei doze de FVG ar putea inhiba în mod eficient eliberarea IL-17 și MCP-1. Producția de IL-2 ar putea fi reglată în jos de FVG la doze mici (1,1 și 0,55 g/kg).
(a)
(B)
(c)
(a)
(B)
(c)
3.5. FVG reduce numărul de Incluziune indus de C. trachomatis n In Vitro
proliferarea C. trachomatis are loc în celulele gazdă cu formarea RBs. Includerea poate fi formată la aproximativ 12 ore după infecție, care conține un număr de RBs . Inhibarea in vitro a GFV asupra infecției cu C. trachomatis N a fost evaluată cu numărul de includere. După ce celulele HeLa au fost incubate cu C. trachomatis n timp de 48 de ore, incluziunile au putut fi observate cu pata Giemsa. După tratamentul cu FVG (FE), numărul de includeri a fost reglat în mod semnificativ într-o manieră dependentă de doză (Figura 7).
3.6. FVG Reduce leziunea patologică a colului uterin indusă de E. coli și S. aureus
chiar dacă C. trachomatis este raportat a fi cel mai frecvent agent patogen al cervicitei, anaerobii precum E. coli, S. aureus și Klebsiella pneumoniae ar putea fi izolați la pacienții cu cervicită . Un model de cervicită de șobolan infectat cu amestecul de E. coli, S. aureus și N. gonoree a fost stabilit în lucrarea noastră anterioară . În cercetarea de față, a fost optimizat un model de șoareci infectat cu amestecul de E. coli și S. aureus. La 14 zile după prima infecție, colul uterin sa dovedit a fi grav infectat.
în grupul de control, epiteliul cervical a fost normal și nu a fost observată hiperplazie sau inflamație. În grupul model, straturile interioare ale epiteliului cervical au hiperplazie, iar celulele inflamatorii (neutrofile și eozinofile) au fost puternic infiltrate în țesutul epitelial. După tratamentul FVG (2,2 și 1,1 g/kg), inflamația colului uterin ar putea fi inhibată semnificativ (figura 8).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
4. Discuție
diagnosticul cervicitei este dificil din cauza lipsei simptomului evident. La unii pacienți, s-au observat secreții mucopurulente anormale și ectopie cervicală . Multe modele de cervicită la mamifere au fost stabilite în ultimele decenii. Macacii, șobolanii și șoarecii ar putea fi utilizați pentru a stabili modelul cervicitei. Atât bacteriile (C. trachomatis), cât și compușii chimici (fenol, acid acetic) ar putea fi utilizați pentru a induce cervicita . În această cercetare, două modele de mouse au fost optimizate. După infecția cu C. trachomatis N, încărcătura bacteriană a C. trachomatis n în mucusul cervical a fost crescută continuu în timp. Infecția cu C. trachomatis N ar putea duce la reglarea în sus a citokinelor din ser și la inflamația țesuturilor vaginului și colului uterin. După infecția cu amestecul de E. coli și S. aureus, leziunea colului uterin ar putea fi detectată în diagnosticul patologic.din punct de vedere clinic, antibioticele au fost prima alegere pentru tratarea cervicitei în funcție de diferiți agenți patogeni. Dar apariția unor rezistente la antibiotice, cum ar fi C. trachomatis rezistente la chinolone și N. gonoreea, S. aureus rezistent la meticilină și E. coli rezistent la vancomicină devin o problemă gravă la nivel mondial din cauza abuzului de antibiotice . TCM poate contribui la strategii alternative pentru tratamentul cervicitei. Efectele FVG asupra cervicitei au fost testate în această cercetare.
FVG este un gel vaginal, a cărui bază de gel este amestecul de carbopol 941 și gumă de xantan . În ultimii ani, multe preparate comerciale cu gel vaginal cu formulă pe bază de plante chinezești au fost utilizate pentru a trata cervicita . Livrarea vaginală a medicamentelor este o cale tradițională de livrare a medicamentelor mucoase, care poate fi utilizată atât pentru tratamentul bolilor locale, cât și sistemice . Preparatele tradiționale, cum ar fi supozitoarele, gelurile, tabletele, filmele vaginale, irigațiile și pesarii pot fi utilizate ca formulări vaginale . Fiind unul dintre cele mai utilizate sisteme de administrare a medicamentelor, gelurile vaginale au fost utilizate pentru prepararea microbicidelor, contraceptivelor, inductorilor de muncă și hormonilor sexuali. Comparativ cu alte sisteme de administrare a medicamentelor, gelul vaginal este mai sigur și are o biodisponibilitate mai mare .
toate cele șase medicamente pe bază de plante din FVG pot fi utilizate în tratarea bolilor ginecologice în TCM . Conform teoriei TCM, în această formulă, rizomul Gentianae radix et este „medicamentul monarh” sau „medicamentul principal”, cortexul stemonae radix și fraxini sunt „medicamentul ministerial” sau „medicamentul asistent”, Paeoniae radix rubra și cortexul Dictamni sunt „medicamentul adjuvant”, iar rizomul Glycyrrhizae radix et este „medicamentul călăuzitor”. Rizomul Gentianae radix et poate contribui cel mai mult la efectele FVG. Iridoidele și glucozidele totale ale bujorului sunt izolate în principal din Gentianae radix et rhizoma și, respectiv, Paeoniae radix rubra. Acești compuși prezintă efecte antiinflamatorii semnificative . Alcaloizii și limonoidele contribuie la activitatea antibacteriană a cortexului Dictamni . Cumarinele din cortexul Fraxini și flavonele din Glycyrrhizae radix et rhizome prezintă efecte antibacteriene și antiinflamatorii . Alcaloizii contribuie la activitatea insecticidă a stemonae radix . Acești compuși bioactivi ai acestor medicamente pe bază de plante pot sprijini tratamentul GFV asupra cervicitei.
IL-17 este produs de celulele Th17 în mod caracteristic. Din punct de vedere clinic, concentrația de IL-17 în secrețiile genitale ale pacienților infectați cu C. trachomatis este semnificativ mai mare decât cea a femeilor neinfectate . Nivelul ridicat de IL-17 în modelul cervicitei de șoarece a fost în concordanță cu rezultatul clinic. Nivelurile de IL-2 și MCP-1 sunt asociate cu răspunsurile Th1. IL-2 este secretat din celulele Th1 și stimulează producerea de citokine. Există o corelație inversă între nivelul MCP-1 și răspunsurile Th1. Inhibarea MCP-1 poate crește producția de IFN-XV . FVG ar putea regla în jos concentrațiile de IL-2, IL-17 și MCP-1. Aceste rezultate au sugerat că FVG ar putea inhiba cervicita prin reglarea răspunsurilor imune ale gazdei.
la începutul ciclului de infecție C. trachomatis, sistemul de secreție de tip III permite EBs să invadeze celulele gazdă . Internalizarea C. trachomatis este urmată de dezvoltarea RBs și a incluziunilor. Inhibitorul sistemului de secreție de tip III ar putea bloca formarea incluziunilor . Investigația in vitro a demonstrat că GFV poate inhiba numărul de incluziuni în celulele HeLa.
În concluzie, am stabilit cu succes două modele de cervicită de șoarece cu infecția C. trachomatis N, S. aureus și E. coli. Am demonstrat că GFF poate inhiba semnificativ cervicita. FVG ar putea regla în jos încărcătura bacteriană, atenua leziunea patologică și reduce numărul de includeri. Efectele GFV au fost asociate cu inhibarea agenților patogeni și reglarea răspunsurilor imune ale gazdei. Această cercetare oferă dovezi că FVG ar putea fi utilizat ca un agent alternativ nou care ameliorează problema rezistenței la antibiotice în timpul tratamentului cervicitei.
disponibilitatea datelor
datele utilizate pentru a susține rezultatele acestui studiu sunt incluse în articol.
conflicte de interese
autorii nu au niciun conflict de interese legat de această lucrare.
contribuțiile autorilor
Xin Mao și Ronghua Zhao au contribuit în mod egal la această lucrare.
mulțumiri
acest studiu a fost susținut de Fundația Națională de științe Naturale din China (nr. 81773977 și 81774204).
