imunoterapia sistemică agonistă a cancerului induce expansiunea diferențială a limfocitelor T CD4 și CD8 în organele limfoide și periferice

s-a demonstrat că combinația anti-CD40 cu IL-2 induce creșterea și regresia întârziată pe mai multe modele tumorale murine . Similar datelor publicate folosind modele tumorale de linie celulară, tratamentul modelului neoplazie intraepitelială mamară (MIN-O), o linie de transplant de țesut, cu imunoterapie anti-CD40 și IL-2 (IT) a condus la răspunsuri antitumorale semnificative (P = 0,0057), inclusiv regresie în >50% din șoarecii tratați (fișier suplimentar 1: Figura S1A). Studiile anterioare au arătat că aceste răspunsuri anti-tumorale se datorează celulelor T CD8, prin urmare am evaluat fenotipul celulelor T în splină, precum și în interiorul tumorii și plămânilor (un sit metastatic comun pentru multe modele tumorale diferite). În timp ce am observat că terapia a indus în general expansiunea CD8 în toate organele, am observat unele diferențe în fenotipul memoriei celulelor T CD8 în situsurile organelor (fișier suplimentar 1: Figura S1B-C).

noi și alții au arătat anterior că Terapiile imunostimulatoare puternice pentru cancer induc proliferarea puternică a celulelor T de memorie (CD44high) CD4 și CD8 în splină și ganglionii limfatici . S-a observat, de asemenea, că celulele T CD4, dar nu CD8, suferă, de asemenea, moartea celulară indusă de activare într-un mod dependent de interferon(IFN) – XV, rezultând o expansiune globală nesemnificativă a celulelor T CD4 prin numere în aceleași organe comparativ cu valoarea inițială . Aceste date au fost generate folosind citirea organelor limfoide. Cu toate acestea, având în vedere fenotipurile observate la Min-o, șoarecii tratați cu imunoterapie, expansiunea, activarea și apoptoza celulelor T activate pot fi afectate diferențiat în țesuturile periferice. Prin urmare, am căutat să caracterizăm și să comparăm în continuare activarea celulelor T în organele periferice (unde pot locui tumorile primare și/sau leziunile metastatice) și organele limfoide secundare (care sunt adesea chestionate în timpul studiilor imunoterapeutice pentru a evalua mecanismele de acțiune). Am evaluat frecvența celulelor T CD8 și CD4 (Foxp3neg), expansiunea și apoptoza sistemic atât în organele limfoide, cât și în cele periferice. În concordanță cu rapoartele anterioare ale grupului nostru, fără a modifica în mod semnificativ frecvența lor generală (Fig. 1A), imunoterapia anti-CD40 / IL-2 a dus la o expansiune semnificativă a numărului total de celule T CD8 în spline și ganglioni limfatici (Fig. 1b). În conformitate cu creșterea numărului total de CD8, frecvența celulelor T CD8 care au încorporat bromodeoxiuridina (BrdU) in vivo a fost semnificativ extinsă, iar proporția celulelor apoptotice, evaluată prin expresia extracelulară a Anexinei V, nu a fost semnificativ diferită de cea din grupul de control (Fig C-D). În schimb, frecvența totală a celulelor T CD4 a scăzut și numărul nu s-a modificat semnificativ în comparație cu controalele din cadrul acelorași organe (Fig. 1a-b). În timp ce celulele T CD4 se extindeau, așa cum a fost evaluat prin încorporarea BrdU, o proporție semnificativă dintre ele treceau și prin apoptoză (Fig. 1c-d) rezultând o modificare netă nesemnificativă a numărului total. Aceste date au fost în concordanță cu cele observate anterior . Când am evaluat organele non-limfoide, inclusiv plămânii și ficatul, am observat tendințe similare atât în celulele T CD4, cât și în celulele T CD8, și anume că celulele T CD8 se extind și supraviețuiesc în toate organele care o urmează (Fig. 2a-b) în timp ce celulele T CD4 (Foxp3neg) se extindeau și treceau simultan prin apoptoză într-o măsură similară, rezultând modificări nesemnificative atât ale frecvențelor, cât și ale numerelor lor (Fig. 2c-d) în periferie.

fenotipurile memoriei celulelor T variază între organele limfoide secundare și țesuturile periferice non-limfoide din celulele T CD8, dar nu și celulele T CD4 care o urmează

la șoareci, celulele T CD4 și CD8 pot fi clasificate în continuare în memorie și fenotipurile na cu populația cd44lowcd62l+ considerată na oktve (TN), populația cd44highcd62l+ considerată memorie centrală (TCM) și populația cd44highcd62lneg considerată memorie efectoare și/sau efectoare (te/em). Se știe că celulele T CD4 și CD8 diferă în distribuția acestor subseturi în organele limfoide și periferice. În timp ce frecvențele na-uri în cadrul populațiilor CD4 și CD8 rămân relativ similare, populația CD44high este o memorie mai Centrală înclinată în celulele T CD8 și memoria efectoare înclinată în celulele T CD4 într-un organism în repaus . Cu toate acestea, în organele periferice, celulele T rezidente în țesuturi atât în subseturile celulelor T CD4, cât și în CD8 sunt predominant din fenotipul memoriei efectoare .

studiile anterioare au arătat că celulele fenotipice ale memoriei (CD44high) sunt principalul tip de celule care se extind în urma imunoterapiilor stimulatoare . Pentru a înțelege mai bine compoziția celulelor T CD4 și CD8 în diferite organe, am evaluat starea fenotipului de memorie în fiecare organ care o urmează. În repaus, populația CD44high de celule T CD8 din organele limfoide a fost predominant TCM (>90%), în timp ce în organele periferice, a fost o combinație cu ~60% TCM (Fig. 3a, c, e, – f). În general, rezultă o expansiune generală a frecvenței CD44high în toate organele. Frecvențele TCM au fost fie neschimbate, fie ușor crescute, în timp ce populațiile TE/EM s-au extins semnificativ (Fig. 3e-f) de la ~10% la 30% în organele limfoide și, impresionant, de la ~30-85% în organele periferice.

în populația CD44high a celulelor T CD4, șoarecii în repaus au fost mai puternic înclinați spre fenotipul TE/EM cu aproximativ 60-70% în limfoid și 75-95% în țesuturile periferice (Fig. 3b, d). Așa cum s-a întâmplat în celulele T CD8, în urma acesteia proporția CD44high s-a extins, dar datorită faptului că a fost atât de puternic înclinată spre fenotipul TE/EM în toate organele la șoarecii în repaus, frecvențele CD4 te/EM au fost în mare parte consistente la toate organele din șoarecii tratați cu acesta (Fig. 3e). Frecvențele TCM CD4 au rămas relativ scăzute și consistente la toate organele, atât pre – cât și post-IT (Fig. 3f).

expresia markerilor de activare în celulele T CD4 și CD8 depinde de locația și fenotipul de memorie

pe lângă diferențele de proliferare și apoptoză, am observat, de asemenea, în mod obișnuit că celulele T CD4 și CD8 reglează în mod diferențiat moleculele de activare și inhibitoare care o urmează. Cel mai notabil exemplu în acest sens este PD-1 care, pe baza studiilor axate pe organele limfoide secundare (splină și LN), a fost reglat în mod preferențial pe CD4 și nu pe celulele T CD8 și se crede că este probabil implicat în procesul preferențial AICD care a avut loc în CD4, dar nu în celulele T CD8 care îl urmează . Un alt exemplu ar fi reglarea preferențială a NKG2D pe celulele T CD8, dar nu CD4 care conferă capacitate litică indusă de spectator după expunerea puternică la citokine la subsetul CD8 de memorie. Studiile anterioare efectuate de laboratorul nostru, precum și datele prezentate în Fig. 3 au arătat că printre celulele T CD4 și CD8, celulele primare care proliferează activ și răspund la acestea sunt celulele fenotipice cu memorie CD44high . Prin urmare, ne-am concentrat pe această populație.

în populația CD44high, s-a demonstrat că celulele T CD8 proliferante nu reușesc să regleze în sus markerii în concordanță cu activarea de către un stimul specific antigenului, cum ar fi CD25 și PD-1, dar reglează în sus markerii care le permit să dobândească un fenotip trecător, și anume NKG2D, conferind capacitatea de a acționa mai mult într-o manieră nerestricționată a antigenului NK. În schimb, celulele CD44HIGH, proliferante (Foxp3neg) CD4 T reglează în mod disproporționat PD-1 (spre deosebire de celulele T CD8 și Foxp3+, celulele T CD4 reglatoare) pe care le-am sugerat le permite să fie direcționate preferențial pentru inducerea apoptozei . În concordanță cu aceste rapoarte anterioare, am observat fenotipuri similare în rândul celulelor T cd44highcd8+ rezidente splenice și limfatice, tratate IT, care au reglat semnificativ NKG2D, dar nu PD-1 (Fig. 4A, c) și celulele T CD44highCD4+, care au reglat puternic PD-1, dar nu NKG2D (Fig. 4b, d). Când am evaluat aceiași markeri fenotipici la populațiile de celule T rezidente la organele periferice, non-limfoide, fenotipul celulelor T CD44highCD8+ a fost considerabil diferit de cel al celor rezidente la organele limfoide secundare. În timp ce celulele T CD44highCD8+ rezidente la plămâni și ficat erau încă nkg2d+CD25neg (Fig. 4A, c), frecvența celulelor NKG2D+ în această populație părea să crească de la 20-30% în organele limfoide la 40-50% în organele periferice (Fig. 4a). Mai mult, spre deosebire de organele limfoide în care expresia PD-1 a fost neschimbată, expresia PD-1 a fost crescută semnificativ atât în plămâni, cât și în ficat, în urma acesteia în populația CD44highCD8+ (Fig. 4c). În schimb, fenotipul celulelor T CD44highCD4 a fost remarcabil de similar cu celulele T CD4 ale splinei și ganglionilor limfatici din toate organele (Fig. 4B, d) cu o expresie comparabilă a PD-1 și o reglare superioară minimă a NKG2D. CD25 nu a fost reglată în sus în celulele T CD4 sau CD8 în niciun loc (datele nu sunt afișate). Acest lucru a fost neașteptat, deoarece am sugerat anterior că expresia diferențială a PD-1 a fost probabil mecanismul de bază al inducerii diferențiale a apoptozei între celulele T CD4 și CD8 după regimuri IT puternice, imunostimulatoare. Cu toate acestea, în organele periferice, celulele T CD4 continuă să fie afectate disproporționat de apoptoză, în ciuda faptului că expresia PD-1 este comparabilă între celulele T CD4 și CD8. Acest model care a apărut a fost, de asemenea, interesant, deoarece expresia crescută a markerului de activare în periferie părea să se coreleze direct cu predominanța TE/EM, în special în cazul PD-1.

s-a demonstrat recent că celulele te/EM circulante exprimă niveluri ridicate de PD-1 la oameni în repaus . Prin urmare, am emis ipoteza că celulele CD8+ TE/EM pot exprima preferențial acești markeri de activare față de CD8+ TCM, rezultând frecvențe diferențiale ale celulelor T CD44highCD8+ care exprimă markeri de activare în organele limfoide secundare și periferice care o urmează. Prin urmare, am evaluat expresia NKG2D și PD-1 pe celulele CD8 + CD44highCD25neg TE/EM și TCM din toate organele la șoareci în repaus și tratați cu IT. La șoarecii de control, ambele NKG2D (Fig. 5a) și PD-1 (Fig. 5c) au fost exprimate la o frecvență mai mare pe subsetul TE/EM al populației CD8+CD44highCD25. Cu toate acestea, frecvența generală a populației TE/EM în rândul celulelor T CD8+ la șoarecii în repaus este relativ scăzută în comparație cu TCM (diagrame plăcintă Fig. 5a), prin urmare, în general, expresia atât a PD-1, cât și a NKG2D este predominant scăzută (Fig. 4) deoarece TCM reprezintă majoritatea celulelor T CD8+ în repaus. La șoarecii tratați cu imunoterapie, atât expresia NKG2D, cât și PD-1 au fost crescute la toate organele (Fig. 4). Încă o dată, ambele NKG2D (Fig. 5b) și PD-1 (Fig. 5d) au fost exprimate mai mult pe celulele T te/EM CD8+ decât celulele T TCM CD8+. În organele limfoide, unde populația TE / EM s-a extins în comparație cu controlul, a fost încă semnificativ mai mică decât celulele CD8+ TCM (diagrame plăcintă, Fig. 5b) rezultând extinderi mai puțin semnificative la aceste site-uri. Spre deosebire de organele limfoide, celulele CD8+ TE/EM alcătuiau majoritatea organelor periferice testate (diagrame, Fig. 5b) făcând astfel expresia generală a NKG2D și PD-1 semnificativ mai mare în aceste locuri. Din nou, este important de menționat că în organele limfoide ale șoarecilor tratați cu imunoterapie, expresia generală a ambilor markeri de activare a fost semnificativ mai mică decât în organele periferice datorită înclinării TCM în limfatica peste periferie în populația CD8. Nivelurile de Expresie nu au variat foarte mult între TE/EM de la diferite organe (nu au existat diferențe semnificative între organele limfoide și periferice) în cadrul acelorași grupuri de tratament, dar au crescut în general în rândul celor tratați cu IT comparativ cu martor, tendință care a fost mai pronunțată cu NKG2D decât PD-1 (Fig. 5). În schimb, expresia markerului de activare TCM a rămas relativ constantă nu numai în rândul organelor de la șoareci din cadrul unui grup de tratament, ci și între grupurile de control și cele tratate cu IT (Fig. 5a-b). Luate împreună, aceste date sugerează că constituirea bazinului de memorie/activat (TCM vs TE/EM) cântărește foarte mult asupra fenotipului populației de celule T activate, în special cu celulele T CD8, deoarece constituția lor variază foarte mult între organele limfoide și non-limfoide.

evaluarea celulelor T de la pacienții cărora li s-a administrat terapie imunostimulatoare sistemică în doze mari

în continuare am vrut să evaluăm dacă aceste rezultate s-au tradus la pacienții umani care au primit terapii imunostimulatoare pentru cancer. În prezent, nu există studii care să evalueze combinația agonistă anti-CD40 cu IL-2 uman recombinant, cu toate acestea, am comparat în mod obișnuit terapia noastră combinată cu alte tratamente imunostimulatoare sistemice, inclusiv agoniști TLR cu doze mari și terapii cu citokine sistemice cu doze mari și am prezentat modificări fenotipice și funcționale similare celulelor T, așa cum se observă în modelul nostru preclinic . Pentru a evalua dacă pacienții din clinică au prezentat modificări similare în expresia markerului de suprafață, am colectat celule mononucleare din sângele periferic (Pbmc) de la pacienții cu melanom metastatic supuși terapiei sistemice cu doze mari de IL-2. Pacienții au primit 6×10 ^ 5 UI/Kg la fiecare 8 ore pentru un total planificat de 14 doze. Probele de PBMC au fost colectate cu o zi înainte de începerea tratamentului (la momentul inițial) sau în ziua 8 a primului ciclu de tratament (ZIUA 8) pentru a evalua fenotipul celulelor T. Comparând probele inițiale și cele din ziua 8, a existat o creștere semnificativă a fenotipului de memorie PD-1+ (CD45RO+) atât în subseturile de celule T CD4, cât și în CD8, după terapia cu doze mari de IL-2 (Fig. 6a-c). Când această populație a fost împărțită în continuare în memorie centrală (CD62L+) și memorie efectoare/efectoare (CD62L-) la punctul de timp al Zilei 8, subsetul de memorie efectoare/efectoare a exprimat o expresie PD-1 semnificativ mai mare decât subsetul de memorie centrală (Fig. 6d-e). Împreună, aceste date se corelează cu ceea ce a fost observat în studiile murine, sugerând că aceste date sunt aplicabile studiilor la om și pot fi un indicator al ceea ce se întâmplă local.