contribuit de Paul Barber
extracția ADN-ului prin Chelex
Chelex este cunoscut pentru a fi la fel de nestatornic, deoarece este ieftin și ușor. Iată câteva sfaturi pentru amplificări bune: 1. Uneori eșantionelucrați cel mai bine dacă este utilizat imediat, uneori este mai bine să așteptați peste noapte înainte de a le utiliza. Experimentați și găsiți ceea ce funcționează pentru specia dvs. Rezultatele pot varia în funcție de taxoni.2. Când faci pcrs inițială, face o diluare în serie a șablonului.Cantitatea de extracție a ADN-ului Chelex utilizată într-un PCR poate fi de până la jumătate din volumul PCR sau de până la 1 microlitru dintr-o diluție de 1:10.000. Mi se pare că 1 microlitru de 1:1 este bun pentru cele mai multe aplicații.3. Dacă nu obțineți amplificări de la PCR prima dată cu un extract de Chelex, repetați procedura Vortex, spin, incubate, vortex, spin, sit overnight descrisă mai sus. Adesea, acest lucru va face o lucrare PCR negativă.
metoda
- cu înălbitor, sterilizați o spatulă de reactiv uscat și o mică bară magnetică de agitare.
- se prepară o suspensie de 5-10% din greutate de rășină Chelex100 (partea Biorad 143- 3832,100-200 mesh Chelex, formă de sodiu) și apă HPLC sterilizată UV. Cel mai eficient mod de a face acest lucru este să luați un tub falcon steril de 50 ml, să îl așezați pe o scară în interiorul unui pahar mic și să zero scala. Apoi adăugați 5 grame de Chelex și umpleți până la 50 ml cu apă.
precizia nu este critică. Tehnica sterilă este.
- așezați stirbar steril în tub și puneți-l pe agitator magnetic. Chelex se stabilește rapid, astfel încât dacă suspensia nu este bine amestecată, concentrațiile și rezultatele dvs. vor fi variabile. Păstrarea suspensie bine amestecat, alicota 300-500micro litri în 0,6 sau 1,6 ml eppendorf tuburi (din nou, steril) și capac imediat. Dacă aveți acces la o hota flux laminar, care este un loc bun pentru a face toate acestea. Poate doriți să ștergeți cântarul și agitatorul cu o soluție de înălbitor de 10% și/sau sterilizați UV înainte de utilizare.
- porniți blocul de încălzire. Setați la 95 C. C. umpleți găurile cu apă.
- folosind forceps steril (flacără peste arzător de alcool de mai multe ori pentru a steriliza), scoateți o bucată mică de țesut din eșantion. Această bucată de țesut ar trebui să fie suficient de mare pentru a fi vizibilă, dar nu atât de mare încât să fie ușor vizibilă. Imaginați-vă tăierea unei secțiuni de 0,2 mm a unei capse standard. E destul de mare. Prea mult țesut vă poate inhiba reacțiile.
sterilizați forcepsul între probe.
- când ați terminat, faceți un control Chelex negativ prin scufundarea forcepsului sterilizat într-un tub de suspensie Chelex.
- eșantion Vortex și suspensie chelex timp de 10-15 secunde.
asigurați-vă că capacele sunt fixate bine înainte de a începe.
- probe de Spin scurt la viteză mare într-un microcentrifuge
- se incubează probele timp de 20 de minute la 95 de grade c
*temperatura blocului poate scădea ușor atunci când faceți acest pas. Această scădere este normală. Verificați tuburile în timpul incubării pentru a vă asigura că capacele nu s-au desprins.*
- probe Vortex din nou timp de 10-15 secunde.
atenție, deoarece aburul poate scoate capacul tubului centrifugei. Țineți capacele jos.
- tuburi de Spin din nou la viteză mare în microcentrifuge.
- probele sunt gata de utilizare.
utilizați supernate numai pentru reacțiile PCR. Șirag de mărgele Chlex va inactiva Taq!
această metodă se bazează, cu permisiune, pe un protocol original disponibil aici.
