rezultate

identificarea lanțului il-7 al receptorului IL-7 (CD127) ca Marker pentru celulele T de memorie. În timp ce căutam noi markeri pentru a defini subseturi de celule T efectoare și de memorie la șoarece, am analizat expresia de suprafață a receptorului IL-7 lanț/CD127 (Fig. 1a). În timpul răspunsurilor primare la Lm, subpopulațiile distincte ale populațiilor de celule T splenice specifice antigenului pot fi distinse pe baza nivelurilor de Expresie CD127. CD127 celule cu exprimare scăzută (CD127low) predomină în timpul fazei efectoare acute. Cu toate acestea, în timpul tranziției în faza celulei T de memorie, celulele CD127low dispar treptat, în timp ce populațiile care exprimă niveluri ridicate (CD127high) rămân remarcabil de stabile în dimensiune în timp (Fig. 1 a și c). Aceste valori cinetice distincte sugerează cu tărie că expresia CD127 este o caracteristică selectivă pentru celulele T de memorie cu viață lungă. În timpul fazei efectoare, celulele T CD127low CD8 + migrează preferențial către organele nelimfoide, în timp ce numai celulele T CD127high CD8+ sunt detectate în LN (Fig. 1b). Splina reprezintă un „organ intermediar” în care toate subpopulațiile diferite se găsesc devreme după imunizare (22, 23). Mai târziu, în timpul fazei de memorie, celulele T specifice antigenului din toate organele sunt caracterizate printr-un fenotip ridicat Cd127 (Fig. 1 b și c). Compararea capacităților celulelor T CD127low și CD127high antigen – specifice pentru a prolifera ca răspuns la stimulare a relevat diferențe izbitoare între cele două subseturi. Așa cum se arată în Fig. 1D, purificat Listeria-specifice Cd127celulele t ridicate proliferează rapid după stimularea anti-CD3, în timp ce celulele T CD127low proliferează slab. Este puțin probabil ca aceste diferențe de proliferare să reflecte un avantaj al celulelor CD127-pozitive prin stimularea IL-7R mediată de Ab, deoarece diferite clone mAb cu activitate cunoscută de activare sau blocare a CD127 au demonstrat același efect în testele de stimulare in vitro pe termen scurt (datele nu sunt prezentate).

pentru a demonstra mai direct că celulele T cu memorie de lungă durată sunt prezente exclusiv în compartimentul de înaltă exprimare CD127 devreme după amorsarea in vivo, am efectuat studii de transfer adoptiv utilizând o tehnică de colorare MULTIMER MHC reversibilă recent dezvoltată (21) pentru a izola funcțional celulele T specifice antigenului direct ex vivo. După transferul adoptiv al celulelor T specifice CD127high llo91-99 de la șoareci infectați timp de 10 zile cu Lm, celulele transferate au fost încă detectabile câteva săptămâni mai târziu în splina șoarecilor receptori naivi (Fig. 2a), în timp ce numerele de celule după transferul celulelor CD127low au fost la limita de detecție. Această observație nu s-a datorat diferențelor de migrare in vivo a celulelor CD127 High și CD127low transferate, deoarece am constatat diferențe similare pentru plămân (Fig. 2a) și alte organe (LN și ficat, datele nu sunt prezentate). Pentru a susține în continuare interpretarea că celulele T CD127high mențin exclusiv celulele de memorie specifice antigenului, șoarecii primitori au fost provocați după transferul adoptiv cu infecție cu Listeria. Din nou, numai la șoarecii care au primit Cd127celule t ridicate înainte de infecție a fost o expansiune rapidă a celulelor T specifice llo91–99 transferate detectabile (Fig. 2b). Din nou, acest rezultat nu s-a datorat diferențelor de migrare, deoarece menținerea sau extinderea celulelor T CD127low transferate nu a fost detectabilă în niciun alt organ (Fig. 2b și datele nu sunt afișate). Deși aceste rezultate din studiile de transfer adoptiv susțin cu tărie ipoteza că celulele T cu memorie de lungă durată sunt prezente exclusiv în compartimentul celulelor T CD127high, am observat, de asemenea, limitări substanțiale ale acestei abordări experimentale. În special, celulele T de memorie cu funcție efectoare imediată par a fi destul de sensibile la experimentele de transfer adoptiv și mor rapid după purificare și aplicare I.v.; deși supraviețuiesc de luni până la ani dacă sunt lăsate neatinse in vivo (11). Astfel, deși rezultatele noastre din transferul adoptiv sunt conforme cu interpretarea că CD127 este un marker pentru celulele T cu memorie de lungă durată, nu putem exclude faptul că problemele intrinseci privind supraviețuirea subpopulațiilor de celule T distincte contribuie, de asemenea, la rezultatul acestor experimente.

costul populațiilor de celule T specifice antigenului cu CD127 și CD62L permite discriminarea între subpopulațiile de celule T de memorie. Caracterizarea ulterioară a populației de celule T ridicate Cd127 a arătat că aceasta poate fi subdivizată în subpopulații care exprimă niveluri ridicate și scăzute de CD62L (Fig. 3). Analiza funcțională directă ex vivo (21) a celulelor T purificate (10-12 zile după infecție, când toate subpopulațiile sunt detectabile simultan în splină) a descoperit diferențe funcționale suplimentare. În timp ce subseturile de celule T CD62Llow prezintă activitate citolitică ex vivo viguroasă și imediată, celulele T CD127high/ CD62Lhigh demonstrează o liză foarte slabă a celulelor țintă acoperite cu peptide (Fig. 3). Colorarea intracelulară cu citokine a subpopulațiilor sortate a relevat faptul că celulele T CD127high/CD62Llow, precum subsetul CD127low/CD62Llow, produc citokinele efectoare INF-XV și factorul de necroză tumorală XV; în schimb, subsetul CD127high / CD62Lhigh produce IL-2, dar nu IFN-XV și factorul de necroză tumorală XV. Astfel, combinația marker de CD127 și CD62L permite identificarea subpopulațiilor de celule T cu caracteristici foarte asemănătoare cu cele descrise anterior la om. Celulele T CD127low / CD62Llow demonstrează toate caracteristicile cunoscute ale unei populații reale de celule T efectoare (TE, activitate proliferativă slabă, supraviețuire in vivo limitată și funcție efectoare imediată). Subsetul CD127high/CD62Lhigh se potrivește cu caracteristicile TCM, iar celulele T CD127high / CD62Llow se potrivesc descrierii TEM.

generarea de subpopulații distincte de celule T de memorie depinde de ajutorul celulelor T mediate de CD40L. Deoarece am considerat că ar putea fi problematic să se bazeze exclusiv interpretarea că expresia CD127 poate fi utilizată ca marker pentru a distinge între celulele T de memorie efectoare și de lungă durată pe experimentele de transfer de celule adoptive, am decis să analizăm liniile mutante ale mouse-ului cu defecte în generarea memoriei celulelor T. Dacă CD127 este într-adevăr un marker de celule T de memorie” timpuriu”, ar trebui să putem identifica diferențele în timpul punctelor de timp timpurii și târzii în cadrul subseturilor CD127-pozitive la șoarecii cu defecte de memorie.

deoarece studii recente au demonstrat importanța ajutorului celulelor T pentru generarea de răspunsuri de memorie de lungă durată (2-4), am decis să determinăm dacă prezența sau absența ajutorului celulelor T CD4+ în timpul amorsării celulelor T CD8+ duce la diferențe în compozițiile subsetului celulelor T specifice antigenului detectate în faza postefectoare timpurie. Șoarecii cu deficit MHC II, care nu au celule T CD4 + convenționale, au un răspuns defect de memorie CD8+, iar calitatea protecției scade în timp (2-4). Colorarea pentru subpopulațiile de celule T la 10 zile după infecția primară a arătat că subsetul CD127high/CD62Llow este aproape complet absent la șoarecii MHC II–/– (Fig. 4a); celelalte subpopulații sunt prezente la frecvențe similare cu cele ale șoarecilor WT C57BL/6. Aceste date demonstrează că absența ajutorului celulelor T împiedică generarea eficientă a unui subset de celule T cu un fenotip de memorie efectoare, care pare a fi crucial pentru expansiunea rapidă in vivo și funcția efectoare.

deoarece mecanisme importante de ajutor CD4+ celule T sunt mediate prin interacțiunea CD40 și CD40L (24-26), am investigat dacă CD40L–/– șoareci prezintă un fenotip similar cu cel al MHC II– / – șoareci. În conformitate cu alte studii recente (27), șoarecii CD40L–/– nu demonstrează diferențe în sarcina bacteriană sau clearance-ul bacterian după infecția primară cu Listeria (datele nu sunt prezentate) și au răspunsuri normale ale celulelor T CD8+ primare la o doză subletală de Lm (Fig. 4c). Cu toate acestea, capacitatea lor de a elimina rapid reinfectarea cu o doză mai mare de Lm (int.10 int. LD50) este redusă (Fig. 4b), corelând cu răspunsurile celulelor T cu memorie CD8+ afectată (Fig. 4c) și un subset CD127high/CD62Llow mult redus (Fig. 4 e și f) în timpul fazei postefective timpurii. În timpul reinfectării cu Listeria, proliferarea celulelor T care răspund la șoarecii CD40L– / – este echivalentă cu cea a populațiilor de celule la șoarecii WT, indicând faptul că fenotipul nu se datorează unui defect general al capacității proliferative a celulelor T de memorie (Fig. 4d) ci mai degrabă la un număr redus de celule T de memorie capabile să răspundă imediat la reîntâlnirea antigenului. Acest fenotip a fost demonstrat prin experimente de etichetare in vivo în care BrdUrd a fost încorporat pe întreaga fază de expansiune (Fig. 4D) și prin studii de urmărire a pulsului BrdUrd in vivo care monitorizează pierderea etichetei asupra proliferării (datele nu sunt prezentate).

generarea redusă de subseturi de celule T cu un fenotip de memorie efector devreme după amorsare este transmisă în grupul de celule T de memorie târzie. Datele noastre arată că, în absența celulelor T CD4+ sau CD40L, subsetul de celule T CD127high/CD62Llow este redus semnificativ mai devreme după amorsare. Mai mult, noi (Fig. 4b) și alții (3-5) au demonstrat că ajutorul afectat al celulelor T în timpul amorsării celulelor T duce la modificări ale calității imunității protectoare față de reinfectarea cu Lm sau virusul coriomeningitei limfocitare. Pentru a lega mai clar defectul observat la generația timpurie a celulelor T CD127high / CD62Llow cu calitatea memoriei ulterioare a celulelor T la acești șoareci, am analizat mai detaliat populațiile de celule T specifice antigenului în timpul fazei de memorie (5 wk după infecția primară cu Listeria). În acest moment, analiza celulelor T specifice antigenului trebuie efectuată pe celule derivate din diferite țesuturi datorită comportamentului lor migrator distinct. În plus față de splină, am ales LN ca țesut reprezentativ pentru organele limfoide și plămânul ca un compartiment periferic tipic, nelimfoid. În acest moment, celulele T specifice antigenului din aceste organe sunt aproape toate CD127high (Fig. 1b); celulele din plămân sunt CD62Llow (datele nu sunt prezentate), în timp ce majoritatea celulelor T cu memorie specifică antigenului din LN sunt CD62Lhigh (Fig. 5b). Pentru a determina numărul de celule T cu memorie specifică antigenului cu funcție efectoare imediată clară în diferitele organe, am efectuat colorarea intracelulară a citokinelor pentru IFN-XV. Așa cum se arată în Fig. 5A, CD40L–/– șoarecii sunt caracterizați de un număr substanțial diminuat de celule T de memorie specifice antigenului cu funcție efectoare imediată în comparație cu șoarecii WT. Acest rezultat este valabil la nivelul frecvențelor (procent) din compartimentul celulelor T CD8 + și în numere absolute (Fig. 5a). Cu toate acestea, colorarea MHC tetramer a limfocitelor derivate din Ln (Fig. 5b) a relevat un număr aproape identic de celule T specifice antigenului cu un fenotip ridicat Cd62l. Unele celule T specifice antigenului CD62Llow sunt, de asemenea, detectabile în LNs al șoarecilor WT, corelându-se cu frecvențele celulelor producătoare de IFN-XV (Fig. 5a). Această populație este practic absentă în LNs de șoareci CD40L -/–; întregul subset CD8+/ CD62Llow este redus la șoareci CD40L–/ -, sugerând un defect general în generarea acestui subset de celule T. Pe scurt, datele noastre arată că absența cd40l-dependent CD4+ T ajutor celular în timpul perioadei de amorsare are ca rezultat diferențe cantitative în antigen specific CD8+ celule T subpopulații, cu un număr foarte redus de celule care prezintă un fenotip de memorie efector (CD127high/CD62Llow). Aceste diferențe cantitative în celulele cu funcție efectoare timpurie imediată sunt transmise în faza de memorie și afectează calitatea imunității protectoare.