rezumat
fundal. Expresia CD133 umană (prominina umană-1) în celulele canceroase a fost postulată a fi un marker al stemness și este considerată ca un marker presupus al celulelor stem canceroase (CSC). Am conceput un studiu pentru a descrie modelul de Expresie al CD133 în pielea normală și în neoplasmele cutanate epiteliale. Metode. Expresia imunohistochimică CD133 a patruzeci și trei de tumori ecrine și apocrine a fost comparată cu cea observată în alte tumori epiteliale ale pielii. În plus, citometria în flux a fost utilizată pentru a detecta expresia CD133 a patru neoplasme epiteliale ale pielii, inclusiv un porocarcinom. Rezultate. A fost observată imunoreactivitatea CD133 la suprafața apicală sau apicolaterală a celulelor care formează structuri glandulare. Celulele din zonele solide ale tumorilor benigne sau maligne nu au fost colorate. Celulele de cultură derivate din porocarcinom au arătat 22% din celulele CD133 pozitive utilizând citometria în flux, în timp ce culturile de carcinom cu celule scuamoase conțineau mai puțin de 0,1%. Concluzii. Aceste observații indică faptul că CD133 este un marker specific al diferențierii glandulare care ar putea fi inclus în panoul de diagnostic al tumorilor cutanate cu posibilă diferențiere eccrină sau apocrină. Cu toate acestea, utilizarea expresiei CD133 ca marker al CSCs trebuie interpretată cu prudență în experimentele de piele.
1. Introducere
în ultimii ani, s-a raportat un număr tot mai mare de dovezi care susțin ideea că capacitatea de a susține formarea și creșterea tumorii se află exclusiv într-o populație mică de celule numite celule stem canceroase (CSC). Căutarea markerilor care demonstrează fenotipul celulelor stem al acestor celule de inițiere a tumorii este un câmp activ de investigare și mai mulți markeri de celule stem au fost descriși recent în tumorile cutanate .
CD133 este omologul uman al promininei-1 de șoarece, o glicoproteină de suprafață celulară de cinci domenii transmembranare care a primit o atenție notabilă datorită expresiei sale limitate la diferite subpopulații somatice de celule stem . Acest antigen de suprafață a fost descoperit ca țintă a unui anticorp monoclonal definit ca MAB AC133, un marker exprimat printr-o subpopulație de celule stem hematopoietice CD34 pozitive derivate din ficatul fetal uman și măduva osoasă . Ulterior, CD133 a fost detectat în diferite țesuturi normale umane, inclusiv rinichi, prostată, creier și pancreas și s-a constatat că este asociat în mod specific cu microvili și alte proeminențe ale membranei plasmatice . Mai mult, acest antigen a fost identificat și în afecțiuni maligne hematologice și în mai multe neoplasme umane solide, incluzând tumori gliale, carcinom de prostată, carcinom renal, hepatocarcinom, carcinom colorectal și melanom malign . Scopul multor dintre aceste studii a fost de a determina existența CSC-urilor, definite ca un grup mic de celule canceroase care au capacitatea de auto-reînnoire, inițierea tumorii și menținerea creșterii tumorale. Anticorpii utilizați în mod obișnuit pentru purificarea celulelor AC133-pozitive vizează epitopi glicozilați slab caracterizați, cu specificitate incertă. Deși activitatea funcțională a CD133 este încă controversată și funcția sa fiziologică nu este încă determinată , devine clar că această proteină de suprafață celulară este un marker unic atât al proeminențelor membranei plasmatice, cât și al microdomenelor membranei . S-a sugerat că în această locație celulară CD133 poate acționa ca un regulator al compoziției lipidelor membranare sau poate participa la mecanismele polarității și migrației celulare .
în studiile anterioare care raportează colorarea imunohistochimică CD133 a epiteliilor glandulare umane, cum ar fi glandele salivare, glandele lacrimale, canalele pancreatice, glandele endocervicale și glandele sudoripare, a fost descris un model particular de Expresie CD133 . În aceste epitelii, CD133 s-a dovedit a fi localizat la proeminențele membranei plasmatice în zonele apicale ale celulelor polarizate. Un model similar de colorare citoplasmatică apicală CD133 a celulelor care înconjoară un lumen a fost observat și în carcinoamele din ovar, colon sau pancreas .
constatarea anticorpilor cd133 care colorează celulele glandelor sudoripare ne-a determinat să proiectăm un studiu pe care îl raportăm acum, pentru a evalua expresia CD133 în tumorile ecrine și apocrine ale pielii.
2. Materiale și metode
2.1. Cazuri
o căutare retrospectivă a recuperat 43 de tumori cutanate ecrine și apocrine adnexale diagnosticate anterior din dosarele Departamentului de Patologie al Spitalului Universitar Albacete. S-au obținut diapozitive de sticlă, blocuri de parafină și rapoarte histopatologice din toate cazurile. Slides were reviewed and adnexal skin tumors were diagnosed according to the criteria of the World Health Organization (WHO) classification , including eccrine spiradenoma (), nodular hidradenoma (), eccrine hidrocystoma (), poroma (), porocarcinoma (), syringocystadenoma papilliferum (), chondroid syringoma (), syringoma (), cylindroma (), hidradenoma papilliferum (), apocrine hidrocystoma (), microcystic adnexal carcinoma (), and apocrine carcinoma (). Cazurile de carcinom bazocelular () și carcinom cu celule scuamoase () au fost, de asemenea, incluse în acest studiu pentru a compara rezultatele obținute în aceste neoplasme cu cele obținute în tumorile glandelor sudoripare. Pentru a evalua expresia CD133 în pielea normală, am analizat pielea din diferite zone obținute din marginile a șase tumori rezecate chirurgical ale pielii și din trei autopsii.
pentru cultura celulelor canceroase de piele, s-au obținut șapte probe din tumori ale pielii umane care corespundeau unui porocarcinom eccrin și șase carcinoame cu celule scuamoase. Țesutul proaspăt din aceste cazuri a fost inclus în mediul vulturului modificat Dulbecco (DMEM), suplimentat cu penicilină/streptomicină și fungizonă, imediat după rezecția chirurgicală.
2.2. Imunohistochimie
formalină fixă, secțiuni de țesut încorporate în parafină cu o lățime de 4 unqm au fost tăiate, deparaffinizate în xilen și rehidratate într-o serie gradată de etanol. Activitatea peroxidazei endogene a fost blocată cu 3% H2O2 timp de 5 minute. Diapozitivele au fost tratate cu recuperare de epitop indusă de căldură și imunosteinizate cu trei anticorpi monoclonali anti-CD133 diferiți: Anticorp monoclonal AC133, anticorp monoclonal 293C3 și anticorp monoclonal AC141 (toate din Miltenyi Biotec, Germania). Anticorpii au fost testați la diferite diluții și perioade de incubație. Detectarea CD133 a fost efectuată utilizând sistemul EnVision-HRP (Dako, Glostrup, Danemarca) într-o platformă de Autostainer DakoCytomation, conform instrucțiunilor producătorului. Diaminobenzidina (sistemul de substrat DAB, Dako, Glostrup, Danemarca) a fost utilizată ca cromogen. Dintre cei trei anticorpi anti-CD133 testați, doar unul, anticorpul monoclonal AC133, a lucrat în parafină. Ceilalți doi anticorpi testați au eșuat deoarece secțiunile incubate cu acești anticorpi nu au prezentat nicio colorare sau deoarece imunosupresorul observat atunci când s-au utilizat concentrații mari de anticorpi a fost considerat nespecific (colorare similară a fost observată la controalele negative). Anticorpul monoclonal AC133 a dat rezultate fiabile pe secțiunile încorporate în parafină testate. Stabilim pentru acest anticorp o diluție de 1: 10 și 40 de minute de incubare la temperatura camerei ca condiții de lucru preferate. Ulterior, toate experimentele au fost efectuate în aceste condiții.
secțiunile de piele cu glande sudoripare normale au fost utilizate ca controale pozitive. În plus, atunci când sunt prezente în secțiuni, glandele sudoripare normale de pe pielea adiacentă neoplasmelor au fost utilizate ca controale interne pozitive. Controalele Negative au fost efectuate prin omiterea anticorpului anti-CD133 în timpul incubării primare a anticorpului. colorarea imunohistochimică a zonelor solide și a structurilor acinare sau ductale din tumori a fost evaluată separat. Colorarea CD133 a fost clasificată folosind o scală semicantitativă. Structurile acinare sau ductale au fost evaluate după cum urmează: ( – ) fără colorare; ( + ) colorarea materialului secretor în lumenul ductulelor sau acinilor izolați și/sau colorarea slabă a marginii apicale sau luminale a câtorva ductule sau acini; ( ++ ) colorarea clară a marginii apicale sau luminale a majorității ductulelor sau acinilor prezenți în tumoare; ( + + + ) colorarea marginii apicale sau luminale a tuturor ductulelor sau acinilor prezenți în tumoare. Expresia CD133 a fost evaluată de doi patologi seniori (EP și SYNC) într-un mod orb, fără cunoașterea informațiilor clinice și patologice. În cazurile de evaluări discrepante, diapozitivele au fost reevaluate de ambii patologi sub microscop multihead și sa obținut un acord.
2.3. Cultura celulelor canceroase din tumorile cutanate
fragmentele tumorale au fost dezagregate mecanic și enzimatic prin digestie cu colagenază tip IA (2 mg/mL) (Gibco, Invitrogen) în Hank ‘ s balanced saline solution (HBSS) la 37 CTC timp de 2 ore. Celulele au fost filtrate printr-o plasă de nylon de 40 mm și au fost disociate în continuare prin trecerea în serie prin pipete serologice. Țesutul digerat a fost centrifugat la 1000 de grame la sută timp de 10 minute, iar peleta a fost spălată de mai multe ori pentru a se obține o suspensie cu o singură celulă. Celulele izolate au fost placate în flacoane de cultură și crescute la 37 de centi C în medii DMEM/F12 conținând 10% ser fetal bovin și suplimentate cu penicilină / streptomicină și fungizonă.
2.4. Analiza citometriei în flux
toate experimentele au fost efectuate pe suspensii celulare preparate la prima trecere a culturii primare din tumori. Celulele au fost detașate folosind 0,02% EDTA în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) timp de 15 min la 37 centicc și spălate cu PBS înainte de colorare. Suspensiile celulare au fost ajustate la celule / mL și incubate cu diluția recomandată a anticorpilor (1/10) timp de 20 min în întuneric (4 ct.c). Probele fără anticorpi primari au fost utilizate ca controale negative. Anticorpul utilizat a fost anti-CD133/1 (AC133)-APC (Miltenyi Biotec). Anticorpii nelegați au fost îndepărtați prin spălare cu PBS, iar celulele au fost omogenizate într-un volum adecvat de tampon. Analiza a fost efectuată pe un Citometru de flux LSRII (bd Biosciences). Datele au fost analizate folosind Summit V5.0. 1. 5170 software-ul (Dako).
3. Rezultate
3.1. Constatări clinice
cohorta de pacienți a constat din 29 de bărbați și 23 de femei, cu vârste cuprinse între 24 și 90 de ani (mediană, 49 de ani). Locul de prezentare a fost variabil, majoritatea localizate pe regiunea capului și gâtului. Datele clinice sunt rezumate în tabelul 1. Toți pacienții au suferit biopsie cutanată excizională.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| CD133 staining was graded using a semiquantitative scale. Acinar or ductal structures were evaluated as follows: (- ) fără colorare; ( + ) colorarea materialului secretor în lumenul ductulelor sau acinilor izolați și/sau colorarea slabă a marginii apicale sau luminale a câtorva ductule sau acini; ( ++ ) colorarea clară a marginii apicale sau luminale a majorității ductulelor sau acinilor prezenți în tumoare; ( + + + ) colorarea marginii apicale sau luminale a tuturor ductulelor sau acinilor prezenți în tumoare. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3.2. Constatări imunohistochimice
Din cei trei anticorpi monoclonali diferiți testați pe secțiuni de țesut fixate cu formalină, încorporate în parafină și, în conformitate cu rapoartele anterioare , numai AC133 a dat rezultate sensibile și fiabile. Modelul global de colorare imunohistochimică observat cu acest anticorp a fost strâns legat de arhitectura tisulară. Colorarea a fost localizată în principal pe suprafața apicală a celulelor care au format structuri ductale sau glandulare. Constatările imunohistochimice observate în aceste structuri utilizând anticorpul anti-CD133 sunt rezumate în tabelul 1 și sunt descrise mai jos. Zonele solide din oricare dintre tumorile adnexale examinate sau din carcinoamele cu celule bazale și celule scuamoase testate nu au reușit să demonstreze pozitivitatea CD133.
3.2.1. Țesutul normal
expresia CD133 a fost observată la suprafața endoluminală sau apicală a celulelor acini și a ductulelor terminale ale glandelor ecrine normale (Figura 1(a)). Canaliculii intercelulari formați la membrana laterală a celulelor ecrine situate în porțiunea secretoare a glandelor sudoripare normale au fost clar colorate (Figura 1(b)), precum și secreția Găsită în lumenul canalelor ecrine. Colorarea glandelor apocrine normale la ductulele terminale a fost observată la marginea apicală a celulelor, deși cu o distribuție neuniformă. În zonele acinare ale acestor glande, unde secreția de decapitare apocrină a fost evidentă, CD133 a prezentat doar o colorare slabă sau negativă.
(a)
(B)
(A)
(B)
3.2.2. Tumorile
CD133 nu au fost exprimate în niciunul dintre carcinoamele scuamoase sau bazale testate. Folosind anticorpul AC133, tumorile adnexale analizate în această lucrare au arătat următorul model de colorare (rezumat în tabelul 1).
tumori benigne cu diferențiere ecrină sau apocrină. Toate cazurile de spiradenom eccrin au prezentat imunoreactivitate CD133 la membrana apicală a structurilor duct-like prezente în nodulii tumorali. Suprafața luminală a celulelor epiteliale care formează chisturile uniloculare ale tuturor cazurilor de hidrocistom Ecrin analizate a fost, de asemenea, pozitivă. Canalele și chisturile mici prezente în trei din cele șase cazuri de porom Ecrin au arătat o colorare intensă a stratului celular intern din tubulii proliferați, iar această colorare a fost localizată la marginea endoluminală a celulelor. Celelalte trei cazuri de porom analizate au arătat același model de colorare în majoritatea tubulilor, dar cu un model de colorare (++) sau (+) de pozitivitate CD133. Structurile de tip Duct, prezente în cele patru cazuri de cylindrom, au prezentat și imunoreactivitate la nivelul membranei apicale a celulelor epiteliale. Colorarea celor patru siringoame condroide a fost proeminentă, iar toate ductulele prezente, care au format structuri de ramificare ocazionale, au prezentat o pozitivitate intensă la membrana apicală (Figura 2). Canalele dilatate și sinuoase, care duc în spațiile chistice ale tuturor cazurilor de syringocystoadenoma papilliferum, au prezentat imunoreactivitate la porțiunea apicală a celulelor epiteliale sau la suprafața luminală a chisturilor, cu o intensitate care a variat de la (++) la (+++) (Figura 3). Cele cinci cazuri diagnosticate ca hidradenom nodular au prezentat structuri izolate asemănătoare canalelor care au fost pozitive pentru CD133 cu o colorare apicală a celulelor care au format tubulii (Figura 4) care au variat în intensitate de la (++) la (+++). Cele două cazuri de hidradenom papilliferum au arătat, de asemenea, expresia CD133 la porțiunea apicală a structurilor glandulare. Doar două dintre cele șase cazuri de siringom testate au arătat o colorare consistentă la suprafața luminală a canalelor mici care au format tumorile, care au fost căptușite de obicei de două straturi de celule epiteliale cubice. Cazurile de hidrocistom apocrin nu au demonstrat nicio imunoreactivitate pozitivă.
tumori maligne cu diferențiere ecrină sau apocrină. Nu s-a putut demonstra imunoreactivitate la suprafața luminală a chisturilor cazului diagnosticat ca carcinom apocrin. Cele două carcinoame adnexale microcistice analizate în acest studiu au arătat o pozitivitate puternică a CD133 la suprafața apicală a celulelor care au format lumina mică și mare a structurilor tubulare. Imunosupresia CD133 a putut fi demonstrată la celulele foarte atipice care au înconjurat structurile tubulare ale cazului porocarcinomului (Figura 5).
(a)
(b)
(a)
(b)
Ductal structures of porocarcinoma seen in H&E sections (a) are CD133 positive (b).
3.3. Caracterizarea culturilor primare din tumorile cutanate umane și analiza citometriei în flux
șapte probe derivate din tumorile cutanate umane au fost prelucrate cu scopul de a obține suspensii cu o singură celulă. Datorită unui număr insuficient de celule obținute din tumori sau contaminării fungice sau bacteriene, doar patru probe au fost cultivate cu succes și analizate pentru expresia EPITOPULUI CD133/1 de pe suprafața celulară. Aceste biopsii cultivate cu succes includ un porocarcinom eccrin și trei carcinoame cu celule scuamoase. Examinarea microscopică a celulelor cultivate a relevat diferite morfologii care au variat constant la tipul tumorii histologice. Celulele din carcinomul cu celule scuamoase au prezentat aspectul epitelioid sau al celulelor fusiforme, în timp ce celulele derivate din porocarcinomul eccrin au avut o formă mai rotunjită și grupate împreună în insule de celule mici și atipice. Prezența celulelor epiteliale în aceste culturi a fost confirmată prin expresia pozitivă e-cadherin și EpCam ca markeri epiteliali.
pentru a determina dacă culturile de celule tumorale ale pielii conțineau o populație de celule CD133 pozitive, am folosit citometria în flux pentru a examina expresia markerului de suprafață CD133/1 cu anticorpul AC133. Toate probele din carcinomul cu celule scuamoase conțineau mai puțin de 0,1% din celulele pozitive, în timp ce aproape 22% din celulele pozitive au fost detectate în porocarcinomul eccrin. Figura 6 prezintă histograme reprezentative din cele două tipuri de tumori cutanate evaluate.
(a)
(b)
(a)
(b)
CD133 expression profiles in human skin primary tumour cells. Analysis of CD133/1 expression in samples from eccrine porocarcinoma (b) and from squamous cell carcinoma (a). Flow cytometry of porocarcinoma derived cell cultures show a 22% of CD133/1 epitope positive cells and CD133 immunostaining. Carcinomul cu celule scuamoase prezintă o colorare negativă pentru celulele CD133 și 0% CD133 pozitive pe citometria în flux.
4. Discuție
progresul în biologia celulelor stem cutanate și în înțelegerea carcinogenezei depinde în mare măsură de disponibilitatea markerilor specifici pentru populațiile distincte de celule stem . Markerii cunoscuți ai celulelor stem ale pielii sau ai celulelor stem care au fost identificate în alte organe sau tumori pot fi utilizați pentru detectarea CSC-urilor cutanate. Unul dintre acești markeri care pot fi testați în piele este proteina CD133 (prominin-1). Primele date care raportează expresia CD133 folosind anticorpul monoclonal AC133, produs împotriva unui antigen glicoproteic cu celule stem noi, au arătat că CD133 a fost exprimat selectiv pe celulele stem hematopoietice CD34 și celulele progenitoare derivate din ficatul fetal uman și măduva osoasă, precum și din sânge . De atunci, mai multe rapoarte au arătat că prominin-1 poate fi utilizat pentru a identifica și izola celulele stem umane din diverse surse , inclusiv sistemul hematopoietic , prostata , pancreasul sau rinichiul . În plus, anticorpii monoclonali împotriva CD133 au fost utilizați pentru identificarea și izolarea unei populații presupuse de celule care inițiază tumori sau CSC într-un număr de carcinoame umane și în melanomul malign . În gliom, numărul crescut de celule canceroase CD133 pozitive, precum și prezența clusterelor acestor celule, au fost propuse ca un factor prognostic semnificativ, independent de alți factori, cum ar fi gradul tumorii . Cu toate acestea, alte studii, folosind clone anti-CD133 diferite și noi, au sugerat că expresia CD133 nu se limitează la celulele stem și progenitoare și pare să fie exprimată în celulele epiteliale adulte ale șoarecilor și țesuturilor umane . De exemplu, folosind o clonă CD133, numită 13a4, derivată din mouse prominin-1, Weigmann și colab. expresia demonstrată a promininei-1 la suprafața apicală a celulelor neuroepiteliale și a tubulilor proximali ai rinichiului adult și Karbanov si colab. , folosind un anticorp monoclonal (80B258) generat împotriva unei polipeptide umane prominin-1, a observat imunoreactivitate în țesuturile umane adulte, în special în epiteliile glandulare. Aceste rezultate indică necesitatea unor studii suplimentare pentru a clarifica dacă antigenul AC133, găsit anterior în citometria de flux pentru a fi limitat la celulele progenitoare pozitive CD34, este exprimat în celulele epiteliale adulte . S-a sugerat că expresia variabilă CD133 observată este legată de afinitatea diferențială a diferiților anticorpi la diferite forme glicozilate ale CD133 . Anticorpul monoclonal AC133 recunoaște un epitop glicozilat al promininei – 1 și, interesant, glicozilarea acestei proteine se poate schimba în funcție de starea de diferențiere celulară sau poate fi modificată în timpul procesului de transformare malignă . În studiul nostru asupra tumorilor pielii umane, am observat că expresia CD133 depinde în mare măsură de formarea ductulelor glandelor sudoripare și a secreției glandelor sudoripare. Imunoreactivitatea CD133 a fost observată în principal la suprafața apicală/endoluminală a structurilor asemănătoare canalelor sau chisturilor majorității tumorilor ecrine benigne și maligne. Niciuna dintre tumorile studiate, nici benigne, nici maligne, nu a prezentat grupuri izolate sau mici de celule neoplazice CD133 pozitive în zone solide. Modelul similar de colorare CD133 al membranei celulare apicale a celulelor secretoare a fost raportat anterior în structurile tubulare normale, cum ar fi tubulii proximali ai rinichilor sau în glandele tumorale ale cancerului colorectal . Colorarea CD133 a fost, de asemenea, găsită la suprafața apicală/endoluminală a celulelor care formează un lumen în carcinoamele ovariene . În aceste cazuri, localizarea apicală a CD133 a fost implicată într-o posibilă funcție secretorie a acestei molecule. Distribuția morfologică a colorației CD133 demonstrează o corelație cu structurile secretoare bine recunoscute ale țesuturilor și glandelor normale, sugerând o relație funcțională a CD133 cu secreția. De fapt, în studiul nostru, tumorile suspectate a fi originare din zonele ductale ale glandelor sudoripare, cum ar fi siringoamele, au arătat un model mai puțin intens de colorare decât cele originare din porțiunile acinare. expresia CD133 de pe suprafața celulară a celulelor tumorale diferențiate este un argument împotriva CD133 ca marker specific al celulelor stem canceroase în piele. Cu toate acestea, existența unei mici populații CD133+ CSC nu poate fi exclusă complet, așa cum s-a demonstrat în alte organe, unde CD133 este exprimat pe suprafața celulară a ambelor CSC și a celulelor tumorale diferențiate .
luate împreună, descoperirile noastre demonstrează o expresie imunohistochimică specifică a anticorpului AC133 la suprafața secretorie a celulelor normale și neoplazice diferențiate ale glandelor ecrine. Experimentele care utilizează acest anticorp ca marker al CSC-urilor în piele trebuie interpretate cu prudență. Anticorpul AC133 este un marker sensibil și specific al diferențierii glandulare cutanate, util pentru diagnosticul tumorilor cu posibilă diferențiere ecrină sau apocrină.
mulțumiri
autorii îi sunt recunoscători lui Pedro Javier Benito Castellanos și Laurei Abenda pentru asistență tehnică.
