rezultă

modularea nivelurilor celulare P107 prin proteoliză controlată. Am arătat anterior că P107 endogen, un membru al familiei de proteine RB, care nu este un substrat natural al SCF Xiftrcp, poate fi eliminat în celulele carcinomului cervical C33A prin expresia ectopică a unei ligaze imixtrcp ubiquitin–proteine himerice (xiftrcp-E7N) care poartă o peptidă de legare p107 derivată din reziduurile n-terminale 35-aa ale oncoproteinei HPV, E7 (E7N) (1). Cu toate acestea, funcțiile multor proteine celulare sunt dictate de abundența lor intracelulară și nu pur și simplu de prezența sau absența lor. Până în prezent, nu a existat o metodă fiabilă pentru a modula cu precizie nivelurile de proteine intracelulare din celulele mamiferelor.

am investigat mai întâi dacă nivelurile de p107 ar putea fi reduse sistematic prin exprimarea controlată a diferitelor cantități de xictrcp-E7N. celulele umane de carcinom cervical c33a au fost infectate cu doze crescânde de adenovirus recombinant care transportă xictrcp-E7N sau adenovirus de control timp de 24 de ore. Infecția a fost de 100%, chiar și la cea mai mică doză utilizată, după cum se apreciază prin expresia GFP purtată de adenovirus în toate celulele primitoare (datele nu sunt prezentate). Așa cum se arată în Fig. 1 (Superior), nivelurile endogene de P107 au fost reduse sistematic la 78%, 25% și 5% din nivelurile la starea de echilibru atunci când celulele C33A au fost transduse cu adenovirus recombinant ecqtrcp-E7N la mois de 10, 35 și 80, dar nu aceleași doze de virus de control Ad1. Prin urmare, SCF-BP oferă un mijloc simplu și reproductibil de reducere a cantităților totale de proteine țintă la niveluri definite pentru testarea efectelor dozelor asupra activităților biologice.

P107 se asociază stabil cu ciclina A și Cdk2 printr-un situs de legare cu afinitate ridicată în celulele proliferante (13-15). Pentru a examina dacă aceste proteine asociate cu p107 sunt, de asemenea, supuse degradării țintite de către ziftrcp-E7N, s-a efectuat imunoblotting în celulele C33A infectate cu virusul Ad-F-TrCP-E7N. Așa cum se arată în Fig. 1, nivelurile endogene de ciclină a și Cdk2 au rămas neschimbate, în timp ce p107 a fost reglat dramatic. În plus, nivelurile de actină nontargeted nu au fost afectate de f-TrCP-E7N (Fig. 1). Acest rezultat a furnizat dovezi puternice că ligaza ubiquitin-protein–E7N proiectată degradează în mod specific substratul vizat p107, dar nu și proteinele asociate acestuia.

degradarea selectivă a unei subpopulații specifice modificate Posttranslațional a proteinei țintă. Modificarea unei proteine celulare la nivel posttranslațional, cum ar fi fosforilarea, este un mijloc fundamental pe care celulele îl folosesc pentru a regla funcția sau pentru a conferi noi activități ale proteinei. Instrumentele experimentale pentru disecția funcției asociate unui eveniment specific de modificare posttranslațională sunt în prezent limitate. Deoarece protein knockout funcționează la nivel posttranslațional care recunoaște direct proteinele țintă, o aplicație este de a proiecta un E3 specific care este capabil să selecteze o subpopulație de proteine modificate posttranslațional pentru degradare, în loc să distrugă întreaga populație.s-a constatat că HPV16 E7 se leagă selectiv de forma hipofosforilată a RB (16). Am investigat dacă ligaza imixtrcp-E7N ubiquitin–protein himerică poate distinge RB hipo-și hiperfosforilat și poate selecta doar hipoforma pentru degradare. Celulele umane de osteosarcom u2os exprimă ambele forme de RB care pot fi identificate cu ușurință, pe baza mobilității lor electroforetice diferite pe SDS/pagină (Fig. 2A, banda 1) (17). Identitatea acestor două specii de RB a fost verificată în continuare prin imunoblotting folosind anticorpi specifici pentru formele hipo – sau hiperfosforilate ale RB (Fig. 2A, benzile 2 și 3). Celulele U2OS au fost infectate cu AD-F-TrCP-E7N recombinant sau adenovirusurile AD1 de control timp de 48 de ore, iar nivelurile la starea de echilibru ale RB-P și RB au fost analizate simultan prin Western blotting, folosind un anticorp monoclonal anti-RB care recunoaște ambele forme. În concordanță cu legarea preferențială a E7N la RB hipofosforilat, expresia ectopică A F-TrCP-E7N a dus la eliminarea RB hipofosforilat, în timp ce RB-p hiperfosforilat a fost lăsat intact (Fig. 2b superior, comparați benzile 4-6 cu benzile 1-3). Acest rezultat evidențiază capacitatea ingineriei F-TrCP–E7N ubiquitin-protein ligase în selectarea unei subpopulații specifice a RB pentru degradare, care s-a bazat pe starea anumitor modificări posttranslaționale ale proteinei țintă.

HPV16 E7 de lungime întreagă ar putea interacționa cu inhibitorii de kinază dependenți de ciclină p21Waf1 și p27Kip1, dar domeniul de legare a fost mapat la domeniul C-terminal (reziduurile 40-98), în loc de fragmentul E7N (reziduurile 18-20). Pentru a examina în continuare specificitatea F-TrCP-E7N, aceleași extracte de celule U2OS au fost, de asemenea, probate cu anticorpi împotriva p21Waf1 și p27Kip1. Așa cum se vede în Fig. 2B( mijloc), nivelurile la starea de echilibru ale p21Waf1 și p27Kip1 au rămas neschimbate. Luate împreună, F-trcp-E7N proiectat a demonstrat specificitate proteolitică față de proteinele familiei RB, dar nu și alte regulatoare ale ciclului celular, cum ar fi Cdk2, ciclina a, p21Waf1 și p27Kip1.

mutageneză pe bază de structură pentru a genera o ligază ubiquitin-proteică foarte specifică inqustrcp-E7N. Himericul xixtrcp-E7N este încă capabil să lege substraturile endogene ale xixtrcp, inclusiv IkB, xixt-catenin și ATF4 (3-7). Supraexprimarea ziftrcp-E7N poate interfera cu degradarea acestor substraturi native. În schimb, legarea substratului endogen la ectrcp-E7N ar putea interfera cu poziționarea corectă a substratului destinat să accepte ubiquitina din enzima conjugantă ubiquitină și, prin urmare, să reducă eficiența degradării vizate (Fig. 3AUpper). În plus, xiftrcp interacționează cu un pseudo substrat hnRNP-U, care leagă xiftrcp și derivații săi în nucleu și împiedică interacțiunea acestora cu substraturile (21). Prin introducerea unor mutații specifice ale reziduurilor de aminoacizi pe zentrtrcp pentru a elimina legarea sa la zentr-catenină, IkB sau hnRNP-U, anticipăm îmbunătățirea nu numai a specificității, ci și a disponibilității zentrtrcp-E7N proiectat pentru a recruta substratul dorit (Fig. 3de mai jos).

domeniul de legare a substratului de la zentrtrcp conține șapte repetări WD40 în regiunea C-terminală, care se pliază în structura tipică a elicei cu șapte lame de la zentrul de la zentral conservată între proteinele WD40 (3-7). Deoarece integritatea generală a structurii cu elice a proteinelor WD40 este esențială pentru funcțiile lor, abordarea standard a mutagenezei de deleție va induce probabil modificări structurale brute și, prin urmare, nu este aplicabilă pentru definirea situsurilor de legare a substratului pe xiftrcp. Cu toate acestea, structura cristalină cunoscută a proteinelor WD40 poate fi exploatată pentru a identifica reziduurile de suprafață implicate în legarea substraturilor zentrtrcp. O abordare de mutageneză bazată pe structură a fost concepută pentru a identifica și muta cinci reziduuri încărcate pozitiv (R285, K365, R474, R521 și R524), preconizate să locuiască pe suprafața superioară a elicei WD40, care sunt implicate în legarea la proteinele asociate WD40 (Fig. 3B) (22). Această abordare a fost detaliată în metodele de sprijin, care este publicată ca informații justificative pe site-ul web PNAS. De asemenea, vezi Fig. 6, care este publicat ca informații justificative pe site-ul web PNAS. În plus, substituțiile acestor reziduuri de Lys/Arg nu vor modifica probabil structura globală a ectrcp.

prin utilizarea kitului de mutageneză direcționat QuikChange multisite (Stratagene), am mutat simultan aceste reziduuri în Glu. Acest mutant compus marcat cu steag, desemnat F-TrCP(m1) – E7N, a fost testat pentru legarea sa atât la țintele endogene (IkB), cât și la țintele knockout intenționate (p107). Celulele HeLa au fost transfectate tranzitoriu cu F-TrCP(m1)-E7N sau F-TrCP-E7N, iar interacțiunile lor cu IkB și p107 au fost determinate prin coimunoprecipitare. F-TrCP-E7N și F-TrCP au prezentat afinități similare cu proteina IkB fosforilată, în timp ce mutațiile compusului m1 au abolit legarea F-TrCP(m1) – E7N (Fig. 3c mijloc). În schimb, niveluri similare de p107 au fost detectate în imunocomplexele F-TrCP-E7N sau F-TrCP(m1)-E7N (Fig. 3c inferior), indicând faptul că ligaza F-TrCP(M1)-E7N ubiquitin–protein este pe deplin funcțională în recrutarea țintelor celulare intenționate. Aceste rezultate sunt în concordanță cu previziunile structurale din Fig. 3B, și să definească în continuare reziduurile de aminoacizi de pe centitrcp critice pentru recunoașterea substratului endogen.

f-trcp(m1)-E7N proiectat a fost analizat în continuare pentru potența sa în degradarea P107 endogen. Celulele C33A au fost cotransfectate cu F-TrCP, F-TrCP-E7N sau F-TrCP(m1) – E7N, împreună cu o plasmidă de Expresie CD19. La patruzeci și opt de ore după transfecție, celulele au fost recoltate și îmbogățite pentru cei care au primit plasmidele transfectate prin utilizarea granulelor imunomagnetice conjugate cu anticorpul monoclonal anti-CD19. Nivelurile endogene de p107 au fost ulterior determinate prin imunoblotting. Așa cum se arată în Fig. 3D, expresia ectopică A F-TrCP (m1)-E7N a dus la o reducere de 95% a nivelurilor endogene de P107, în timp ce s-a observat o reducere de 82% a p107 pentru F-TrCP-E7N (Fig. 3d superior, comparați benzile 4 și 3). Mai mult, expresia F-TrCP (m1)-E7N nu a avut nici un efect observabil asupra factorului de necroză tumorală (TNF)-degradarea indusă de IkB de către nativul SCF Xiftrcp sau asupra distrugerii p27kip1 de către ligazele scfskp2 ubiquitin–protein (datele nu sunt prezentate). Prin urmare, expresia ectopică a ingineriei F-TrCP(m1)-E7N nu interferează cu activitatea globală de ubiquitinare SCF prin strivirea componentelor SCF de bază (Skp1, CUL-1 și Rbx1/Roc1) împărtășită de proteinele endogene F-box.

degradarea țintită a p107 a fost evaluată în continuare în celulele c33a individuale prin testul imunofluorescenței indirecte. În mod consecvent, p107 a fost eradicat în mare parte în celulele C33A care exprimă F-TrCP-E7N sau F-TrCP(m1)-E7N, dar nu numai F-TrCP (Fig. 3E). În mod colectiv, aceste rezultate indică faptul că, prin eliminarea situsurilor de legare ale substraturilor endogene de tip ectrcp, ubiquitin-protein ligaza F-TrCP(m1)–E7N a demonstrat o specificitate crescută și o activitate proteolitică robustă față de ținta dorită.

domeniu minim de legare ca peptidă de direcționare pentru recrutarea eficientă a substratului. Pentru a obține o specificitate ridicată a recrutării substratului și pentru a minimiza direcționarea nespecifică a altor proteine celulare, am testat dacă domeniul minim de interacțiune p107/RB al E7N (desemnat E7M), care cuprinde reziduurile 21-29 ale E7 care acoperă motivul LXCXE (23), ar putea realiza legarea și degradarea eficientă a p107. A fost construită o ligază chimerică ubiquitin–protein în care ecqustrcp și E7m au fost legate covalent între ele printr-un distanțier flexibil 20-aa format din 10 copii ale repetițiilor Gly-Ser (desemnate 10GS). F-TrCP-E7N sau F-TrCP-10GS-E7m au fost transfectate tranzitoriu în celule C33A, iar legarea lor la P107 endogen a fost evaluată prin imunoprecipitare în extracte preparate după tratamentul cu inhibitorul proteazomului MG132 pentru a inhiba degradarea ca o consecință a acestei interacțiuni. Așa cum se arată în Fig. 4A (benzile 2 și 3), F-TrCP-10GS-E7m au avut o afinitate ușor crescută la p107 decât cea a F-TrCP-E7N originală. F-TrCP-E7N și F-TrCP-10GS-E7m au fost evaluate în continuare pentru eficiența lor în degradarea p107 prin transfecție tranzitorie în celulele C33A ca în Fig. 3D. așa cum se arată în Fig. 4B, F-TrCP-E7N și F-TrCP-10GS-E7m au indus până la 92% și 95% reglarea descendentă a p107, indicând faptul că modelul de inginerie de la care se realizează domeniul minim de legare p107 funcționează la fel de eficient ca F-TrCP-E7N original în degradarea proteinelor țintă.

livrarea mediată de retrovirale a ingusttrcp proiectat pentru degradarea susținută a țintelor endogene. În continuare am examinat dacă ligazele ubiquitin–proteine proiectate ar putea fi exprimate stabil pentru a obține o degradare susținută a țintei intenționate. Celulele leucemiei promielocitare HL – 60 au fost transduse cu retrovirusurile recombinante care exprimă PBMN-GFP, F-TrCP(m1)-E7N sau F-trcp-E7N de control(XVDLYC), în care situl de legare RB/p107 a fost șters (1). Celulele infectate cu transgenuri himerice F-TrCP integrate cromozomial au fost izolate prin sortare FACS, pe baza expresiei GFP din virusuri, iar degradarea p107 endogen a fost evaluată din celulele HL-60 infectate fie imediat după infecție (Fig. 5A), sau după 3 luni de cultură în mediu de creștere (Fig. 5B). Mai mult, deoarece alți doi membri ai familiei de proteine RB, RB și p130, sunt exprimați și în celule HL-60, am examinat dacă un singur F-TrCP-E7N poate viza simultan degradarea întregii familii de proteine RB care interacționează cu același motiv LXCXE al E7N. expresia ectopică a F-TrCP-E7N transdusă retroviral indusă de reglarea dramatică în jos a formei hipofosforilate a RB, precum și p107 (Fig. 5A) și p130 (datele nu sunt prezentate) în celulele HL-60, fie imediat după infectare și sortare FACS (Fig. 5A), sau la 3 luni după infectare și cultură continuă (Fig. 5B, banda 3). În schimb, expresia stabilă a F-TrCP-E7N(XVDLYC) în celulele HL-60 nu a avut niciun efect asupra modificării p107, RB (Fig. 5A, banda 3) și nivelurile p130 (datele nu sunt afișate). În concordanță cu observația că F-TrCP-E7N degradează preferențial RB hipofosforilat în celulele U2OS (Fig. 2), reducerea speciilor RB hiperfosforilate prin expresia stabilă a F-TrCP-E7N a fost mai puțin pronunțată, comparativ cu cea a formei hipofosforilate în celulele HL-60 (Fig. 5A, comparați banda 2 a pRB și pRB-P).

la tratamentul cu acid retinoic all-trans (ATRA), celulele HL-60 ies din ciclul celular și suferă o diferențiere terminală. S-a observat o acumulare de RB hipofosforilat, despre care s-a raportat anterior că contribuie la stoparea creșterii induse de ATRA, în timp ce RB hiperfosforilat nu a fost detectabil (24, 25). Pentru a examina dacă echipamentul SCF Xiftrcp poate fi, de asemenea, exploatat în timpul ieșirii din ciclul celular, celulele HL-60 care exprimă stabil F-TrCP-E7N sau F-TrCP(m1)-E7N au fost tratate cu ATRA de 1 xifm timp de 72 de ore și s-a evaluat degradarea proteinelor din familia RB. Celulele HL-60 care exprimă stabil F-TrCP-E7N au dus la scăderea cu 95%, 98% și 85% a nivelurilor RB, p107 și, respectiv, p130, comparativ cu celulele infectate cu virusul martor pBMN-GFP (Fig. 5B, banda 2). Deoarece ATRA activează, de asemenea, transcrierea genelor sub controlul virusului leucemiei murine Moloney ltr al pBMN-GFP (26), expresia crescută a F-TrCP-E7N pe tratamentul ATRA a contribuit probabil la reglarea eficientă a p107, p130 și RB hipofosforilat (Fig. 5B).

efectul proteinelor familiei RB asupra progresiei normale a ciclului celular a fost examinat în fibroblastele embrionare de șoarece cu întreruperi în genele RB, p107 și p130 și s-a constatat că nu răspund la semnalele care induc oprirea G1, cum ar fi retragerea factorului de creștere sau deteriorarea ADN-ului (27, 28). Cu toate acestea, efectele colective ale membrilor familiei RB în proliferarea celulelor tumorale nu au fost studiate, din cauza lipsei unor instrumente genetice inverse eficiente. Celulele stabile HL-60 care exprimă F-TrCP(M1)-E7N din acest studiu ne-au permis să evaluăm modul în care celulele tumorale deficitare pentru toate cele trei proteine din familia RB au răspuns la semnalele de arestare G1. În celulele HL-60 cu creștere exponențială care exprimă F-TrCP(m1)-E7N care au indus degradarea constitutivă a proteinelor familiei RB, s-a observat o accelerare marcată a progresiei ciclului celular în comparație cu cele infectate cu virusul martor pBMN-GFP (Fig. 5c stânga). Acest rezultat este în concordanță cu controlul afectat al tranzițiilor G1–S observate în fibroblastele embrionare de șoarece RB–/–, p107–/– și P130–/– triple knockout (27, 28).

tratamentul ATRA a inhibat tranziția de fază G1-S în celulele HL-60 infectate cu pbmn-GFP de control (Fig. 5c) sau virusul F-TrCP-E7N(XVDLYC) (datele nu sunt prezentate), care este în concordanță cu ceea ce a fost raportat pentru celulele HL-60 neinfectate (Fig. 5C) (24). O întârziere inițială în tranziția G1–S a fost observată și în celulele pBMN-F-TrCP(m1)-E7N/HL-60 la 48 de ore după ATRA. Cu toate acestea, o arestare completă a G1 nu a putut fi realizată în stadiul ulterior (72-96 h), iar celulele au continuat cursul progresiei ciclului celular (Fig. 5C). În schimb, celulele de control pBMN-GFP/HL-60 au fost blocate în G1 între 72 și 96 h. aceste observații sugerează că degradarea mediată de F-TrCP(m1)-E7N a membrilor familiei RB afectează un eveniment ATRA-răspuns târziu necesar pentru finalizarea opririi creșterii, în timp ce atenuarea timpurie a progresiei G1–S a fost în mare parte neafectată. În plus, s-a observat o reducere dramatică a numărului de celule între 72 și 96 de ore după tratamentul cu ATRA datorită morții celulare masive în timpul ieșirii și diferențierii ciclului celular indus de ATRA (29). În mod izbitor, celulele HL-60 care exprimă F-TrCP(m1)-E7N au prezentat o creștere medie de 2 până la 3 ori în populațiile subG1 comparativ cu cea a celulelor HL – 60 infectate cu virusul martor (datele nu sunt prezentate), ceea ce este în concordanță cu creșterea morții celulare în celulele fibroblaste embrionare de șoarece RB -/ -, p107–/– și P130–/– triple knockout în condiții de inhibare a creșterii (28). În mod colectiv, expresia constitutivă a F-TrCP(m1)-E7N a indus reglarea descendentă a întregii proteine din familia RB, ceea ce duce la o inhibare a opririi creșterii și la o creștere a morții celulare la tratamentul ATRA.oprirea G1 indusă de ATRA implică reglarea coordonată a mai multor semnale/componente celulare care controlează negativ ciclul celular (revizuit în ref. 30). Dimberg și colab. (31) a raportat că ATRA declanșează o secvență de evenimente în celulele mieloide care implică o creștere timpurie a expresiei p21waf1, stabilizarea p27kip1 și, ulterior, defosforilarea RB la debutul arestării G1. Deoarece ectrcp(M1)-E7N degradează numai membrii familiei RB și nu are niciun efect asupra stabilității p21waf1 și p27kip1, este probabil ca doar răspunsul ATRA tardiv, dependent de RB, să fie afectat, ceea ce este în concordanță cu rezistența celulelor pBMN-F-TrCP(m1)-E7N/HL-60 pentru a finaliza G1 arrestat72-96 h (Fig. 5C). Inhibarea timpurie a creșterii observată de ATRA la 48 h (Fig. 5C) ar putea fi atribuită, cel puțin parțial, reglării superioare a p21waf1 și p27kip1, a căror stabilitate nu este afectată de expresia constitutivă F-TrCP(m1)-E7N (Fig. 2 și 5).