note de laborator pentru BIO 1003

30 august 1999, John H. Wahlert & Mary Jean Holland

enzime

proteine care acționează ca catalizatori

(click aici pentru: materiale, teme, resurse web)

celulele nu au opțiuni de căldură și agitare viguroasă pentru a accelera reacțiile chimice, făcând atomii și moleculele să se ciocnească mai des și cu mai multă forță. În schimb, ei fac catalizatori proteici numiți enzime care furnizează suprafețe pe care reactanții se întâlnesc în orientarea corectă, iar enzimele pot chiar slăbi legăturile care trebuie rupte. Enzimele au o specificitate ridicată-numai reactanții specifici se vor potrivi pe suprafețele lor și vor echilibra sarcinile locale de suprafață ale locului numit sit activ. Setul particular de reactanți pentru o enzimă se numește substratul(substraturile) acesteia. Enzimele, ca toți catalizatorii, nu sunt modificate de reacția pe care o catalizează; astfel, când toți reactanții au fost transformați în produse, moleculele enzimatice originale rămân.

funcția enzimei depinde de mediul în care are loc reacția. Factori precum temperatura și pH-ul pot influența foarte mult capacitatea unei enzime de a-și face treaba. Următoarea serie de experimente ilustrează principiile reacțiilor catalizate enzimatic în sistemele biologice. Vom folosi enzima catecolază (sau catecol oxidază) care este comună în plante; este prezent în sucul de cartof proaspăt stors care a fost furnizat. Substraturile catecolazei sunt catecolul și oxigenul. Substraturile reacționează între ele în cadrul situsului activ al enzimei. Produsele formate prin această reacție sunt benzochinona și apa; deoarece benzochinona are o culoare maro, puteți vedea că reacția a avut loc. Aceasta se numește reacția de rumenire a fructelor. Benzochinona inhibă creșterea microorganismelor și previne putrezirea fructelor deteriorate. În celulele nedeteriorate, catecholaza este stocată în vezicule și nu interacționează cu catecholul.

în prezența enzimei catacholază:

catechol + XVO2 benzochinonă + H2O

în toate experimentele de mai jos, se amestecă ingredientele conform specificațiilor și se amestecă amestecul cu un vârtej de duh sau atingând partea laterală a tubului în apropierea fundului; se incubează amestecurile la 40 de grade C, dacă nu se specifică altfel.

dacă te-ai îndoit de puritatea enzimei, cum ai putea afla dacă există altceva în extractul de cartofi în afară de catecolază?

I. formarea și detectarea Benzochinonei

acest experiment stabilește standardele de apariție atunci când reacția a avut sau nu a avut loc. Utilizați apă distilată unde este indicat H2O.

Mix	Initial color	Color change (after 5 min)
10 drops potato extract with 10 drops 1% catechol (experiment)
10 drops potato extract with 10 drops H2O (control)
10 drops 1 % catechol with 10 drops H2O (control)

cum ați defini conceptele unui control și ale unui experiment?

II. specificitatea enzimei

hidrochinona este similară din punct de vedere structural cu catecholul, dar nu la fel. În acest experiment vom vedea dacă enzima o poate converti și în benzochinonă sau dacă enzima este pur și simplu prea specifică în proiectarea sa pentru a interacționa cu molecula similară, dar nu identică.

Mix	Initial color	Color change (after 5 min)
10 drops potato extract with 10 drops 1% catechol
10 drops potato extract with 10 drops hydroquinone
10 drops hydroquinone with 10 drops H2O (control)

enxima poate converti hidrochinona în benzochinonă? Cum ați ajuns la această concluzie?

notă: grupul dvs. va face fie III, fie IV—nu ambele.
întrebați instructorul de laborator dacă grupul dvs. va face temperatura III sau pH IV.

III. efectul temperaturii asupra activității enzimei

enzimele sunt proiectate să funcționeze într-un anumit interval de temperatură. S-ar putea face unele presupuneri cu privire la rezultatul pentru următoarele temperaturi de mai jos. Rețineți că structurile care produc enzima sunt fructele și cartofii; pe scara de temperatură Celsius 0 grade este înghețarea, 22 de grade este temperatura camerei și 100 de grade fierbe. Cu cât este mai fierbinte, cu atât moleculele vibrează și se mișcă mai repede. Coliziunile moleculelor de apă cu enzima ar putea anula structura pliată care este ținută în poziție de legăturile de hidrogen; când se întâmplă acest lucru, se spune că molecula a fost denaturată. Ce s-ar întâmpla cu site-ul activ în acest caz? La temperaturi scăzute, moleculele se mișcă foarte încet, iar șansa de a se ciocni și de a reacționa între ele este foarte scăzută. Rețineți că extractul de cartofi a fost păstrat pe gheață. De ce?

scrieți-vă ipoteza despre efectul temperaturii asupra activității enzimei:

configurați 6 perechi de eprubete cu 10 picături de extract de cartof într-un set și 10 picături de 1% catecol în celălalt. Incubați-le timp de 5 minute, câte o pereche în fiecare dintre cele 5 medii de temperatură indicate mai jos. Apoi amestecați extractul de cartofi și catecholul împreună; înregistrați culoarea inițială și puneți tubul înapoi în mediile cu temperatură controlată. Înregistrați din nou culoarea după 5 minute.

temperatura	culoarea inițială	schimbarea culorii (5 min. after adding catechol)
0 degrees C
22 degrees C
40 degrees C
60 degrees C
80 grade C
100 grade C

rezultatele susțin ipoteza inițială?

ce temperaturi denaturează enzima astfel încât să nu se poată recupera.

care este precipitatul alb care se formează la 100 de grade C?

IV. efectul pH-ului asupra activității enzimei

scara pH-ului măsoară numărul de ioni de hidrogen (fiecare cu o sarcină +1) prezenți în soluție. Scara în sistemele biologice variază de la 0 (puternic acid) la 14 (puternic bazic). 7, punctul neutru, este pH-ul apei pure. Reamintim că structura pliată a moleculelor de proteine se datorează în mare parte legăturii de hidrogen între părțile încărcate opus ale lanțului polipeptidic. Alți ioni în soluție ar putea înlocui părțile potrivite ale lanțului și ar putea să-l desfacă. Când se întâmplă acest lucru, ce se întâmplă cu site-ul activ?

scrieți-vă ipoteza despre efectul intervalului de pH asupra activității enzimei:

configurați 7 eprubete cu 40 de picături dintr-o soluție de pH tamponată diferită în fiecare. Adăugați 10 picături de extract de cartofi la fiecare și amestecați. Apoi adăugați 10 picături de 1% catechol la fiecare și amestecați.

pH	Initial color	Color change (5 min after adding catechol)
pH 2
pH 4
pH 6
pH 7
pH 8
pH 10
pH 12

Do the results support your hypothesis?

la ce pH sau interval de valori ale pH-ului funcționează cel mai bine enzima?

de ce punerea sucului de lămâie pe fructele proaspăt feliate întârzie rumenirea?

V. necesitatea cofactorilor pentru activitatea enzimatică

multe enzime funcționează numai dacă există un cofactor asociat cu acestea. Catecolaza necesită cupru ca cofactor. PTU este o substanță chimică care are o afinitate mai mare pentru cupru decât catecolaza și îndepărtează cuprul de enzimă. Puteți observa ce se întâmplă cu funcția enzimei atunci când cofactorul său este îndepărtat. We refer to cofactors that our bodies need as vitamins and minerals.

Mix	Initial color	Color change (5 min after adding catechol)
Tube A 10 drops potato extract 5 crystals PTU and mix. After 5 minutes add 10 drops 1% catechol.
Tube B 10 drops potato extract. după 5 minute se adaugă 10 picături 1% catechol.

care tub, A sau B, este controlul în acest experiment?