secvențierea automată a ADN-ului prin electroforeză capilară

separarea produselor unei reacții de secvențiere dideoxi marcate radioactiv sau fluorescente a fost realizată în mod istoric într-un gel de placă poli-acrilamidă, de exemplu tipul utilizat într-un Abi 377 cu 96 de benzi. Dezavantajele acestei metode includ necesitatea pregătirii unui gel proaspăt pentru fiecare rulare de secvențiere, încărcarea manuală a probelor în gel, timpi de rulare relativ lungi (8 ~ 10 ore pentru rezoluția unui fragment de ADN de 1kb) și dificultăți în urmărirea automată și/sau manuală a benzilor.

o metodă alternativă de separare utilizează electroforeza capilară. Se prepară o serie de reacții standard de secvențiere a ADN-ului dideoxi, fiecare într-un singur puț dintr-o placă de 8 rânduri x 12 coloane cu 96 de puțuri. O serie de tuburi capilare ultra-subțiri (0.Alezaj interior de 1 mm, lungime de 50 ~ 80 cm) sunt umplute cu un amestec de mărgele de rășină și plasate într-o matrice multi-capilară. Un capăt al matricei este montat într-o placă catodică încărcată negativ, astfel încât capetele lor să se alinieze cu fiecare godeu al plăcii de probă. Aplicarea tensiunii înalte face ca ADN-ul etichetat din fiecare sondă să intre în capilarul corespunzător și să migreze spre rezervorul de anod încărcat pozitiv. Datorită tensiunilor ridicate utilizate, separarea electroforetică necesită doar 1 ~ 3 ore. Ca și în electroforeza cu gel, fragmentele mai mici se mișcă mai repede decât cele mai mari . Coloranții cu etichetă finală sunt activați de un laser în fereastra detectorului , iar lungimea de undă de fluorescență a fiecărui fragment este citită de un fotometru pe măsură ce trece printr-un punct fix. Spre deosebire de sistemul de gel slab, laserul și fotometrul sunt fixe și imobile și pot activa și citi mai multe capilare side-by-side simultan ca fluxuri de date separate: acest lucru evită problema urmăririi benzilor separate într-un gel slab. Datele de mobilitate sunt trimise către un computer și se generează o cromatogramă pentru fiecare probă care este în esență identică cu cele ale sistemului slab gel. secvențiatoarele capilare folosesc de obicei un robot pentru a încărca automat un teanc de plăci de probă. Matricea capilară este spălată cu tampon între plăci, astfel încât mașina să poată fi lăsată să funcționeze nesupravegheată pentru multe rulări. În cele mai mari instalații, reacțiile PCR pot fi, de asemenea, legate direct de plăcile de secvențiere din stațiile de lucru robotizate care deservesc zeci sau sute de secvențiatoare capilare. Datele cromatogramei sunt plasate pe un server și pot fi descărcate de utilizatori la sute sau mii de mile distanță. Economiile de scară pot face mai ieftină externalizarea secvențierii ADN-ului, mai degrabă decât cumpărarea, Întreținerea și personalul unei mașini interne.