rezumat
Carbendazimul, ca fungicid, a fost utilizat în mod obișnuit pentru controlul bolilor fungice în agricultură, silvicultură și medicamente veterinare. În acest studiu, toxicitatea acută și reproductivă a carbendazimului a fost evaluată utilizând Caenorhabditis elegans (C. elegans) ca model pentru a evalua preliminar riscurile potențiale ale acestui fungicid în producția și aplicarea agricolă. Rezultatele au arătat că creșterea C. elegans a fost inhibată de 0,01 octogg / l carbendazim. Tratamentul cu carbendazim de 0,1% / l a determinat o scădere semnificativă a comportamentului de locomoție și o deteriorare semnificativă a sistemului reproductiv și antioxidant, determinând scurtarea drastică a duratei de viață a nematodelor. Aceste rezultate oferă o mai bună înțelegere a riscului de mediu al carbendazim și ridică noi preocupări cu privire la siguranță.
1. Introducere
pesticidele, un fel de reactivi chimici sau biologici, sunt utilizate pe scară largă în agricultură pentru a regla creșterea plantelor și a controla bolile și dăunătorii insectelor, care pot promova creșterea culturilor și îmbunătăți randamentul culturilor . Cu toate acestea, utilizarea pe scară largă a pesticidelor va duce la diferite grade de reziduuri în culturi sau alimente și, astfel, va afecta sănătatea umană . Problemele reziduurilor de pesticide nu numai că au atras atenția consumatorilor, dar au devenit și unul dintre factorii cheie care afectează siguranța alimentară .
Carbendazim, ca fungicid cu spectru larg, a fost utilizat pentru controlul bolilor fungice în agricultură, silvicultură și medicamente veterinare . Cu toate acestea, carbendazim este clasificat în categoria substanțelor chimice periculoase de către Organizația Mondială a sănătății și a fost clasificat în lista prioritară a substanțelor chimice care perturbă sistemul endocrin de către Comisia Europeană . În ultimii ani, este evident că utilizarea pe scară largă a carbendazim cu supra-interval și supradozaj și faptul că carbendazim este greu de degradat, ambele duc la problema reziduurilor de carbendazim în agricultură . Deși efectul toxic al carbendazimului a fost raportat încă din anii 1980, toxicitatea carbendazimului devine un subiect fierbinte din cauza îngrijorării crescânde cu privire la perturbatorii endocrini de mediu . Carbendazimul a fost interzis în mai multe țări din cauza impactului său negativ asupra mediului și sănătății, cum ar fi tulburările de dezvoltare și reproducere, toxicitatea și Mutagenitatea . Efectele adverse ale carbendazimului asupra parametrilor biochimici, histopatologici și hematologici din ficat, rinichi și glandele endocrine și nivelurile lor hormonale au fost ilustrate la șobolani . În plus, este nevoie de studii suplimentare privind concentrația scăzută datorată reziduurilor de carbendazim.
Caenorhabditis elegans (C. elegans), ca model important de cercetare, este utilizat pe scară largă pentru a face unele evaluări. Potrivit lui Amrit și colab. , C. elegans are multe avantaje, cum ar fi dimensiunile mici, timpul de generare rapidă, ușor de cultivat în laborator și durata de viață scurtă a adulților. C. elegans a fost ales în acest studiu ca organism model pentru evaluarea toxicității concentrației scăzute de carbendazim, care poate fi considerată o valoare de referință pentru aplicarea carbendazimului în agricultură.
2. Materiale și metode
2.1. Produse chimice și tulpini
Carbendazim (Puritate 99%; Aladdin, 5% Biochemical Technology Co., LTD, Shanghai, China) a fost dizolvat în n, n-dimetilformamidă (DMF; Sinopharm Chemical Reactiv Co., LTD, Shanghai, China) pentru a produce 1 g/l carbendazim soluție originală. Concentrațiile de DMF au fost de 0,1% în soluțiile finale de expunere (0.01, 0.1, 1, 10, 100 -l). 0, 1% DMF fără carbendazim a fost grupul de control. C. elegans (tip sălbatic N2) au fost obținute inițial de la Centrul de genetică Caenorhabditis (Universitatea din Minnesota, MN, SUA). Nematodele au fost cultivate pe plăci de mediu de creștere a nematodelor (NGM), care au fost însămânțate cu Escherichia coli OP50 la 20 C, conform descrierii . L1-larva C. elegans au fost colectate prin spălarea nematodelor gravide cu un amestec de albire (1 m NaOH, 10% NaHOCl).
2.2. Letalitate
soluțiile originale Carbendazim (1 g / L) au fost diluate cu mediu lichid S (1,12 G K2HPO4, 5,92 G KH2PO4 și 5,85 g NaCl au fost diluate cu 1 L apă) pentru a obține concentrațiile finale de carbendazim de 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, și 1 mg / L, care conținea 0,1% DMF. S mediu lichid cu 0,1% DMF a fost grupul de control. 30 de nematode (L4) au fost testate în plăci cu 96 de puțuri pentru fiecare concentrație. Supraviețuirea nematodelor a fost numărată la microscop după cultivare timp de 24 de ore în incubator. Procesul testului se bazează pe metoda lui Xiang și colab. . Au fost necesare trei experimente paralele.
2.3. Comportament de locomoție
cel puțin 10 C. elegans (L4) au fost culese aleatoriu din fiecare concentrație pentru a determina comportamentul locomotivei, care a fost înregistrat atât de frecvența capului-thrash, cât și de timpii de îndoire a corpului . Numărul frecvenței capului-thrash a fost calculat prin schimbări în direcția de îndoire la mijlocul corpului lui C. elegans în 1 min. Măsurarea curburii corpului a fost definită ca timpii schimbărilor de direcție ale părții nematodelor cultivate în NGM fără E. coli OP50 în 30 s.
2.4. Au fost analizate testele de creștere și dezvoltare
C. elegans expuși la carbendazim timp de 24 de ore. Lungimea corpului nematodelor expuse la carbendazim a fost evaluată de software-ul Image J. Descendența fiecărui C. elegans de la larvele L4 la Ziua 1 a fost înregistrat în stadiul L3 după transferul individual pe o placă nouă în fiecare zi până la încetarea reproducerii . Au fost efectuate cel puțin trei teste paralele.
2.5. Analiza duratei de viață
toate C. elegans testate pentru durata de viață au fost cultivate în aceeași stare la 20 C. C. elegans sincronizate au fost cultivate în plăci NGM cu concentrații diferite de carbendazim până în ziua 4. Nematodele testate vor fi apoi transferate în plăci NGM noi la fiecare 2 zile. Supraviețuitor și mort C. elegans au fost înregistrate zilnic (începând cu prima zi de maturitate) până când toate nematodele pentru fiecare concentrație au murit . Au fost efectuate cel puțin trei teste paralele.
2.6. Determinarea daunelor Oxidative
Ros intracelular a fost măsurată cu diacetat de 2′,7′-diclordihidrofluorosceină (H2DCFH-DA), care este de departe cea mai comună și sensibilă sondă reactivă de detectare a oxigenului. Tipul sălbatic N2 C. elegans au fost spălate în tampon M9 și apoi perturbat ultrasonically. Supernatantul a fost analizat nivelul ROS urmând instrucțiunile kitului ROS. Concentrația finală de lucru a H2DCHE-DA a fost de 10%. Lungimile de undă de excitație și de absorbție a emisiilor au fost de 485 nm și, respectiv, 535 nm. Au fost efectuate cel puțin trei teste paralele.
superoxid dismutaza totală intracelulară (t-SOD) a fost determinată conform instrucțiunilor kitului T-SOD achiziționat de la Institutul de Bioinginerie Nanjing Jiancheng. După spălarea cu M9 de trei ori, nematodele examinate au fost perturbate ultrasonic și au reacționat cu un kit T-SOD. Lungimea de undă a absorbanței a fost de 550 nm. În plus, supernatantul a fost utilizat pentru a detecta nivelul de proteine pentru fiecare concentrație, în care lungimea de undă a absorbanței a fost de 595 nm. Au fost efectuate cel puțin trei teste paralele.
2.7. Analiza datelor
toate datele au fost date ca Eroare standard medie a valorii medii (sem) prin utilizarea ANOVA unidirecțională. Graficele au fost prezentate folosind Origin 8.5 și GraphPad Primer 7, iar analiza statistică a fost efectuată utilizând software-ul SPSS 19.0. Nivelul de semnificație statistică a fost realizat folosind și .
3. Rezultate
3.1. Determinarea comportamentului de locomoție al C. elegans after Carbendazim Acute Exposures
LC50C. elegans were exposed to carbendazim for 24 hours to assess its acute toxic effects. Data are represented as shown in Table 1, and the obtained linear fitting equation was y = 2.180x − 0.223 through data analysis. The obtained LC50 is 0.867 mg/L.
|
||||||||||||||||||||||||||||||
Next, we assayed the determination of the locomotive behavior of C. elegans după carbendazim expuneri acute prin analiza datelor despre frecvența capului-thrash și timpii de îndoire a corpului nematodelor (Figurile 1(a) și 1(b)). Ambele au prezentat scăderi semnificative ale concentrațiilor de carbendazim variind de la 0,01%/l la 100%/l (). În plus, loviturile de cap ale nematodelor expuse la 100 hectog/l au scăzut la 68,27%. Pentru testul curbelor corporale, atunci când concentrațiile de carbendazim au fost de 10%/L și 100 de%/l, a avut un efect inhibitor semnificativ asupra curbelor corporale ale C. elegans cu 36,77% și, respectiv, 35,48% comparativ cu cel de control.
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
3.2. Determinarea creșterii și dezvoltării C. elegans după expunerile acute la Carbendazim
comparativ cu grupul de control [Figurile 1 (c) și 1(d)], Lungimea corpului și suprafața corporală au fost semnificativ () reduse în grupurile de expunere de la 0,01%/l la 100%/L. ambele au scăzut cu 19,16% și, respectiv, 22,15% la tratamentul de 0,01% / l comparativ cu grupul de control. Concentrația de 10% / l a prezentat cele mai negative impacturi, iar lungimea și suprafața corporală a C. elegans au scăzut cu 35,21% și respectiv 65,22% comparativ cu lotul martor.
3.3. Determinarea mărimilor puietului de C. elegans după expunerile acute la Carbendazim
conform figurii 2, mărimile puietului de nematode au avut o scădere semnificativă () în loturile de tratament de la 0,1%/l la 100%/L. mărimile puietului de C. elegans au scăzut cel mai semnificativ, ceea ce a scăzut la 43,71% cu tratamentul de 10%/L comparativ cu lotul martor.
3.4. Determinarea duratei de viață a C. elegans după expunerile acute la Carbendazim
durata de viață A C. elegans a fost semnificativ inhibată de 0,01%/l până la 100%/L % conform curbei duratei de viață prezentată în Figura 3. Rezultatele au arătat că durata de viață a C. elegans a fost scăzută de la 24 la 20 de zile cu tratamentul cu 0, 01 octogon/l carbendazim. Durata de viață a nematodelor tratate cu carbendazim de 0,01% a fost redusă cu 20,00%. Atunci când concentrația de expunere la carbendazim a fost de 100 hectog/l, durata de viață A C. elegans a fost redusă cel mai mult cu 45,83%.
3.5. Efectele expunerii Acute la Carbendazim asupra sistemului Antioxidant al C. elegans
nivelurile ROS de control și C. elegans tratate la expunerea la carbendazim a diferitelor concentrații sunt prezentate în Figura 4(a). S-a indicat că nivelul ROS intracelular a fost semnificativ crescut () la intervale cuprinse între 0,01 hectolitri/l și 100 centolari/l carbendazim. Comparativ cu cel de control, nivelul ROS a fost crescut cu cel mult 70,60% la tratamentul de 10 hectogg/L. Conform rezultatelor nivelurilor de SOD intracelulare, a avut o creștere la tratamentul de la 0.01-100-100-x-x/l carbendazim [Figura 4 litera (b)]. Nivelul SOD a fost majorat cu 10,70% la 0,1 hectolitri/l carbendazim comparativ cu lotul martor.
(a)
(B)
(A)
(b)
4. Discuție
Carbendazim, ca fungicide, este utilizat pe scară largă în agricultură pentru a inhiba creșterea ciupercii. Carbendazim a fost interzis să se utilizeze în Australia, cea mai mare parte a Uniunii Europene și SUA din cauza toxicologiei sale severe și a naturii persistente . Pentru acest studiu, a fost prima dată când a folosit C. elegans ca organisme model pentru a evalua efectele carbendazimului asupra comportamentului locomotivei, creșterii și dezvoltării, reproducerii, duratei de viață și sistemelor antioxidante. Mai mult, rezultatele au arătat că a avut o influență negativă asupra lui C. elegans.
conform 24 h-LC50, concentrația de toxicitate acută a C. elegans expus la diferite concentrații de carbendazim este de 0,867 mg/L. 96-h LC50 de carbendazim ca răspuns la peștele zebră a fost ilustrată ca 1,75 mg / l . Ouăle crapului prusac Carassius gibelio au prezentat efectele de toxicitate la concentrația de 0,036 mg/L . Studiile au arătat că creșterea și dezvoltarea Navicula sp. este inhibat de carbendazim cu o valoare de 24 h-CE50 de 2,18 mg/L. deși rata de creștere a algelor este recuperată după expunerea la 72 h, conținutul de clorofilă-a rămâne semnificativ scăzut atunci când tratamentul cu carbendazim a depășit 0,5 mg/l . În acest prezent, C. elegans expuși la o concentrație scăzută de carbendazim au fost selectați pentru a evalua efectele sale în funcție de concentrația reală a expunerii zilnice umane. Concentrațiile scăzute de carbendazim nu înseamnă că este sigur. Carbendazim prezintă efecte biologice negative la doze mult mai mici în unele studii.
comportamentul locomotivei a fost evaluat pentru a evalua neurotoxicitatea C. elegans (larva L4) după expunerea 24-h la carbendazim. Rezultatele au arătat că carbendazimul ar putea avea efecte negative asupra comportamentului locomotivei prin detectarea lovirii capului și îndoirii corpului C. elegans, care ambele au fost mai sensibile la grupul de expunere mai mare. Comportamentul locomotivei embrionilor de pește zebră expuși la carbendazim este sensibil . Studiile anterioare au arătat că peștii au un comportament anormal atunci când concentrațiile subletale de carbendazim sunt de 0,22–0,43 mg/l .
malformațiile de dezvoltare ar putea fi, de asemenea, un motiv pentru locomoția anormală . Creșterea și dezvoltarea C. elegans au fost analizate în studiul nostru. Rezultatele au arătat că lungimea corpului și aria corpului C. elegans au fost reduse semnificativ la tratamentul care depășea 0,01 octogon/l carbendazim. Creșterea normală a vertebratelor este legată de homeostazia hormonului tiroidian metabolic . Williams și colab. au indicat că carbendazimul poate determina pierderea spermei după implantare, malformații fetale și creștere și dezvoltare lentă.
toxicitatea asupra funcției de reproducere a carbendazimului a fost demonstrată că carbendazimul poate inhiba polimerizarea microtubulilor celulelor fungice și de mamifere, determinând perturbarea ansamblului microtubulilor prin acțiunea cu tubulina-tubulină, ceea ce duce la afectarea segregării cromozomilor în procesul de diviziune celulară . Formarea microtubulilor prin legături noncovalente ale tubulinei de la XV – și de la XV-este responsabilă pentru segregarea cromozomilor în procesul de mitoză și meioză . Mărimea puietului de C. elegans scade semnificativ la concentrația de carbendazim de 0,1 octogg/L. S-a constatat că carbendazimul afectează sistemele de reproducere la prepelițele și hamsterii Japonezi . S-a ajuns la concluzia că durata de viață a C. elegans a fost semnificativ redusă cu concentrația de carbendazim de 0,01 0XT/l pe baza studiului nostru. Studiile au arătat că carbendazimul a dus la infertilitate și toxicitate pentru dezvoltare și manifestă toxicitate embrionară, apoptoză a celulelor germinale și teratogeneză la diferite specii de mamifere .
apoptoza este o moarte celulară programată complexă, care este un fenomen foarte reglementat caracterizat printr-o serie de procese celulare . Multe studii au prezentat că producția de ROS indusă de stresul oxidativ este legată de moartea celulelor apoptotice . Studiul nostru a constatat că carbendazim ar putea induce o creștere semnificativă a nivelului valorilor ROS și o mică creștere a nivelului valorilor SOD. Stresul oxidativ cauzat de poluarea mediului induce expresia crescută a ROS și, ulterior, dăunează sistemului de apărare antioxidant . SOD este responsabil pentru detoxifierea radicalilor liberi toxici și a activităților acestora, care este utilizat pentru a evalua nivelul de stres oxidativ și starea antioxidantă celulară . Metaloenzima SOD accelerează transformarea radicalilor superoxid citotoxici endogeni în H2O2, iar creșterea nivelurilor de expresie a SOD poate contribui la îmbunătățirea activităților enzimatice pentru a elimina radicalii superoxid induși de carbendazim și pentru a preveni apariția disfuncției celulare în timpul expunerii la carbendazim . Concentrațiile mai mari de expunere la carbendazim ar putea provoca stres oxidativ sever, care ulterior distruge echilibrul homeostaziei celulare și favorizează apoptoza . Cu toate acestea, carbendazim în concentrații scăzute ar putea deteriora în mod semnificativ sistemul reproductiv în funcție de rezultatele noastre.
5. Concluzie
Din câte știm, studiul de față a evaluat siguranța carbendazimului expus la C. elegans pentru prima dată. Acesta a demonstrat că carbendazim ar putea avea un efect dăunător asupra comportamentului locomotivei, dezvoltării și creșterii, reproducerii, duratei de viață și sistemului antioxidant al C. elegans. Sper că trebuie să acorde mai multă atenție aplicării carbendazim pe baza rezultatelor. În plus, siguranța utilizării carbendazim trebuie evaluată în continuare, în special toxicitatea bioacumulării și efectele genotoxice potențiale.
disponibilitatea datelor
toate datele generate sau analizate în timpul acestui studiu sunt incluse în acest articol.
conflicte de interese
autorii declară că nu au conflicte de interese.
mulțumiri
această cercetare a fost susținută de Fundația Națională de științe Naturale din China (31501569).
