rezumat
canalele de calciu de tip L cu tensiune Cav1.2 cuplează depolarizarea membranei la creșterea tranzitorie a concentrației de Ca2+ liber citoplasmatic care inițiază o serie de funcții celulare esențiale, inclusiv contracția musculară cardiacă și vasculară, expresia genelor, plasticitatea neuronală și exocitoza. Inactivarea sau încetarea spontană a curentului de calciu prin Cav1.2 este un pas critic în reglarea acestor procese. Semnificația fiziopatologică a acestui proces se manifestă în hipertensiune arterială, insuficiență cardiacă, aritmie și o serie de alte boli în care accelerarea degradării curentului de calciu ar trebui să prezinte o funcție benefică. Problema centrală a acestei lucrări este inactivarea canalului de calciu Cav1.2 mediat de determinanți multipli.
1. Introducere
curentul intern Ca2+ () este un mecanism comun de creștere tranzitorie a concentrației de Ca2+ liber citoplasmatic declanșată de depolarizarea celulară. Această formă de semnalizare Ca2+ activează procesele celulare esențiale, inclusiv contracția cardiacă , reglarea tonusului muscular neted , expresia genelor, plasticitatea sinaptică și exocitoza . Terminarea completă și rapidă a influxului de Ca2+ este mediată de un mecanism complicat de inactivare spontană a canalului de calciu, care este crucial pentru prevenirea supraîncărcării Ca2+ a celulei în timpul potențialelor de acțiune și restabilirea concentrației de Ca2+ citoplasmatice libere sub-de repaus . Această lucrare se va concentra pe baza moleculară și determinanții multipli ai inactivării canalului de calciu Cav1.2.
2. Cav1. 2: provocări și soluții
2.1. Complexitate moleculară
canalul de calciu Cav1.2 este un complex oligomeric compus din subunitățile A1C, inkt2, INT și int . Porul canalului ionic este format din peptida A1C (Figura 1) Care este codificată de gena CACNA1C. Auxiliar β și α2δ subunități sunt esențiale pentru expresie funcțională și membrana plasmatică (PM) de direcționare a canalului . Ele există în mai multe izoforme genomice generate de patru gene CACNB (CACNB1–4) și trei gene CACNA2D (CACNA2D1–3). Toate cele trei subunități sunt supuse unei îmbinări alternative. Adăugându-se la complexitatea organizării moleculare Cav1.2, subunitățile de la suta au tendința de a oligomeriza . Toate împreună, variabilitatea genomică, îmbinarea alternativă și hetero-oligomerizarea generează o multitudine de variante de îmbinare Cav1.2 care sunt exprimate în celule în manieră dependentă de specii, țesuturi și dezvoltare, în timp ce schimbarea echilibrului lor fin poate avea consecințe patofiziologice semnificative .
2.2. Provocările în selectarea celulei gazdă
diversitatea naturală a Cav1.2 complică interpretarea datelor obținute din celulele native, să nu mai vorbim de datele cu un singur canal. Aceasta subliniază importanța cercetării Cav1.2 în sistemele de Expresie recombinante în care compoziția moleculară a canalului și structura constituenților săi sunt predefinite. Cu toate acestea, această abordare experimentală a întâmpinat problema majoră a selecției unei celule gazdă adecvate.
majoritatea studiilor privind canalele de calciu au fost efectuate folosind celule HEK293. Aceste celule asigură o eficiență ridicată a expresiei canalelor de Ca2 + recombinante, dar, din păcate, conțin canale de calciu endogene care prezintă curenți de Ca2+ până la 3 pA/pF . Astfel, celulele HEK293 permit studiul adecvat al canalelor recombinante Ca2 + numai atunci când Amplitudinea curentului este suficient de mare pentru a ignora contribuția canalelor endogene. Cu toate acestea, evaluarea corectă a determinanților funcționali ai canalelor Ca2+ necesită utilizarea celulelor gazdă care sunt complet lipsite de subunități endogene de canal Ca2+. Celulele COS1 sau COS7 se potrivesc bine acestei cerințe, deoarece nu generează curent de calciu apreciabil, nu conțin subunități endogene de canal Ca2+ sau precursorii acestora și nu prezintă inducerea subunităților endogene Cav1.2 ca răspuns la expresia celor recombinante . Parametrii cinetici și dependența de tensiune a activării și inactivării curenților canalului Cav1.2 măsurați în celulele COS1 sunt în concordanță cu datele obținute în alte sisteme de Expresie . Un avantaj important al celulelor COS este rata lor de diviziune relativ lentă, care permite un control mai bun asupra eficienței expresiei și asamblării subunităților canalului Cav1.2 de dimensiuni diferite.
2.3. Probleme de etichetare și măsurare fluorescentă
fuziunea fluoroforilor asemănători GFP la terminalele N-și/sau C ale A1C recombinant sau la capătul N – al XV nu modifică semnificativ proprietățile electrofiziologice ale canalelor exprimate, permite aplicarea microscopiei fluorescente și FRET (transfer de energie prin rezonanță fluorescentă) la studiul distribuției și asamblării subcelulare a Cav1.2, precum și aspecte complicate ale arhitecturii moleculare și dinamicii canalului. Canalul păstrează caracteristicile electrofiziologice majore neschimbate atunci când secvența C-terminală A1C codificată de exonii distali 46-50 (Figura 1, reziduuri 1833-2138 în a1C,77) este înlocuită cu ECFP. Cu toate acestea, A1C fuzionat de terminalele sale N – sau/și C la EYFP este foarte sensibil la fotobleaching care îl inactivează ireversibil. Cunoscută sub numele de inactivare a luminii asistată de fluorofor (fali), această proprietate interesantă limitează aplicabilitatea fotobleaching acceptor pentru măsurătorile FRET în Cav1.2 din cauza incertitudinii în starea funcțională a canalului . Cu toate acestea, analiza ratiometrică a FRET-ului corectat între fluorofori, fuzionată cu cozile subunităților A1C și/sau XV, reflectă rearanjările structurale reversibile dependente de stare ale canalului induse de modificările tensiunii transmembranare sub clema de plasture .
2.4. Cav1. 2 Recombinant: ce are nevoie pentru expresia funcțională și cum apare?
proprietățile tipice ale unui cav1.2 recombinant „de tip sălbatic” sunt ilustrate în Figura 2(a) folosind un exemplu de izoformă umană omniprezentă A1C,77 (GenBank nr. z34815). Când A1c marcat cu EYFP a fost exprimat numai în celulele COS1, proteina canalului marcat cu fluorescență a fost distribuită difuz peste citoplasmă și nu a generat curent de calciu măsurabil (Figura 2(a), Panoul a). Analiza cantitativă a distribuției A1C între PM și citoplasmă (Figura 2(B)) a confirmat lipsa unei direcționări semnificative a PM de către A1C în mod independent asupra prezenței de la a1c2 (barele a și B). Exprimarea Cav-ului in absenta cav-ului a stimulat tintirea PM-ului de catre A1C, dar canalul a ramas tacut (Figura 2(A), panoul C), cu exceptia cazului in care a fost coexprimat modelul C. C. 2 (C), cu exceptia cazului in care s-a coexprimat modelul C. C. 2 (C) (panoul d). Astfel, β și α2δ subunități sunt suficiente pentru funcțională a canalului; în aceste condiții experimentale, β subunități stimula PM direcționare a canalului de complex și, în prezența α2δ, pentru a facilita tensiune de suprimare a fasciculului de Cav1.2 canal.
forma și aspectul curentului de calciu de vârf prezentat în Figura 2(a) (Panoul d) este destul de tipic pentru Cav1.2 cu modulație de la inkt2 . Caracteristicile sale majore includ rata relativ lentă de dezintegrare și o mare parte din restul susținut la sfârșitul pulsului depolarizant . Este clar că, în timpul potențialelor de acțiune de lungă durată, astfel de proprietăți pot duce la supraîncărcarea patogenă a calciului celulei dacă nu este echilibrată de mecanisme compensatorii robuste. A fost rolul final al Cav1.2 în definirea duratei potențialului de acțiune în celulele cardiace care au declanșat cercetarea și dezvoltarea blocantelor canalelor de calciu, o clasă de medicamente care până acum are o piață de miliarde de dolari. Acest rol al Cav1.2 stimulează interesul actual pentru identificarea determinanților moleculari ai inactivării Cav1.2 în speranța de a găsi medicamente mai specifice și mai eficiente.
2.5. Nu în ultimul rând o complicație: Clustering Cav1.2
un singur miocit ventricular conține ~300.000 canale Cav1.2, dar numai ~3% din canale sunt deschise la vârf . Contrar credinței populare, canalele Cav1.2 nu sunt distribuite uniform pe membrana plasmatică. În celulele musculare neuronale și cardiace native formează clustere mari. Imagistica monomoleculară a canalelor funcționale recombinante EYFPN-A1C/xft2a / xft2 XFT exprimate în celule HEK293 a evidențiat clustere compuse din ~40 de canale mobile în membrana plasmatică . Atât spectroscopia de corelație a fluorescenței, cât și recuperarea fluorescenței după experimentele de fotobleaching au dus la o constantă de difuzie laterală de mm2/s. semnificația funcțională a mobilității clusterelor Cav1.2 nu este clară. Se crede că în celulele musculare cardiace o astfel de mobilitate poate fi restrânsă prin interacțiuni cu alte proteine, de exemplu, receptorii ryanodinei . Mărimea clusterelor Cav1 .2 și densitatea lor specifică în membrana plasmatică depind de tipul de subunitate centsv exprimat. Distanța dintre terminalele subunităților vecine A1C variază de la 67 de la 0 la 79 de la 7 la 7 la 7 la 7 la 7 la 7 la 7 la 7 la 7. Cea mai mare densitate a clusterelor Cav1.2 din membrana plasmatică și cea mai mică dimensiune a clusterului au fost observate cu centic1b prezent. O perspectivă asupra mecanismelor moleculare care definesc arhitectura și proprietățile clusterelor Cav1.2 este importantă pentru o mai bună înțelegere a fiziopatologiei cuplării dintre activitatea Cav1.2 și răspunsurile induse în transducția semnalului Ca2+.
3. Inactivarea dependentă de tensiune și Ca2 + a canalului de calciu Cav1.2
în cazul canalelor de calciu Cav1.2, două mecanisme diferite controlează inactivarea curentului Ca2+. Un mecanism este condus de Ca2+ ioni pe partea citoplasmatică a membranei plasmatice, în timp ce celălalt depinde de tensiunea transmembranară. Experimental, înlocuirea Ca2 + pentru Ba2 + ca purtător de sarcină elimină inactivarea dependentă de Ca2+(CDI), astfel încât canalele de calciu conducătoare de Ba2 + se inactivează într-o manieră dependentă de tensiune prin mecanisme rapide (FI) și lente (SI). Aceste trei mecanisme de inactivare, FI, SI și CDI, și determinanții lor majori sunt ilustrați în Figura 3.
3.1. Inactivarea dependentă de Ca2+și domeniul de legare a Calmodulinei a1C
există mai mulți determinanți diferiți ai CDI, dar abia în 1997 site-ul de detectare a Ca2+a CDI a fost redus până la o porțiune a secvenței C-terminale de 80 de aminoacizi a a1C codificată de exonii 40-42 (Figura 2) marcată de blocul roșu în Figura 3(a) (Panoul a). O variație naturală de îmbinare în această regiune în a1C, 86(Figura 3 (B)) a inhibat complet CDI, deoarece este evident din lipsa decelerării curentului cu Ba2+ ca purtător de sarcină (panoul c, urmă neagră) în comparație cu (urmă roșie). O altă trăsătură caracteristică a CDI inhibată a fost lipsa dependenței de dimensiunea curentă a tensiunii (Figura 3 (B), panoul d, simboluri deschise) care rămâne în contrast cu dependența în formă de U a constantei de timp a inactivării rapide () de potențialul membranei în Cav1.2 de tip sălbatic(vezi Figura 3 (a), Panoul d). Două secvențe distincte, L și K, au fost identificate în cadrul acestei întinderi de 80 de aminoacizi ale căror mutații a1C,asemănătoare 86 în tipul sălbatic A1C se conformează acelorași trăsături caracteristice , sugerând existența a doi senzori CDI adiacenți. Una dintre ele a fost conturată în regiunea K ca motiv IQ de legare calmodulin- (CaM-) și, mai târziu, legătura motivului IQ cu CDI ca situsul funcțional de legare Ca2+-CaM A fost confirmată în trei studii independente prin utilizarea mutanților CaM lipsiți de afinitate la Ca2+. În mod corespunzător, motivul LA a fost legat de CDI ca site de legare apo-CaM înzestrat de starea de repaus a canalului. O singură moleculă CaM legată de acest domeniu de legare a camei dependent de Ca2+(CBD) al a1C este senzorul major Ca2+ al canalului .
variația de îmbinare a a1C în regiunea CBD A1C,86 nu numai că inhibă complet CDI, dar elimină și SI (Figura 3(B), panoul c) și privează canalul de sensibilitate diferențială la modulația subunității-subunitate (Figura 3(B), panoul e), în ciuda faptului că rămâne asociat cu A1C, 86 (Figura 3(B), panoul b). Acest lucru indică faptul că toate cele trei proprietăți ale canalului—CDI, si și modulația subunității-sunt legate între ele .
3.2. Inactivarea lentă
au fost prezentate o serie de dovezi că aminoacizii limitați la partea distală a segmentelor S6 din A1C joacă un rol important în SI . Studiul sistematic al acestei regiuni a evidențiat „determinantul anual al inactivării lente” (ADSI) ca o structură compusă din patru aminoacizi foarte conservați din patru segmente transmembranare S6, constituind capătul citoplasmatic al porilor (Figura 3(a), Panoul a). Mutația lor simultană (S405I în IS6, a752t în IIS6, V1165T în IIIS6 și I1475T în IVS6) generează canalul A1C, IS-IV. Analiza cineticii actuale a canalului A1C, IS-IV, a arătat o accelerare extraordinară a componentei inactivatoare rapide (10 ms) care cuprinde aproximativ 50% din amplitudinea totală (or). Inactivarea lentă dependentă de tensiune a a1C,IS-IV este complet inhibată, iar canalul rămâne conductiv pe durata depolarizării. Înlocuirea Ca2 + pentru Ba2 + ca purtător de sarcină (panoul c) nu a modificat semnificativ acest model de inactivare, în timp ce analiza dependenței de tensiune a pentru componenta inactivantă a prin canalul A1C,IS-IV (panoul d) a confirmat lipsa CDI. Înlocuirea standardului de circulație a mărfurilor de la clasa A 1-A la clasa a 2-a (Panoul e) nu a modificat inactivarea curentului canalului A1C,is-IV sugerând lipsa modulației diferențiale a subunităților de la clasa A 1-A, în timp ce analiza de coimunoprecipitare (panoul b) a furnizat dovezi directe ale asocierii dintre a1C,IS-IV și a 1-a.
luate împreună, rezultatele prezentate în Figura 3 sugerează că există o discuție încrucișată între ADSI, CBD și XV, susținută de interacțiuni directe între ele și / sau plierea conformațională specifică a constituenților pachetului polipeptidic care stă la baza porilor. Într-adevăr, atât interacțiunea cu CBD, cât și importanța conformației funcționale au fost demonstrate direct în celulele vii care exprimă cav1.2 recombinant.
3.3. Rolul Pliabilului A1C c-tail
microscopie cantitativă dependentă de tensiune FRET combinată cu clemă de plasture în celula vie a arătat că subunitatea A1C C-terminal tail este supusă unor rearanjări conformaționale reversibile cu tensiune . Ancorarea cozii C a1C la prospectul interior al membranei plasmatice prin domeniul omologiei pleckstrin (PH) fuzionat cu capătul C al a1C (A1C -) a abolit această rearanjare conformațională și a inhibat atât SI,cât și CDI (Figura 4(a)) într-un mod foarte similar cu cel observat cu A1C, IS-IV (Figura 3(C)). Această modificare care limitează mobilitatea terminusului carboxil A1C a avut implicații majore asupra transducției semnalului Ca2+. Activarea transcripțională dependentă de CREB asociată cu activitatea Cav1.2 a fost complet suprimată în ciuda robustului generat de canalul „ancorat în C” ca răspuns la depolarizare. Eliberarea A1C c-tail prin activarea hidrolizei PIP2 la activarea fosfolipazei C restabilește complet toate aceste funcții deficitare, inclusiv SI, CDI și cuplarea eficientă a transcripției dependente de CREB . Astfel, plierea funcțională specifică a cozii C-terminale A1C este crucială pentru inactivare. Este crucial pentru transducția semnalului, deoarece este conceput pentru a închide Ca2+ permeabil în CaM atașat la CBD și pentru a muta în mod eficient acest Ca2+ în cuști către ținte de semnalizare în aval asociate cu transcripția dependentă de CREB sau contracția musculară cardiacă . Mai presus de toate, această funcție are loc în strânsă coordonare cu stimulii extracelulari care activează canalul. În ceea ce privește transducția semnalului, SI este o blocare în interiorul canalului care este eliberată de Ca2+ care pătrunde pentru a accelera închiderea acestuia și a iniția mișcarea cozii C-terminale .
3.4. Rolul terminalului N a1C
toate funcțiile menționate mai sus depind și de integritatea terminalului n A1C. Proprietățile de inactivare ale canalului recombinant A1C/Secc/secc2 nu sunt modificate foarte mult de modificările structurale ale părții proximale a cozii n a1C, de exemplu, prin fuziunea unei proteine fluorescente , prin domeniul PH-ului sau prin îmbinarea alternativă a exonilor 1/1A care generează izoforma lungă a a1C . Prima analiză funcțională a efectului deleției parțiale a terminusului N-A1C a arătat că acesta este implicat în inactivare, în timp ce XV previne inhibarea canalului de către n-coadă. Folosind microscopie FRET combinată cu clemă de patch-uri, am constatat că inactivarea determină o reorientare reciprocă puternică a terminalelor a1C și a celor de la NH2, dar distanța lor față de-XV-față de membrana plasmatică nu este modificată în mod apreciabil . Această relativă lipsă de mobilitate este conferită de către Centrul de control al tensiunii într-un mod care facilitează răspunsul canalului la închiderea tensiunii. Experimentele privind decuplarea subunității A1C n-terminal tail de la reglarea canalului au fost efectuate în absența sec. Ancorarea cozii a1C n în prospectul interior al membranei plasmatice prin domeniul pH atașat a creat condiții în care PHN-A1C și xif2 XIF au fost suficiente pentru a genera un curent interior robust (Figura 4(B)). Cu toate acestea, acest canal este lipsit de CDI și de orice inactivare dependentă de tensiune. Într-adevăr, nici curentul Ba2+, nici Ca2+ nu au arătat o degradare apreciabilă (a se vedea urmele suprapuse). Eliberarea A1C n-tail la hidroliza PIP2 prin activarea fosfolipazei C a inhibat complet canalul cu deficit de XV . Proprietăți similare, cu excepția unei activări mult mai lente a curentului, au fost observate la ștergerea întregii (dar 4 aminoacizi) coada N-terminală a a1C (Figura 4(C)). Cu oricare tip de decuplare a cozii n-terminale A1C—fie printr—o ștergere, fie prin ancorare PM,-o întârziere în activarea curentului întregii celule pare să fie asociată cu prelungirea primei latențe. Înregistrările cu un singur canal au arătat că ștergerea n-tail a stabilizat în esență starea deschisă a canalului XVN-A1C/irakt2, care a arătat deschideri mai lungi în timpul depolarizării de lungă durată .
astfel, CDI este mediată de determinanții CBD ai cozii C a1C, de ADSI în regiunea porilor citoplasmatici și de plierea terminalelor a1C C și N. Calmodulina integrează acești determinanți, oferind un comutator dependent de Ca2 + care termină inactivarea lentă, eliberează coada c a1C și transferă Ca2+/calmodulina asociată acționând ca un stimul activator al transducției semnalului Ca2+.
3.5. Exprimare și Inactivarea Cav1.2 în Lipsa β și α2δ
Sunt β și α2δ subunități esențiale pentru expresie funcțională a Cav1.2 canal? Analiza efectelor exogene CaM (CaMex) pe expresie și proprietăți de Cav1.2 în lipsa uneia β sau α2δ demonstrat în mod clar că nici β nici α2δ este esențial. Supraexprimarea CaMex modifică doar ușor închizătoarea de tensiune a canalului A1C/centif2d / centif2 prin deplasarea dependenței de tensiune a activării și inactivării către potențiale mai negative, facilitând (dar nu accelerând) inactivarea și crescând densitatea de aproximativ 2 ori . CDI este reținut, așa cum este evident din efectul înlocuirii Ca2+ pentru Ba2+ ca purtător de sarcină care a crescut semnificativ cursul de timp al inactivării curentului [Figura 5 (a)]. Noua înțelegere a rolurilor de β și α2δ vine cu constatarea că CaMex face exprimare și de activitate ale a1C canal în absența β (Figura 5(B)) sau α2δ (Figura 5(C)), dar nu ambele subunități auxiliare. Deși CaMex nu are nicio legătură structurală cu cele de la circulatoriilecift2ciftcift, susține traficul, CDI și închiderea canalelor. Analiza cantitativă a arătat că CaMex nu a stimulat redistribuirea A1C în PM peste citoplasmă, dar a îmbunătățit semnificativ direcționarea membranei plasmatice a canalelor A1C/ctf2 CTF. Pe de altă parte, CaMex nu a amplificat distribuția relativă a canalelor A1C/ctf2d și A1C/ctf2d/ctf2ct în membrana plasmatică peste citoplasmă. Astfel, în funcție de subunitatea auxiliară prezentă, activitatea canalului suportată de CaMex A1C/ctf2d și A1C/ctf2 CTF se află sub controlul diferitelor mecanisme. În ciuda acestui fapt, canalele de subunitate Mono-auxiliare facilitate de CaMex prezintă proprietăți destul de similare, inclusiv cinetica de inactivare semnificativ mai lentă a curentului de calciu și o schimbare puternică a dependenței de tensiune a activării și inactivării către potențiale mai negative. Similar cu canalele convenționale A1C/ctf2d / ctf2, aceste canale păstrează CDI și sensibilitate ridicată la blocanții canalelor de calciu dihidropiridinice . Cu toate acestea, numai canalul A1c/XV / CaMex arată facilitarea curentului de calciu prin prepulse puternic de depolarizare (datele nu sunt prezentate).
deoarece CaM asociat cu CBD este implicat în CDI, este clar că efectul CaMex este mediat de diferite site-uri de legare a CaM. Unul dintre potențialii candidați ai unui astfel de sit este prezent în partea distală a cozii N-terminale A1C . Rămâne de văzut dacă acest sit joacă într-adevăr un rol integrator în pachetul de reglementare a mai multor determinanți moleculari care susțin inactivarea Cav1.2. O altă posibilitate limitează rolul CaMex la activarea cav1 silențios.2 în cadrul clusterelor mari, unde disponibilitatea locală limitată a CaM poate fi motivul activității fracționale scăzute descrise în secțiunea 2.5. Oricare ar fi mecanismele asociate cu reglarea Cav1.2 de către CaM, acestea par să aibă puține implicații practice pentru utilizarea în medicină în acest moment exact pentru că CaM este o peptidă omniprezentă și multifuncțională care reglează multe alte funcții celulare, în timp ce prezența sa în Cav1.2 este vitală pentru CDI.
4. -modulația subunității Cav1.2
variabilitatea moleculară remarcabilă a subunităților de la un număr de sute, reflectată în proprietățile de inactivare alterate ale Cav1.2 modulate diferențiat , exemplificată în Figura 3(a) (panel e), prezintă o nouă oportunitate pentru dezvoltarea unor abordări inovatoare în tratamentul bolilor asociate cu manipularea necorespunzătoare a Ca2+. Câteva observații recente oferă o bază pentru o viziune atât de optimistă. În primul rând, subunitățile de la sută prezintă o tendință de a forma homo – și hetero-oligomeri care a fost demonstrată direct printr-o varietate de tehnici biochimice atât în celulele native, cât și în sistemul de Expresie recombinant. In timp ce o augmentare a homooligomerizarii de la suta la suta mareste semnificativ densitatea , heterooligomerizarea variantelor de imbinare de la suta la suta la suta la suta la suta la suta la suta la suta la suta la suta la suta la suta la suta la suta la suta la suta la suta la suta la suta la suta la suta. Oligomerizarea de la XV este mediată de mai mulți determinanți moleculari și, prin urmare, are nevoie de intervenții multiple pentru a fi gestionate, de exemplu, în cazul supraexprimării patogene a de la 72. Cu toate acestea, se pare că este mai fezabil să se vizeze chiar și pe cei de la CTX2; determinantul molecular al inactivării lente și incomplete specifice pentru C2 (a se vedea Figura 2(a), Panoul d) a fost identificat ca fiind determinantul C-terminal de 40 de aminoacizi (ctx2ced) prezent în toate cele 7 variante de îmbinare cunoscute în mod natural, CTX2. Decuplarea interacțiunii sale Ca2 + și independente de CaM cu CBD(Figura 3 (a), Panoul a) recuperează proprietățile de inactivare caracteristice pentru cav1.2 modulată cu modulație de la inactivarea rapidă și completă a , așa cum s-a arătat în experimentele de ștergere. Din punctul meu de vedere, o astfel de decuplare selectivă a centa2ced de la legarea la receptorul său în CBD este o nouă strategie atractivă pentru gestionarea supraîncărcării Ca2+, deoarece alte subunități ale centa2 nu trebuie afectate. Mai mult, se va păstra o discuție încrucișată între Cav1.2 și cea mai apropiată țintă Ca2+/proteină kinază ii dependentă de CaM.
5. Concluzii
această lucrare a demonstrat că știm cum să accelerăm inactivarea Cav1.2 la mai puțin de 10 ms (Figura 3(C)), să o privăm complet de inactivare (figurile 4(B) și 4(C)), sau să eliminăm dependența expresiei sale de la inactiv2 sau de la inactiv2 fără consecințe semnificative pentru inactivare. Am subliniat rolurile finale ale terminilor a1C și CaM pentru inactivare și totuși niciunul dintre aceste studii nu ne-a adus mai aproape de obiectivul final de gestionare a manipulării greșite a calciului asociat cu Cav1.2 cu excepția blocantelor vechi și, din păcate, nu prea selective ale canalelor de calciu. Singura nouă țintă fezabilă este modularea patogenă a cav1.2, în care se stabilește interacțiunea efector-receptor.în ceea ce privește biologia moleculară, Cav1.2 este cu siguranță printre cele mai complicate sisteme de reglementare cunoscute. Diversitate moleculară remarcabilă a fiecăruia dintre Cav1.2 constituenți dă naștere la mai multe variante genetice/de îmbinare ale canalului care sunt supuse segregării în grupuri mari și diverse și schimbării funcționale continue prin homo – și hetero-oligomerizarea componentelor de semnalizare și a altor componente, ca să nu mai vorbim de specii, țesuturi și variabilitate de dezvoltare. Suntem surprinși de redundanța proprietăților mai multor izoforme Cav1 .2 și suntem și mai surprinși atunci când unele dintre ele, care prezintă doar proprietăți electrofiziologice „convenționale”, se dovedesc a fi asociate cu o boală. În căutarea unei explicații, înțelegerea noastră nu ar trebui să se concentreze intuitiv doar pe caracteristicile curentului de calciu-dependența de tensiune, amplitudinea și durata. Răspunsul final , cum ar fi organizarea spațială și temporală a evenimentelor de semnalizare CREB asociate cu izoforma Cav1.2 specifică și concurența sa cu alte mecanisme de semnalizare (de exemplu, dependente de cAMP) sau cu alte izoforme Cav1.2 prezente, pot oferi idei noi și deschide noi frontiere pentru investigarea rolurilor variantelor individuale de îmbinare Cav1.2 în celulele și țesuturile normale și bolnave.
Abbreviations
| ADSI: | Annual determinant of slow inactivation |
| CaM: | Calmodulin |
| CBD: | Calmodulin-binding domain |
| CDI: | Ca-dependent inactivation |
| ECFP: | Enhanced cyan fluorescent protein |
| EYFP: | Enhanced yellow fluorescent protein |
| FALI: | Fluorophore-assisted light inactivation |
| FI: | Fast inactivation |
| FRET: | Fluorescent resonance energy transfer |
| GFP: | Green fluorescent protein |
| SI: | Slow voltage-dependent inactivation. |
