CPZ atenuează colita independent de TRPV1

pentru a contesta mecanismul prin care clismele CPZ atenuează colita experimentală, am indus colita sulfat de dextran sodic (DSS) în-șoareci cu deficit (fiecare grup N = 8). Deși există rapoarte contradictorii, șoarecii cu deficit de TRPV1 au dezvoltat colită DSS și pierdere în greutate în același grad ca șoarecii WT congenic din laboratorul nostru, care respectă rezultatele noastre din modelul de colită TNBS pe care l-am publicat anterior7,8,9,10,11,12. Pentru tratamentele cu clisme CPZ, am folosit aceeași concentrație de CPZ (531 inqqm) care a fost raportată anterior pentru a atenua colita DSS (5%) la șobolani8. Cursul colitei a fost monitorizat zilnic prin măsurători ale greutății corporale și endoscopie. Aplicările de două ori pe zi ale clismei CPZ (531 MMC) au atenuat colita DSS în același grad atât la șoarecii WT, cât și la TRPV1−/−, ceea ce s-a reflectat printr-un scor endoscopic îmbunătățit și o pierdere redusă a greutății corporale (Fig. 1A-C). H&e petele de pe colonul distal la sfârșitul experimentului DSS de 7 zile au relevat arhitectura țesutului mucoasei distruse cu numeroase celule imune infiltrate în colonii de control. Acest lucru a fost în contrast puternic cu o mucoasă intactă pe scară largă și absența unei infiltrări semnificative a celulelor imune în coloanele șoarecilor tratați cu CPZ din ambele genotipuri (Fig. 1D). În conformitate cu aceste constatări, scorul histologic a fost puternic redus la șoarecii tratați cu CPZ pentru ambele genotipuri (Fig. 1E).

CPZ activează TRPA1

observația in vivo că clismele CPZ au inhibat efectiv colita la șoarecii mutanți TRPV1 null a impus întrebarea asupra efectelor neuronale independente de TRPV1 ale CPZ. Deoarece TRPA1 s-a dovedit a fi crucial în diferite modele de inflamație,inclusiv colita6,12, 14, Am testat dacă CPZ acționează asupra TRPA1.

curenți ionici induși de CPZ prin hTRPA1

au fost efectuate experimente cu clemă de Patch-uri în modul clemă de tensiune pe celule HEK293t care exprimă htrpa1 recombinant (celule hTRPA1-HEK293t). La un potențial de deținere de -60 MV, CPZ (10 MMCT) a indus un curent interior care a fost aproape complet inhibat (inhibare 93%, n = 5) de către antagonistul selectiv TRPA1 HC-030031 (HC, 10 MMCT) (Fig. 2A). În toate celulele în care s-a înregistrat un curent interior indus de CPZ, carvacrol (100 centimetri) un agonist TRPA1 stabilit, a evocat, de asemenea, curenți interiori mari la același potențial de reținere, demonstrând expresia funcțională a hTRPA1. Aceste celule hTRPA1-HEK293 au fost, de asemenea, supuse la rampe de tensiune de la -100 la +100 mV de 400 ms durată la fiecare 4 s (Fig. 2B). Relația curent-tensiune indusă de CPZ a afișat o rectificare ușor spre exterior și un potențial de inversare apropiat de 0 MV (Fig. 2C). Curenții evocați de CPZ (10 MMC) au fost inhibați de HC (10 MMC). Efectul a fost mai pronunțat la potențialele negative (89% inhibare 5% la -80 MV, media SD la suta, n = 7) decât la potențialele pozitive (80% inhibare la 9% la +80 MV).

influxul de calciu indus de CPZ prin hTRPA1

acțiunea selectivă a CPZ asupra TRPA1 a fost confirmată prin utilizarea tehnicii microfluorimetriei calciului. celulele hTRPA1-HEK293 au fost stimulate prin două aplicații de CPZ (50 xqqm) timp de 10 s la intervale de 5 minute (Fig. 2D). Antagoniștii selectivi HC (20 MMC) și a-967079 (10 MMC) au fost aplicați timp de 1 minut înainte și în timpul primei probe CPZ. Răspunsul CPZ a fost complet eliminat de ambii antagoniști. Este de remarcat faptul că eliminarea HC a dus la un aflux de calciu, probabil datorită acțiunii CPZ reziduale, în timp ce acest efect off a fost absent în cazul A-967079 care se poate desprinde mai lent (Fig. 2D). Apoi am analizat dependența de concentrare a efectelor CPZ. S-au aplicat concentrații crescute de CPZ (100 nM, 500 nM, 5 MMCT și 50 MMCT) celulelor hTRPA1-HEK293 timp de 20 s fiecare la intervale de 3 minute. Începând cu 100 nM, toate concentrațiile de CPZ au evocat tranzitorii de calciu cu amplitudini din ce în ce mai mari (Fig. 2E). Carvacrol (100 MMCT) a fost aplicat la sfârșitul experimentului pentru a controla expresia funcțională TRPA1, dar răspunsul carvacrol după 50 MMCT a fost vizibil mic, sugerând desensibilizarea încrucișată. Celulele hek293 netransfectate au fost supuse acelorași aplicații CPZ și numai cea mai mare concentrație testată (50 centicm) a indus o creștere minimă a calciului. Ne-am așteptat ca CPZ să angajeze cele trei reziduuri critice de cisteină în domeniul n-terminal al canalului, deoarece este un compus electrofil. Celulele HEK293 care exprimă HTRPA1 în WT și celulele care exprimă mutantul triplu cisteină hTRPA1-3c (C621S, C641S, c665s) au fost supuse aplicării CPZ (1 inqtm, 20 s) urmate de agonistul non-electrofil carvacrol (100 inqtm, 20 s) și aitc foarte electrofil (50 inqtm, 30 s). Ionomicina a fost aplicată la sfârșitul experimentului ca un control pozitiv. Amplitudinea tranzitorie a calciului evocată de CPZ de 1 centicm a fost substanțial redusă (>80%) în celulele care exprimă hTRPA1-3c comparativ cu celulele care exprimă WT hTRPA1 (Fig. 2F), în timp ce diferența de sensibilitate CPZ între genotipuri a fost eliminată la concentrația de CPZ de 100 mm (Fig. 2G). Răspunsul AITC a fost scăzut în celulele mutante, în timp ce carvacrolul a evocat tranzitorii mari de ioni de calciu atât în mutanții WT, cât și în cei 3C. Luate împreună, aceste răspunsuri celulare indică faptul că potența relativ ridicată a CPZ depinde de cele trei cisteine critice. Cu toate acestea, atunci când concentrația de CPZ este de 100 de ori mai mare, alte site-uri de legare preiau activarea hTRPA1. Această concentrație ridicată a CPZ lipofilă ar putea interacționa, de asemenea, cu membrana lipidică celulară, activând indirect TRPA1, așa cum s-a arătat anterior pentru componenta lipidică a lipopolizaharidelor16. Mai mult, în prezența captatorului electrofil N-acetil cisteină (NAC) la o concentrație de saturație (15 mM), 50 de CPZ-uri nu au putut obține niciun răspuns. La îndepărtarea NAC, CPZ a evocat tranzitorii mari de calciu în celulele hek293t transfectate de hTRPA1 (Fig. 2H) care confirmă faptul că CPZ acționează ca un agonist electrofil pentru hTRPA1.

CPZ activează o subpopulație de neuroni sensibili la ganglionul rădăcinii dorsale (DRG) sensibili la AITC

neuronii DRG au fost menținuți în cultura primară și investigați prin microfluorimetrie de calciu. Celulele au fost stimulate de CPZ (50 xctm, 20 s), urmate de AITC (100 xctm, 30 s), capsaicină (CAP, 1 xctm, 10 s) și KCl (60 mM, 30 s). Figura 3A ilustrează Exemple de neuroni DRG care răspund la toți acești patru stimuli. O fracțiune tipică de neuroni DRG a fost activată de AITC (301 din 906 neuroni, 33%, n = 8 șoareci) indicând expresia funcțională a TRPA1. O subpopulație a acestor neuroni sensibili la AITC a fost, de asemenea, activată de CPZ (185 din 301 neuroni, 61%). Sensibilitatea la CPZ a fost aproape complet limitată la neuronii receptivi la AITC. Din totalul de 200 de neuroni sensibili la CPZ, 185 (93%) au fost, de asemenea, activate de AITC, indicând o concordanță puternică a sensibilităților la CPZ și AITC (Fig. 3). Ca și în cazul celulelor hek293 care exprimă hTRPA1, tranzitorii de calciu evocați de CPZ în neuronii DRG au fost dependenți de concentrație, cu o valoare EC50 estimată la 30 CPZ de la centimetrii, iar răspunsul AITC mic după 100 CPZ de la centimetrii au sugerat din nou desensibilizarea încrucișată (Fig. 3B, C). Figura 3D arată suprapunerea CPZ, CAP și aitc-receptivitate în neuronii WT DRG la concentrații date: 14% din neuronii DRG au răspuns la AITC, dar nu la CAP (125/906), 16% au răspuns la CAP, dar nu la AITC, în timp ce CPZ a indus tranzitorii de calciu în 78% din neuronii care au răspuns atât la AITC, cât și la CAP (137 din 176). Pentru a demonstra specificitatea efectelor observate, neuronii TRPV1−/− și TRPA1−/− DRG au fost expuși Protocolului de mai sus. Aproximativ 90% din neuronii DRG cu deficit de TRPV1 care au fost sensibili la AITC au răspuns, de asemenea, la CPZ (509/572 celule), în timp ce niciunul dintre cei 448 de neuroni DRG cu deficit de TRPA1 testați nu a prezentat un aflux de calciu ca răspuns la CPZ (100 unktm), așa cum este ilustrat prin exemple reprezentative din Fig. 3E, F.

desensibilizarea sistemică prin TRPA1 atenuează durerea

după ce am descoperit că CPZ este un agonist puternic TRPA1, am înțeles de ce primele clisme CPZ (de două ori pe zi) au fost evident dureroase la șoarecii WT. S-a cuantificat apoi comportamentul nocifensiv indus de clisme CPZ (531 de Centimetre) la animalele sănătoase (fiecare n = 6) prin numărarea reacțiilor de zvâcnire și înregistrarea răspunsurilor visceromotorii reflexe (VMRs) prin electromiografia integrată (EMG) a peretelui muscular abdominal (Fig. 4A, B). În timpul repetării tratamentelor CPZ de două ori pe zi, am observat că knockout-urile TRPA1 nu au prezentat în niciun moment un comportament legat de durere. În plus, șoarecii WT au prezentat o scădere progresivă a răspunsurilor inițial puternice la durere, cu un declin abrupt în jurul Zilei 3, ceea ce a dus la o desensibilizare completă în ambii parametri nocifensivi. Această pierdere a percepției durerii colonului la șoarecii altfel normali a ridicat speranța că clismele ar fi putut furniza CPZ o cantitate farmacodinamică suficientă pentru a induce hipoalgezie sistemică. Pentru a testa această ipoteză, am folosit testul de ștergere a ochilor folosind AITC (100 mm) și capac (1 mM) (Fig. 4C, D) (n = 6). Ambele teste au arătat o atenuare distinctă a numărului de ștergere a ochilor la șoarecii WT care au fost tratați cu clisme CPZ (până la 12-16 ore înainte de test). Aceste efecte au fost cel mai probabil mediate de desensibilizarea TRPA1, mai degrabă decât de blocul TRPV1, deoarece șoarecii cu deficit de TRPV1 au fost insensibili la instilarea uleiului de muștar (AITC, 100 mmc) în ochi în același grad ca șoarecii WT (Fig. 4C). Invers, clismele CPZ au fost ineficiente la șoarecii TRPA1−/−, când acești șoareci au fost provocați prin instilații de capac în ochi (Fig. 4D).

deoarece clismele repetate sunt o cale neplăcută de administrare, am testat pentru un posibil efect anti-nociceptiv al CPZ peroral (531 unktim) în apa de băut. Regimul de băut timp de 10 zile a fost bine tolerat, fără a apărea efecte adverse evidente. Pe parcursul administrării orale continue a CPZ, latența de retragere a labei la stimularea căldurii radiante (metoda Hargreaves) a crescut progresiv la ambele picioare posterioare (Fig. 4E). Timpul de toleranță a fost aproximativ dublat în ziua 7 și a rămas semnificativ crescut de la Ziua 2 la 10. După 2 săptămâni de recuperare cu apă potabilă pură, latențele de retragere au revenit la nivelul inițial. Reacția mecanică la stimulare cu forța de creștere liniară a unui filament electrodinamic von Frey nu a fost afectată semnificativ în timpul celor zece zile de băut CPZ (Fig. 4F). S-a pus întrebarea dacă hipoalgezia termică și chimică a reprezentat un efect de clasă al desensibilizării agoniștilor TRPA1 sau dacă a fost specific pentru CPZ. Astfel s-a administrat AITC într-o concentrație similară și bine tolerată (500 inqqm) prin apa de băut. Același regim de dozare pentru AITC descris pentru CPZ a dus la o creștere progresivă a latenței de retragere a labei la stimularea căldurii radiante, care a fost semnificativ mai mică decât cea indusă de CPZ (Fig. 4E). Reacția mecanică nu a fost modificată în cadrul regimului de băut AITC (Fig. 4F).

CPZ provoacă desensibilizarea susținută a neuronilor senzoriali peptidergici TRPA1/TRPV1 care exprimă

am pus apoi întrebarea dacă desensibilizarea animalelor întregi de către CPZ ar putea fi reprodusă la nivel celular. În acest scop, am efectuat experimente de imagistică a calciului cu neuroni DRG izolați care au fost obținuți de la șoareci de control și de la animale tratate timp de 7 zile de două ori pe zi cu clisme CPZ. Acești neuroni au fost păstrați în mod necesar în cultură timp de 16 până la 24 de ore, în prezența NGF. Un total de 399 de neuroni de la șoareci de control și 584 de neuroni de la șoareci tratați cu clisme au fost încărcați cu Fura-2 și tranzitorii de calciu evocați de AITC, carvacrol, CAP și o soluție bogată în KCl au fost înregistrate. Răspunsurile la acești agoniști TRPA1 (AITC și carvacrol) și TRPV1 (CAP) nu au fost semnificativ diferite în neuronii DRG de la animalele de control și animalele tratate cu clisme (Fig. S1). Cu toate acestea, expresia ARNm TRPA1 (qPCR) a fost de aproximativ două ori reglată în sus în DRG lombosacral preparat imediat după clisma CPZ finală (Fig. S2) întrucât nu a fost detectată nicio modificare a expresiei TRPA1 când au trecut 24 de ore in vivo după clisma finală. ARNm TRPV1 nu s-a schimbat în ambele circumstanțe. Astfel, reglarea transcripțională a expresiei genei TRPA1 a avut loc, datorită multiplelor clisme CPZ, dar a fost inversată rapid atunci când furnizarea CPZ a fost întreruptă. În condiții de cultură DRG, aceeași inversare epigenetică a avut loc probabil și tot CPZ rezidual a fost probabil spălat, astfel încât să nu se poată aștepta de fapt o desensibilizare reziduală. Deoarece modelele celulare nu au reflectat desensibilizarea indusă de CPZ a animalelor întregi in vivo, am căutat un alt indicator puternic al efectului sistemic surprinzător. Majoritatea neuronilor nociceptivi sunt peptidergici, exprimând predominant peptida legată de gena calcitoninei (CGRP) și substanța P (SP)15,17. La depolarizare, ca prin KCL și influxul de calciu, datorită activării canalelor de calciu cu tensiune, aceste neuropeptide sunt eliberate din fibrele nervoase într-o funcție cvasi-eferentă (inflamație neurogenă). Pe de altă parte, canalele TRP activate sunt conductori de calciu foarte buni de la sine și nu necesită suport prin canale de sodiu sau calciu cu tensiune pentru a evoca exocitoza veziculară a CGRP18. Astfel, eliberarea stimulată a CGRP poate servi ca un indice de activare a nociceptorului (peptidergic). În același mod, neuropeptidele vasoactive au diferite efecte asupra procesului de inflamație în sine și s-a demonstrat că epuizarea sau desensibilizarea populației de neuroni senzoriali peptidergici atenuează colita19,20,21. Pentru a determina dacă clismele CPZ (531 centimm) se desensibilizează prin TRPA1, local și sistemic, am folosit preparate izolate pentru colon și piele de șoarece. Colonele șoarecilor sănătoși c57bl / 6 (n = 8) au fost expuși la CPZ (100 MMC) care au indus eliberarea masivă de CGRP (Fig. 5); aplicările ulterioare ale AITC (100 MMC) 5 min sau 15 min după CPZ (Fig. 5A, B) nu a mai putut induce eliberarea CGRP, sugerând o profundă desensibilizare funcțională încrucișată acută la agonistul TRPA1. Acest efect nu se poate datora epuizării, deoarece răspunsul KCL (60 mM) care a urmat a fost normal. Colonurile de la șoareci care au fost tratați în mod repetat cu clisme CPZ (531 inqqm) in vivo, de două ori pe zi timp de 7 d au fost izolate și testate la 12-16 ore după ultima clismă. Nici CPZ (100 MMC), nici AITC (100 MMC) nu au indus vreo eliberare de CGRP în această stare (Fig. 5C, D); în special, eliberarea CGRP indusă de capac (30 nM) a fost puternic redusă, dar nu abolită (Fig. 5E). În schimb, eliberarea CGRP indusă de KCl (60 mM) prin depolarizare nespecifică nu a fost doar neredusă, ci chiar îmbunătățită după clismele CPZ. Acest lucru a indicat faptul că fibrele nervoase colonice nu au fost epuizate de CGRP, ci mai degrabă supraîncărcate, dar în esență desensibilizate într-o manieră susținută la activarea chimică prin TRPA1 precum și TRPV1 (n = 6). În cele din urmă, de asemenea, preparatul cutanat, izolat la 12-16 ore după ultima clismă CPZ, a arătat că eliberarea CGRP indusă de AITC (100 MMCT) și CAP (1 MMCT) a fost puternic redusă în conformitate cu desensibilizarea la nivelul întregului corp observată în testele comportamentale (Fig. 5F, G, vezi Fig. 4A-F) (n = 6).