rezultate și discuții

în sistemele de mamifere, activitatea Cdc42 s-a dovedit a fi importantă în reglarea diferențierii celulelor stem/progenitoare ale pielii în celulele foliculului pilos, controlul polarității stem / progenitoare neuroepiteliale și bifurcația emisferică a creierului și reglarea numărului și creșterii celulelor în perioada de dezvoltare perinatală (6-9). Interesant este că o examinare a activității Cdc42 la șoarecii adulți WT de diferite vârste relevă faptul că nivelul relativ Cdc42-GTP al animalelor mai în vârstă este semnificativ mai mare decât cel al celor mai tineri din diverse țesuturi, inclusiv inima, creierul, plămânul, ficatul, măduva osoasă, splina și rinichii (Fig. 1 A și datele nu sunt afișate), crescând posibilitatea ca activitatea crescută a Cdc42 să fie implicată în procesul normal de îmbătrânire.

pentru a determina dacă activitatea crescută a Cdc42 asociată cu îmbătrânirea naturală poate avea relevanță fiziologică, am examinat regulatorul negativ Cdc42, Cdc42GAP, la șoarecii vizați de gene după ce au ajuns la vârsta adultă. Studiile anterioare ale șoarecilor homozigoți cdc42gap knockout în perioada perinatală au indicat faptul că diferite țesuturi/celule conțineau Cdc42-GTP crescut, iar embrionii/puii nou − născuți ai genotipului Cdc42GAP − / – au prezentat dimensiuni reduse ale organelor/organismelor care sunt legate de creșterea apoptozei spontane în diferite tipuri de celule (6). La șoarecii adulți Cdc42GAP−/−, activitatea Cdc42 a fost constitutiv mai mare la mai multe tipuri de țesuturi/celule decât la șoarecii WT potriviți, în timp ce nivelul RhoA-GTP sau Rac1-GTP a rămas similar cu cel al WT (Fig. 1b; datele nu sunt prezentate), sugerând o activitate specifică de creștere a Cdc42 la animalele adulte similară cu cea din perioada perinatală. Majoritatea șoarecilor Cdc42GAP – / – au murit în perioada neonatală din cauza dimensiunii lor mai mici și a fizicului slab (6). Cu toate acestea, o parte dintre aceștia (7% din numărul total de persoane) ar putea supraviețui perioadei neonatale în cadrul asistenței maternale prin femele care nu au legătură cu îngrijirea. În ciuda aportului regulat de lapte și a concentrațiilor serice normale de glucoză și insulină găsite la șoarecii homozigoți în perioada postnatală , creșterea în greutate a șoarecilor Cdc42GAP−/− a început să încetinească la vârsta de 3 luni, comparativ cu vârsta de 5 luni la șoarecii WT sau heterozigoți, iar homozigoții maturi au scăzut cu 30% în greutate corporală datorită scăderii celularității globale (Fig. 1 C și datele nu sunt afișate). Durata medie de viață a șoarecilor Cdc42GAP −/− a fost de 12 luni, în timp ce șoarecii martor (WT sau heterozigoți) au rămas Vitali până la o vârstă medie de 27 de luni (fig. 1 D). Curba de supraviețuire a șoarecilor homozigoți este oarecum diferită de curba tipică Gompertz, dar este similară cu cele raportate pentru BubR1 (un regulator de control mitotic) knockout (10) sau p44 (o izoformă scurtă a supresorului tumoral p53) transgenice (11) animale. Cifoza și lipsa de vigoare la șoarecii Cdc42GAP – / -au devenit evidente la vârsta de 12 luni (Fig. 1 E). Șoarecii Cdc42GAP−/− jupuiți la vârsta de 15 luni au prezentat o reducere clară a masei corporale, o pierdere substanțială a țesutului adipos subdermic, lordokifoză severă și atrofie musculară (datele nu sunt prezentate). O scanare cu raze X a arătat un fenotip semnificativ de cifoză și o densitate minerală osoasă redusă (BMD) la șoarecii Cdc42GAP−/− la vârsta de 15 luni (Fig. 1 F). Cuantificarea ulterioară a oaselor disecate ale șoarecilor Cdc42GAP−/− a evidențiat reduceri de 3 și 2,6 ori ale DMO în tibie și, respectiv, femur (si Fig. 7). În plus, atât șoarecii Cdc42GAP−/− masculi, cât și femele au pierdut fertilitatea la o vârstă mai fragedă comparativ cu cea a WT. La împerecherea dintre femelele Cdc42GAP− / – și masculii WT, homozigoții au devenit infertili la vârsta de 26 de săptămâni, comparativ cu 48 de săptămâni pentru WT (Fig. 1 G). Aceste observații indică faptul că deficitul de Cdc42GAP are ca rezultat creșterea constitutivă a nivelului Cdc42-GTP, dimensiunea corporală redusă, cifoza timpurie, DMO redusă, perioada de fertilitate redusă și durata de viață redusă la șoarecii adulți.

H&e secțiunile colorate prin corpul vertebral al șoarecelui feminin de 8 luni au arătat că șoarecii Cdc42GAP- / -aveau un cortex mai subțire, înclinat și trabecule mai subțiri comparativ cu șoarecii WT (Fig. 2 A). În mod similar, secțiunile de longitudine ale femurului șoarecilor homozigoți au arătat o reducere a grosimii osului cortical comparativ cu cea a șoarecilor WT (datele nu sunt prezentate). Aceste observații sunt în concordanță cu aspectul brut și caracteristicile clinice ale osteoporozei. Splina, ficatul și rinichii șoarecilor adulți Cdc42GAP−/− au fost reduse în masă datorită unei scăderi a celularității globale, care a fost evidentă în secțiunile h&e-colorate ale splinei, iar regiunile pulpei albe care conțin celule T și B ale splinei Cdc42GAP-/-vechi de 12 luni au fost semnificativ reduse în comparație cu cele ale șoarecilor WT potriviți vârstei (Fig. 2 B și datele nu sunt prezentate), sugerând atrofie limfoidă pronunțată la homozigoți. În concordanță cu reducerea aparentă a țesutului adipos subdermic, analiza histologică a secțiunilor transversale ale pielii dorsale a evidențiat o absență aproape completă a celulelor adipoase s.c. la șoarecii Cdc42GAP- / -vechi de 9 luni (Fig. 2 C). O pierdere a masei musculare și a atrofiei musculare au fost, de asemenea, confirmate prin examinarea h&secțiuni musculare scheletice colorate E de la șoareci Cdc42GAP-/-în vârstă de 12 luni și șoareci WT potriviți cu vârsta (Fig. 2 C). Șoarecii Cdc42GAP−/− au prezentat, de asemenea, o reducere marcată a regenerării părului după îndepărtarea părului dorsal prin bărbierit, în timp ce WT – ul potrivit vârstei și sexului a afișat o regenerare robustă a părului (si Fig. 8). Capacitatea de a tolera stresul, cum ar fi vindecarea rănilor, o activitate asociată îmbătrânirii (12) a șoarecilor Cdc42GAP -/−, a fost semnificativ redusă în comparație cu cea a WT (Fig. 2 D). Analiza histopatologică a secțiunilor plăgii a arătat o reepitelializare redusă în marginea plăgii șoarecilor Cdc42GAP−/−, în timp ce reepitelializarea completă a șoarecilor WT a fost evidentă la 4 zile după introducerea plăgii (Fig. 2 E). În plus față de aceste observații, un număr de fenotipuri hematopoietice ale șoarecilor homozigoți, inclusiv anemie, celularități reduse ale splinei și măduvei osoase, defecte ale grefării celulelor stem hematopoietice în măduva osoasă și sensibilitate crescută a celulelor stem hematopoietice la mobilizarea indusă (13, 14) au fost în concordanță cu îmbătrânirea timpurie în sistemul hematopoietic. Important, o examinare a șoarecilor homozigoți tineri (<4 luni) înainte de manifestarea fenotipurilor evidente nu a evidențiat anomalii majore la nivelul osului, pielii și splinei (si Fig. 9 A și B și datele nu sunt prezentate), sugerând că fenotipurile asemănătoare îmbătrânirii șoarecilor Cdc42GAP-/− nu se datorează unei tulburări de dezvoltare timpurie. Mai mult, un număr de fenotipuri ale șoarecilor homozigoți, inclusiv grosimea osoasă corticală redusă, cifoza și pierderea masei musculare și a țesuturilor epidermice, ar putea fi găsite la șoarecii WT vechi (>2,5 ani) (si Fig. 9 C și D și datele nu sunt prezentate). Așa cum sunt rezumate în tabelul SI 1, în mod colectiv, aceste rezultate oferă dovezi puternice că deficiența Cdc42GAP provoacă fenotipuri asemănătoare îmbătrânirii premature la animale.

colorarea țesuturilor adulților în vârstă de 9 luni, inclusiv ficat, rinichi și splină, pentru a identifica o activitate puternică a acestui marker de senescență la șoarecii homozigoți, care nu a fost detectabilă în țesuturile șoarecilor WT de vârstă și sex (Fig. 3 A și si Fig. 10), indicând faptul că Cdc42GAP−/− țesuturile adulte pot suferi senescență prematură. Interesant este că apoptoza crescută a țesuturilor homozigote observată în perioada perinatală a fost absentă la homozigoții adulți atunci când activitatea crescută a sa-XV-gal a fost evidentă (ref. 6 și datele nu sunt afișate). Celulele fibroblaste embrionare (MEF) Cdc42GAP−/− șoarece, care conțin de 3 ori mai mult cdc42-GTP, dar conținuturi normale de Rac1-GTP sau RhoA-GTP în comparație cu celulele MEF WT (6), au prezentat o activitate semnificativ crescută sa-XV-gal și au acumulat o morfologie senescentă aplatizată și mărită începând de la pasajul 6, Când celulele MEF WT au fost negative pentru activitatea SA-XV-gal și au fost contractuale în morfologie (Fig. 3 B și si Fig. 11). Celulele Cdc42GAP – / – MEF au început să încetinească în creștere la pasajele 5-7 când celulele MEF WT potrivite au crescut exponențial (Fig. 3 C) (6), și au suferit o senescență replicativă masivă după trecerea 7, în timp ce majoritatea celulelor MEF WT nu au ajuns la senescență până la trecerea 13 (si Fig. 11 și datele nu sunt afișate). În plus, un procent semnificativ mai mare de celule Cdc42GAP−/− MEF la pasajul 7 au format focare mai mari în nucleu decât celulele WT (si Fig. 12). Aceste rezultate indică faptul că deficitul de Cdc42GAP induce senescența precoce a țesuturilor/celulelor.

un factor bine recunoscut care contribuie la îmbătrânirea prematură a mamiferelor și la senescența celulară este instabilitatea genomică crescută (15). Analiza de răspândire a metafazei a arătat că>30% splenocite primare de la șoareci homozigoți în vârstă de 8 luni au fost aneuploizi, în timp ce splenocitele WT potrivite vârstei și sexului nu au avut aneuploidie detectabilă (Fig. 3 D), indicând faptul că țesutul Cdc42GAP−/− a suferit instabilitate genomică. În sprijinul acestei constatări, celulele Cdc42GAP – / – MEF au arătat o creștere semnificativă a celulelor cu nuclee duble sub colorarea DAPI comparativ cu celulele WT la pasajul 7 (si Fig. 12). Analiza cariotipului pasajelor ulterioare ale celulelor MEF (pasajul 6-7) a relevat în continuare că, deși majoritatea cromozomilor din celulele WT (80%) au rămas intacte, 42% din celulele Cdc42GAP−/− conțineau cel puțin o aberație cromozomială, 20% conțineau două sau mai multe aberații, iar 14% conțineau trei sau mai multe aberații (Fig. 3 E). Procentul și gradul de aneuploidie au crescut, de asemenea, semnificativ în celulele Cdc42GAP−/− MEF, cu >32% din celulele care prezintă numere anormale de cromozomi cuprinse între 72 și 102, în timp ce majoritatea celulelor WT au fost diploide (Fig. 3 E și si Fig. 13). Analiza cariotipului daunelor cromozomiale indică faptul că aberațiile celulelor MEF homozigote au fost diverse, inclusiv ruperea cromatidelor, separarea prematură a cromatidelor surori (un semn distinctiv al unui punct de control defect al ansamblului fusului), translocarea, rupturile cromozomiale, cromozomul dicentric și fragmentarea cromozomilor (Fig. 3 F și SI tabelul 2), sugerând că mecanismul de reparare a daunelor ADN este compromis în celulele Cdc42GAP−/−. Colorarea prin imunofluorescență a fosfo-H2 AX în nucleul celular, un marker de răspuns la deteriorarea ADN− ului (16), arată că, deși 10% din celulele passage 7 Cdc42GAP−/ – MEF au fost pozitive pentru markerul de deteriorare a ADN-ului, <1% din celulele WT au fost pozitive (Fig. 3 G). Corelația dintre debutul și progresia fenotipurilor de îmbătrânire ale șoarecilor Cdc42GAP−/ − și gradul și severitatea aberațiilor genomice observate în celulele Cdc42GAP − / – susține un rol al Cdc42 în dezvoltarea caracteristicilor progeroide.

pentru a determina mecanismul posibil al daunelor ADN acumulate în celulele Cdc42GAP−/−, am comparat nivelul speciilor de oxigen reactiv endogen (ROS) al celulelor homozigote cu cel al celulelor WT, deoarece Rac1 și Rac2, două Gtpaze Rho strâns legate, sunt regulatori cunoscuți ai ros celular (17). SI Fig. 14 arată că celulele Cdc42GAP−/− au prezentat o activitate ROS similară cu cea a celulelor WT, indicând faptul că Cdc42GAP reglează stabilitatea genomică printr-un mecanism endogen independent de ROS. Datorită asemănărilor dintre mai multe fenotipuri Cdc42GAP−/− șoarece cu cele ale unui număr de modele de șoarece orientate genetic ale moleculelor de reparare a daunelor ADN, inclusiv modelele de șoarece Brca1−/−p53+/−, Ku80−/− și MTR−/−Wrn (12, 18, 19), am cercetat în continuare capacitatea de reacție a celulelor Cdc42GAP−/− trecute la diferiți agenți de deteriorare a ADN-ului. În testul de creștere a răspunsului la deteriorarea ADN-ului, celulele cu deficit de Cdc42GAP au arătat un defect larg al activității de reparare a daunelor ADN (Fig. 4), care s-a manifestat ca procente semnificativ mai mari de moarte celulară în rândul celulelor homozigote comparativ cu celulele WT după tratament prin creșterea dozelor de H 2O2, iradiere ionizantă, camptotecină, sulfonat de metil− metan sau mitomicină C. Astfel, anomaliile genomice diverse acumulate găsite în pasajele ulterioare ale celulelor Cdc42GAP−/ – pot fi atribuite, cel puțin parțial, activităților de reparare a daunelor ADN afectate.

o consecință a deteriorării genomice susținute în celule este inducerea mai multor gene ADN-daune-răspuns și / sau senescență (20, 21). Expresiile p53, p21Cip1, p16Ink4a și phospho-p53 (Ser-15) în celulele Cdc42GAP−/− MEF au fost semnificativ mai mari decât cele ale celulelor WT MEF după pasaje similare, în timp ce p19ARF în celulele homozigote a arătat o tendință similară de creștere cu pasaje, cum ar fi celulele WT (Fig. 5 A). Nivelurile de proteine ale p53, p21Cip1, p16Ink4a, phospho-p53 (Ser-15) și markerul de deteriorare a ADN-ului phospho− H2 AX în țesuturile Cdc42GAP−/-de la șoareci în vârstă de 8 luni au fost, de asemenea, semnificativ mai mari decât cele din țesuturile corespunzătoare ale șoarecilor WT potriviți (Fig. 5 B). Aceste rezultate oferă dovezi că activarea căii reglementate de p53, p21Cip1 și p16ink4a în special, este asociată cu senescența timpurie indusă de deficit de Cdc42GAP. Pentru a examina întrebarea dacă activitatea crescută a Cdc42 în celulele cu deficit de Cdc42GAP este suficientă pentru a explica fenotipul de senescență timpurie, am exprimat un mutant activator al Cdc42, Cdc42F28L, în celulele MEF WT primare și am testat activitatea sa-XV-gal a celulelor în comparație cu cea a potrivirii celulelor care exprimă EGFP la diferite pasaje. Expresia Cdc42F28L a determinat o creștere semnificativă a populației de celule sa-XV-gal-pozitive (35% în celulele Cdc42F28L comparativ cu 7% în celulele care exprimă EGFP) în celulele MEF pasate timpuriu (Fig. 5 C), indicând faptul că activarea Cdc42 este suficientă pentru inducerea senescenței celulare timpurii.

pentru a explora în continuare posibilitatea ca fenotipul senescenței celulelor Cdc42GAP−/− să poată fi salvat de un defect p53, am generat șoareci Cdc42GAP+/−p53+ / − și am încercat să pregătim celule MEF din rasa încrucișată. Din 44 de embrioni, s−au obținut șase cu genotipul Cdc42GAP−/− p53+/−și niciunul cu genotipul Cdc42GAP−/− p53−/ -. Celulele Cdc42GAP−/− p53+/− MEF au crescut cu o rată între cea a celulelor p53+/− și WT și au prezentat o populație senescentă bazală comparabilă cu cea a celulelor p53+/− sau WT la pasajul 7, în timp ce celulele p53−/− și Cdc42GAP- / -MEF au proliferat cu o curbă liniară și o curbă de dublare a populației de îndoire și au fost rezistente la senescență și, respectiv, predispuse la senescență la pasaje similare (Fig. 5 D și E). Aceste rezultate indică faptul că senescența prematură indusă de activarea Cdc42 depinde de p53.

durata de viață limitată a celulelor și animalelor poate rezulta din senescența replicativă ca răspuns la diferite solicitări, inclusiv deteriorarea ADN-ului (22), eroziunea telomerilor (23), ROS (24) și/sau oncogene activate necorespunzător (25). Șoarecii Cdc42GAP−/− prezintă un model animal gain-of-Cdc42-activation care imită activarea Cdc42 indusă de semnalul mitogen (6) și permite o evaluare a efectelor posibile ale activării Cdc42 asupra fiziologiei animale și celulare. Demonstrăm că deficiența Cdc42GAP determină debutul precoce al senescenței în celule și fenotipurile de îmbătrânire prematură la animal. În special, direcționarea genelor Cdc42GAP induce o creștere globală a activității Cdc42 și promovează instabilitatea genomică celulară cu capacitate redusă de reparare a daunelor ADN, care la rândul său poate activa p53 și P16 Ink4a, ducând la senescență timpurie (Fig. 5 F). Anterior, Cdc42 sa dovedit a fi activat în celulele senescente pentru a modula ajustarea morfologică (26). De asemenea, s-a propus implicarea în modificarea morfologică celulară reglementată de p53, apoptoză și proliferare (27-29) și în apoptoza controlată de kinază c-Jun n-terminal (30, 31), evenimente care au fost asociate cu senescența celulară și îmbătrânirea animalelor (32, 33). Constatările noastre că activarea Cdc42 este asociată cu îmbătrânirea naturală și că deficiența Cdc42GAP provoacă un defect de reparare a daunelor ADN pentru a permite celulelor să acumuleze anomalii genomice care duc la senescență timpurie sugerează în continuare o legătură funcțională între activitatea Cdc42 și îmbătrânirea mamiferelor.

activarea căii p53 sau perturbarea genelor implicate în repararea daunelor ADN sau reglarea stabilității genomice s-a dovedit a induce îmbătrânirea timpurie la șoareci (11, 12, 33, 34). În concordanță cu observațiile anterioare conform cărora Cdc42 nu poate fi implicat în reglarea activităților de superoxid celular (17), am constatat că deteriorarea ADN acumulată în celulele Cdc42GAP−/− nu este asociată cu activitatea ROS, deoarece celulele homozigote nu prezintă o activitate crescută a ROS. Ștergerea Cdc42GAP determină o reducere semnificativă a capacității de reparare a daunelor ADN într-un spectru larg, inclusiv răspunsurile la agentul de reticulare a ADN-ului și la inductorul de rupere cu două catene sau cu o singură catenă, sugerând că activarea prelungită a Cdc42 poate diminua capacitatea de reparare a daunelor ADN. Diversitatea daunelor genomice găsite în celulele Cdc42GAP−/− este, de asemenea, în concordanță cu impactul unui defect global de reparare a daunelor ADN. Întrebările importante rămase de abordat includ CE determinanți moleculari specifici sunt implicați în repararea daunelor ADN reglementate de Cdc42GAP și ce semnal(e) din amonte determină creșterea Cdc42-GTP în timpul procesului normal de îmbătrânire.