Introducere

secvențele genomului complet ale diferitelor organisme, inclusiv mamifere, au devenit recent disponibile ca o consecință a progreselor rapide în tehnologia de secvențiere a ADN-ului. Cu toate acestea, în special la mamifere, analiza transcrierilor joacă încă un rol cheie în reducerea decalajului dintre genom și proteom. Acest lucru se datorează în principal faptului că, în prezent, nu putem prezice cu exactitate structurile transcrierilor derivate dintr-o anumită genă numai din informațiile genomice. Astfel, ca metodă de analiză a transcrierilor, construcția bibliotecii ADNc este crucială, chiar și în epoca de secvențiere post-genom. Deși clonarea ADNc a genelor de interes prin PCR a oferit o cale alternativă simplificată pentru a analiza structurile de transcriere fără construcția bibliotecii ADNc, construcția unei biblioteci ADNc este abordarea la alegere atunci când trebuie analizat un număr mare de ADNc dintr-o singură sursă de ARNm. Până în prezent, s-a depus mult efort în dezvoltarea unei metode de pregătire a bibliotecilor ADNc de înaltă calitate (1-4). În schimb, problema pregătirii unei biblioteci ADNc de înaltă calitate dintr-un mic bazin de ARN-uri nu a fost abordată atât de activ. Cu toate acestea, acest lucru a devenit un obiectiv prioritar, deoarece cercetătorii sunt adesea interesați de gene ipotetice care se preconizează că vor fi exprimate numai în anumite tipuri de celule sau țesuturi în condiții particulare, cum ar fi cele observate în probele patologice.

au existat o serie de rapoarte care descriu utilizarea unor cantități mici de ARN sursă pentru generarea ADNc amplificată sau cRNA, din care pot fi pregătite ținte pentru analiza microarray (5-15). Scopul lor final este de a obține ARN de lungime întreagă, care nu este părtinitor populației, care este foarte reprezentativ pentru ARNm original. Pentru a efectua acest lucru, aceste metode adoptă de obicei PCR sau transcriere in vitro prin polimeraza ARN T7 pentru a amplifica ARNm original sub formă de ADNc sau, respectiv, cRNA. Deși compararea profilurilor de Expresie este una dintre cele mai eficiente abordări pentru a investiga diferențele în stările fiziologice ale celulelor sau țesuturilor, caracterizarea structurală a transcrierilor (de exemplu, identificarea modelelor alternative de îmbinare, a locului de pornire a transcrierii și a locului de terminare a transcrierii) nu se poate face printr-o astfel de analiză microarray. Analiza secvențială a fiecărei transcrieri este inevitabilă în aceste cazuri.

am dezvoltat o metodă care permite o cantitate mică de ARN de pornire pentru a fi utilizată pentru a construi o bibliotecă ADNc potrivită pentru clonarea genelor și analiza secvențială cuprinzătoare. Metoda etichetează capetele 3′ și 5 ‘ ale CDN-urilor din prima rundă cu secvențe promotor de fag T7 și SP6, respectiv, pentru a minimiza efectele de părtinire a mărimii în timpul amplificării. După amplificarea cRNA în două runde, am transformat arnc amplificate în ADNc, am clonat aceste produse într-o plasmidă și apoi am evaluat biblioteca ADNc rezultată în comparație cu cea construită printr-o metodă convențională (4,16,17).

materiale și metode

amplificarea cRNA

secvențele de oligonucleotide utilizate în acest studiu sunt prezentate în tabelul 1. Pentru a stabili protocolul, am folosit ca șablon 1 ARN total de 0g preparat din creierul șoarecelui ICR (șoareci masculi în vârstă de 8 săptămâni). Un amestec (10 xqtl) de 1 xqtg ARN total și 100 pmol T7-Not-(dT)18 primer a fost incubat la 70 XTC C timp de 10 min și apoi răcit cu gheață. Sinteza ADNc dublu catenar și ligarea adaptorului au fost efectuate în urma protocoalelor sistemului plasmidic superscript (Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA) (4,16,17), cu modificări minore. Pe scurt, pentru prima strand sinteza adnc, 4 µL 5× first-strand tampon (Invitrogen), 1 µL 0,1 M dithiothreitol (DTT), 1 µL 10 mM dNTPs, 1 µL (40 U) RNaseOUT™ (Invitrogen), și 1 µL de apă s-au adăugat denaturat ARN/T7-Nu-(dT)18 grund mixure și incubate la 37°C timp de 3 min pentru a tempera primeri. Apoi, la amestecul de reacție s-au adăugat 2 xqql (400 U) SUPERSCRIPT III Rnază h-revers transcriptază (Invitrogen), iar temperatura a fost ajustată la 50 XQC pentru a începe sinteza ADNc din prima catenă. După 1 h, cel de-al doilea strand sinteza adnc a fost efectuată așa cum este descris anterior prin Gubler și Hoffman (18); la primul strand adnc amestec, 91 µL apă, 30 µL 5× doilea strand tampon (Invitrogen), 3 µL 10 mM dNTPs, 1 µL (10 U) Escherichia coli ADN-ul ligase, 4 µL (40 U) E. coli ADN polimeraza, și 1 µL (2 U) E. coli Rnază H s-au adăugat, și amestecul a fost incubat la 16°C timp de 2 h. petuniei termini au fost apoi end-lustruit cu 10 U T4 ADN-polimerazei (Invitrogen) la 16°C timp de 5 min, iar reacția a fost oprită prin adăugare de 10 µL 0,5 M etilendiamină tetraacetic acid (EDTA). ADNc-urile rezultate au fost purificate prin extracție cu alcool fenol/cloroform/izoamilic (25:24:1), urmate de precipitarea etanolului, așa cum s-a descris anterior (17), cu excepția utilizării ca purtător a Arnt de drojdie de 1 hectar în loc de acid poliadenilic. ADNc precipitat a fost dizolvat în soluție de NaCl de 50 ilql (10 mM Tris-HCl, pH 8,0 și 1 mm EDTA), amestecat cu 30 ilql dintr-o soluție de polietilenglicol (PEG) de 20% (g/v) 6000/2, 5 m și apoi incubat pe gheață timp de 1 h (17). După incubare, amestecul de ADNc a fost centrifugat la 18.000 de centi g la 4 centi C timp de 15 min. Peleta ADNc rezultată a fost clătită de două ori cu etanol 70%, uscată și apoi omogenizată în apă de 30 uqql. ADNc-urile purificate au fost ligate cu adaptor 500 pmol SP6 (Tabelul 1) Folosind 5 u T4 ADN ligază (Invitrogen) într-un volum de reacție de 50-ilqq la 16 ilqqc peste noapte. Amestecul ligat-adaptor a fost diluat de două ori cu apă, iar apoi CDN-urile au fost purificate folosind o coloană dnaclear XV (Ambion, Austin, TX, SUA). Eluatul (în apă de 16 unqql) a fost utilizat ca șablon pentru sinteza cRNA. Cu ajutorul kitului Megirsk T7 (Ambion), arnc-urile au fost sintetizate la 37 de centi C peste noapte într-un volum de reacție de 40 de centi. După ce ADNc-urile șablon au fost degradate cu 4 U DNase I, arnc-urile sintetizate au fost purificate cu ajutorul unui Mini Kit Rneasy inkt (QIAGEN, Valencia, CA, SUA) și eluate cu 100 inktl apă. Concentrația cRNA a fost determinată prin absorbția ultravioletului (UV). Pentru amplificarea cRNA de runda a doua, au fost utilizate ca șablon și, respectiv, primer de 100 pmol de cRNA sintetizat și 100 pmol SP6 UP (egal cu oligonucleotida catenei superioare a adaptorului SP6 prezentat în tabelul 1). Sinteza ADNc din runda a doua s-a realizat ca în transcrierea inversă inițială din ARN-ul sursă, cu excepția faptului că recoacerea primerului SP6 UP a fost efectuată la 50 CTC timp de 3 min. După purificarea ADNc-ului dublu catenar obținut printr-o coloană DNAclear, 0,5% din ADNc a fost utilizat ca șablon pentru următoarea amplificare cRNA asistată de ARN-polimerază SP6. Folosind kitul MEGAscript SP6 (Ambion), sinteza cRNA s-a realizat la 37 C pentru 6 h. după degradarea ADNc-ului șablon folosind Dnaza I, arnc-urile sintetizate au fost purificate conform descrierii de mai sus.

construcția Bibliotecii ADNc

două micrograme din arnc rezultate au fost supuse sintezei ADNc dublu catenare utilizând 100 pmol attB2-Not-(dT)18 primer (Tabelul 1). Etapele de sinteză a ADNc, tocirea finală, purificarea și ligarea adaptorului au fost efectuate ca în sintezele ADNc anterioare, cu excepția faptului că adaptorul attB1 (tabelul 1.500 pmol) a fost ligat la ADNc dublu catenar. După ce ADNc-urile ligate cu adaptor attB1 au fost purificate prin tratamente succesive de extracție a fenolului/cloroformului/alcoolului izoamilic, precipitarea etanolului și precipitarea PEG/NaCl în această ordine, acestea au fost dizolvate în 50 ILT/te și tratate cu Rnaza a (la o concentrație finală de 10 ILT / mL; Invitrogen) pentru a degrada ARN-ul contaminat la 37 ILT / C timp de 30 min. Amestecul de reacție a fost din nou purificat prin extracție cu alcool fenol/cloroform/izoamilic, urmat de precipitarea etanolului și precipitarea PEG/NaCl. ADNc-urile rezultate au fost dizolvate în 15 unqql TE, iar cantitatea lor a fost estimată din intensitatea colorației fluorescente după electroforeza pe gel de agaroză (4). ADNc-urile ligate attB1 (36 ng) au fost supuse unei reacții de recombinare in vitro (sistemul gateway-ul de la Ingq; Invitrogen) cu vectorul donator attP-pSP73 de 250 ng, așa cum s-a descris anterior (4,16,17). Pe scurt, attB1-ligat adnc și attP-pSP73 donator vector s-au amestecat și incubate în 10 µL de reacție volumul conține 2 µL 5× BP Clonase™ reacție tampon și 2 µL BP Clonase (atât din Invitrogen) la 25°C peste noapte. Amestecul de ADNc s-a tratat cu 2% proteinază k (Invitrogen) la 37% C timp de 10 minute pentru stingerea reacției și s-a extras cu fenol/cloroform/alcool izoamilic, urmat de precipitarea etanolului cu 2% Arnt drojdie ca purtător. ADNc precipitat s-a dizolvat în 10 Ilfov apă, iar 1 Ilfov amestec s-a utilizat pentru transformarea celulelor E. coli (Invitrogen) ElectroMAX Ilfov Dh10b Ilfov. După titrarea bibliotecii ADNc rezultate, plasmidele ADNc au fost recuperate din aproximativ 1.000.000 de colonii printr-o metodă alcalină de dodecil sulfat de sodiu (SDS), așa cum s-a descris anterior (4,19). Clonele ADNc rezultate au fost într-o formă de plasmidă care transportă site-uri attL. Deoarece plasmidele care transportă site-uri attB sunt necesare în unele aplicații, aceste plasmide au fost transformate în cele care transportă site-uri attB așa cum s-a descris anterior (16). Această bibliotecă ADNc a fost, prin urmare, desemnată ca MB-AL (biblioteca derivată Crna amplificată de creier de șoarece).

în același mod descris pentru MB-AL, am construit o bibliotecă ADNc din ARN neamplificat (100% ARN total al creierului șoarecelui) și l-am desemnat ca MB-CL (biblioteca construită convențional a creierului șoarecelui).

examinarea efectului de polarizare a mărimii asupra arnc amplificate

pentru a examina efectul de polarizare a mărimii asupra arnc, arnc-urile din prima rundă transcrise de ARN polimeraza T7 și arnc-urile din a doua rundă transcrise de ARN polimeraza SP6 au fost rulate pe 1,0% gel de agaroză (1 hectarg fiecare) și apoi șterse pe membrana de nailon (membrana de nailon Biodyne B B; PALL, East Hills, NY, SUA). Au fost hibridizați cu grund SP6 up marcat cu 32P(Tabelul 1) și, respectiv, cu oligonucleotidă Not-(dT)18 (5′-GCGGCCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′). Zece picomoli din fiecare sondă au fost marcați cu ATP (aproximativ 3000 Ci / mmol; Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, SUA) prin utilizarea polinucleotid kinazei T4 (Takara, Kyoto Japonia). După hibridizarea peste noapte în tamponul GMC (20) la 45 centi c, aceste membrane au fost spălate extensiv în soluție salină standard citrat (SSC) 1 centi/soluție SDS 1% de trei ori la temperatura camerei. Analiza semnalelor hibridizate a fost efectuată pe un analizor de imagine BAS 2000 (Fuji Photo Film, Tokyo, Japonia)

evaluarea bibliotecilor ADNc

electroforeză în Gel. Distribuția mărimilor inserțiilor ADNc a fost examinată prin electroforeza arnc sintetizată de polimeraza ARN T7 utilizând ca șabloane ARNC Plasmidice Mb-AL și MB-CL digerate NotI. După purificare folosind un Mini Kit RNeasy, Crna-urile au fost electroforizate pe un gel de agaroză care conține formaldehidă cu markeri ARN Perfect (EMD Biosciences, Madison, WI, SUA). În urma colorării gelului cu SYBR VIII Green II (Invitrogen), intensitatea colorației fluorescente a fost analizată cu ajutorul software-ului ImageQuant XV (versiunea 5.0) pe un FluorImager 595 (Amersham Biosciences).

Random analiza secvențiere cu o singură trecere. Secvențele 3 ‘ – End ale clonelor ADNc au fost examinate prin secvențierea ADN-ului. ADN-ul plasmidic din 768 de clone culese aleatoriu a fost purificat cu ajutorul unui MFX-9600 Magnia (Toyobo, Osaka, Japonia) și analizat de un Secvențiator RISA 384-capilar (Shimadzu, Kyoto, Japonia) (16). După decuparea secvenței vectoriale folosind Sequencher versiunea 4.1 (Hitachi Software, Tokyo, Japonia), secvențele de ADNc obținute care au fost mai lungi de 200 de reziduuri de nucleotide au fost grupate cu intrări ADNc în baza de date GenBank XV și Baza noastră de date internă a mouse-ului. Examinarea integrității capetelor 3 ‘ale clonelor ADNc a fost efectuată printr-o analiză a faptului dacă un hexamer de semnal canonic de poliadenilare (5′-AATAAA-3’) sau variantele sale cu o singură bază (11 hexameri de semnal) au fost găsite sau nu în cele 50 de reziduuri de nucleotide din amonte de coada Poli(a) a ADNc (21).

microarray ADNc. Analizele Microarray au fost efectuate pentru a compara populațiile de ADNc din bibliotecile MB-AL și MB-CL. Au fost pregătite microarrays de nylon ADNc de casă cu 3534 sonde și s-a efectuat detectarea radioizotopică (22). Pe scurt, plasmidele ADNc, care au fost izolate în institutul nostru și pentru care secvențele complete sau secvențele finale erau deja cunoscute, au fost reperate folosind GeneTAC implant RA1 (Genomic Solutions, Ann Arbor, MI, SUA) pe membrana de nailon Biodyne B și apoi fixate urmând instrucțiunile producătorului. Lista ADNc-urilor imobilizate pe acest microarray este disponibilă la cererea autorilor. ADNc-urile țintă MB-AL și MB-CL au fost preparate utilizând transcrierea inversă din fiecare dintre cele 1 probe de Crna de la un nivel de 1 hectolitru utilizat pentru analiza mărimii inserției, așa cum este descris mai sus. Aceste obiective au fost sintetizate și etichetate în amestecul de reacție conține 1 µg de fiecare cRNA, 100 ng aleatoare hexamer, 1× first-strand buffer, 10 mM DTT, fiecare 800 µM dATP, dTTP, și dGTP, 800 nM dCTP, 5 µL dCTP (>2500 Ci/mmol; Amersham Biosciences), și 100 U Exponent II Rnază H – revers transcriptazei la temperatura camerei timp de 10 min și apoi la 42°C timp de 1 h. După lizei alcaline și neutralizare, etichetate cDNAs au fost purificat cu QIAquick® PCR purification kit (QIAGEN) și numărate. Țintă adnc a fost supus la hibridare cu adnc nailon microarray în prezența de 1 µg polyadenylic acid și 2,5 µg Mouse-Pat-1 ADN® (Invitrogen) în 250 µL PerfectHyb™ tampon (Toyobo) la 68°C peste noapte. După spălarea stringentă la 68 XTX C cu 2 XTX SSC/1% SDS (două spălări de câte 15 min fiecare) și apoi cu 0,1 XTX SSC/1% SDS (două spălări de câte 30 min fiecare), semnalele de hibridizare au fost detectate și analizate pe un FLA-8000 (Fuji Photo Film). Spoturile ADNc care prezintă semnale mai puternice decât cele ale controlului de fond au fost selectate și supuse unei analize suplimentare. După efectuarea normalizării globale, s-au obținut parcele de împrăștiere a intensităților semnalului spoturilor ADNc provenite de la țintele MB-AL și MB-CL.

ARN blot hibridizare. Hibridizarea ARN blot a fost efectuată pentru a examina efectele de părtinire a mărimii. Crna-urile MB-AL și MB-CL (fiecare 1,5 hectog, sintetizate așa cum este descris mai sus) au fost electroforezate pe gel de agaroză conținând formaldehidă și transferate în membrana de nailon Biodyne B. CDN-urile sondei au fost preparate folosind amplificarea PCR. Primerii au fost proiectați pe baza secvențelor înregistrate în baza de date GenBank sau în Baza noastră de date internă; șabloanele erau plasmidele ADNc pe care le izolasem. Sonda proteinei ribozomale S6 a fost de 724 bp în lungime, amplificată cu primeri 5′-CGCTCGGCTGTGTCAAGATG-3′ și 5′-GAGGACAGCCTACGTCTCTTGG-3′, iar sonda proteinei de șoc termic (hsp) 70, 940 BP în lungime, a fost amplificată cu 5′-GATGGACAGGCGCAGATCC-3′ și 5′-grunduri ctcgatggtgggtcctgagc-3′. Aceste sonde au fost etichetate cu dCTP (aproximativ 3000 Ci/mmol; Amersham Biosciences) folosind sistemul de etichetare a ADN-ului RadPrime (Invitrogen). După hibridizarea peste noapte în tamponul PerfectHyb la 65% C, membranele au fost spălate succesiv cu 0,1% SSC/1% SDS la temperatura camerei timp de 5 min și timp de 15 min, apoi la 65% C timp de 30 min. Semnalele de hibridizare au fost detectate pe un analizor de imagine BAS 2000.

rezultate și discuții

metoda de construcție a Bibliotecii ADNc pe care am dezvoltat-o în acest studiu este prezentată în Figura 1 (pașii nou introduși sunt evidențiați cu o stea). Această metodă constă din două runde de etapă de amplificare a cRNA, conversia Crna-urilor în CDN-uri și clonarea recombinațională într-o plasmidă. Pasul cheie în această metodă este ligarea adaptorului pentru a eticheta ADNc se termină cu secvența promotorului SP6. Odată ce putem sintetiza cu succes CDN – uri în acest format, devine posibil să inversăm în mod specific transcrierea CRN-urilor din prima rundă care conțin secvența promotorului SP6 la capătul lor de 3′. Arnc-urile din runda a doua sunt sintetizate cu polimeraza ARN SP6 folosind CDN-urile dublu catenare rezultate ca șabloane. După cele două runde de amplificare asistată de ARN polimerază, arnc-urile rezultate sunt apoi convertite în Arnd-uri dublu catenare prin transcriere inversă folosind grundul attB2-Not – (dT)18. Utilizarea grundului attB2-Not-(dT)18 în transcrierea inversă ne permite să convertim numai Crna-urile care poartă secvența 5′ – (a)18GCGGCCGC-3′ la capetele lor 3′. Deoarece aceste modificări ar trebui să permită doar amplificarea și clonarea CDN-urilor care au capete etichetate corect, ne așteptăm ca această metodă să reducă la minimum părtinirea dimensiunii în timpul amplificării asistate de ARN polimerază.

pentru a testa eficacitatea metodei, am construit biblioteci de ADNc printr-o metodă convențională (16) folosind ARN total neamplificat din creierul șoarecelui (100%) și prin metoda descrisă mai sus folosind 1% din ARN total din creierul șoarecelui. Tabelul 2 rezumă cantitățile de ADNc și cRNA obținute în fiecare etapă, calculate ca o medie de trei rulări experimentale independente de construcție MB-AL. Am obținut o medie de 6.4 107 clone cDNA independente ca rezultat final. Deoarece acest număr de clone ADNc derivă dintr-un total de 36 ng ADNc generate folosind protocolul de amplificare, calculăm că această metodă produce aproximativ 1,2 clone ADNc 1011 din ARN-ul total de 1 hectar.

pentru a examina efectul de polarizare a mărimii în timpul etapelor de amplificare experimental, am comparat apoi distribuțiile de mărime ale cRNA din prima rundă și a doua rundă prin analiza hibridizării ARN blot. În aceste experimente, arnc-urile din prima rundă și cea de-a doua rundă au fost hibridizate cu grund SP6 UP și respectiv cu oligonucleotidă Not-(dT)18, deoarece aceste sonde oligonucleotidice detectează numai arnc transcrise corect până la sfârșit. După cum se arată în Figura 2, Dimensiunea ARN la vârful semnalului de hibridizare în cRNA din runda a doua s-a dovedit a fi aproape aceeași cu cea din cRNA din prima rundă, dar cu o ușoară trecere la dimensiuni mai mici. Bănuim că trunchierea arnc a avut loc probabil în timpul sintezei ADNc din runda a doua cu grundul SP6 UP.

pentru a evalua în continuare calitatea bibliotecii ADNc amplificate rezultate, am comparat, de asemenea, diferite caracteristici ale bibliotecilor ADNc generate cu și fără amplificare (MB-al și MB-CL, respectiv). Am examinat mai întâi distribuția mărimii inserțiilor ADNc, așa cum se arată în figura 3A. Rezultatele semnalelor de intensitate a fluorescenței obținute din imaginea de colorare a gelului au indicat că dimensiunile inserțiilor ADNc ale MB-AL și MB-CL au fost similare, dar punctul de vârf a fost puțin mai mic în MB-AL (0,65 kb) comparativ cu cel din MB-CL (0,8 kb). Apoi, am analizat secvențele 3 ‘ – end ale clonelor ADNc eșantionate aleatoriu din fiecare bibliotecă. Rezultatele clusterizării pentru aceste etichete de secvență exprimate (Est) sunt prezentate în figura 3b și sugerează că complexitatea MB-AL a fost la fel de mare ca cea a MB-CL. Cu toate acestea, este demn de remarcat faptul că clonele cDNA extrem de redundante au dispărut în MB-AL. Printr-o analiză statistică (test Chi), s-a demonstrat că diferența de redundanțe între MB-AL și MB-CL a fost semnificativă (probabilitatea ca redundanțele în MB-AL și MB-CL să fie similare este <0,001). În plus, am examinat integritatea capetelor 3’ ale ADNc analizând dacă fiecare EST conține sau nu un hexamer de semnal de poliadenilare. Rezultatele au indicat că 80,1% și 87,3% din clonele ADNc din MB-al și, respectiv, MB-CL conțineau secvențe plauzibile de semnal de poliadenilare (21). Scăderea ratei de apariție a hexamerilor semnalului de poliadenilare în MB-AL a indicat probabil o creștere a numărului de clone ADNc în care sinteza ADNc a fost amorsată intern datorită a două runde de amorsare dT.

prin hibridizarea microarray, am examinat populația ADNc a MB-AL în comparație cu cea a MB-CL. Figura 3c prezintă un grafic de împrăștiere a semnalelor de hibridizare a țintelor MB-AL și MB-CL. Rezultatele au indicat o corelație considerabil ridicată a semnalelor de hibridizare între țintele MB-AL și MB-CL, sugerând că nu a existat un efect dăunător al amplificării în populația ADNc.

în cele din urmă, am efectuat analiza hibridizării ARN blot pentru a examina efectele de părtinire a mărimii cu atenție la genele de menaj (figura 3D). Pentru proteina S6 ribozomală și hsp 70, dimensiunile cRNA atât în MB-al, cât și în MB-CL au fost similare și comparabile cu cele așteptate din secvențele lor nucleotidice raportate. Cu toate acestea, modelul de hibridizare al arnc HSP 70 în MB-AL a fost ușor diferit de cel din MB-CL, indicând faptul că efectul de părtinire a mărimii nu a fost complet eliminat.

metoda de construcție a Bibliotecii ADNc descrisă în acest raport a fost concepută pentru a minimiza prejudecățile de dimensiune în timpul etapelor de amplificare asistate de ARN polimerază. O astfel de metodă de construcție a Bibliotecii asistată de ARN polimerază dintr-un mic bazin de ARN pentru o analiză cuprinzătoare de secvențiere nu a fost bine studiată, în timp ce metodele de construcție a Bibliotecii ADNc/cRNA pentru hibridizarea microarray au fost urmărite în mod activ. Deși Lukyanov și colab. (23) și Piao și colab. (24) metode raportate care utilizează amplificarea PCR pentru a construi o bibliotecă ADNc dintr-o cantitate submicrogramă de ARN total, amplificarea PCR prezintă intrinsec dezavantaje, cum ar fi dimensiunea severă și părtinirea populației și fidelitatea scăzută a amplificării ADNc. Acesta a fost motivul pentru care am încercat să dezvoltăm o metodă de construcție a Bibliotecii ADNc bazată pe amplificarea asistată de ARN polimerază în acest studiu.

în acest scop, am conceput o nouă strategie de amplificare asistată de ARN polimerază, așa cum se arată în Figura 1, deoarece metodele lui Eberwine și colab. (5), Huang și colab. (10), și Lin și colab. (11) prezintă încă dezavantaje pentru prepararea unui ADNc conținut de plasmidă adecvat pentru analiza cuprinzătoare a structurii genelor. În prima, sinteza ADNc după amplificarea cRNA se face cu hexameri aleatori, ceea ce face ca ADNc amplificate să fie inevitabil mai scurte decât cele originale (5,7). În acesta din urmă, introducerea unei cozi homopolimerice la capătul ADNc din prima catenă prin deoxinucleotidil transferază terminală (TdT) sau activitatea revers transcriptazei virusului leucemiei murine Moloney (MMLV) (10,11) are sens pentru a minimiza efectul de părtinire a mărimii în timpul amplificării asistate de ARN polimerază ca în metoda noastră. Cu toate acestea, se știe că metoda de decantare homopolimerică provoacă trunchierea ADNc datorită amorsării neașteptate a sintezei ADNc dintr-o întindere homopolimerică a secvențelor interne de ARN. Deoarece metoda de ligare a adaptorului descrisă în acest studiu ar putea oferi o secvență specifică pentru amorsarea ADNc, ne-am putea aștepta să reducem amploarea trunchierii ADNc folosind metoda noastră.

în principiu, metoda noastră ar trebui să amplifice doar ADNc flancate de o coadă intrinsecă Poli(a) și secvența adaptorului SP6, care au fost generate în sinteza ADNc din prima rundă. Rezultatele prezentate în Figura 2 și figura 3a au fost în esență în concordanță cu aceasta, deși populația ADNc în intervalul de dimensiuni mai mici a fost puțin crescută. Rezultatele analizei ARN blot (figura 3D) au arătat, de asemenea, că efectul de părtinire a mărimii ar putea fi redus, dar nu complet eliminat chiar și în metoda noastră. Acest lucru s-a datorat probabil faptului că CDN-urile trunchiate atașate de o coadă Poli(A) și secvența promotorului SP6 au fost generate în timpul conversiei cRNA în ADNc. Acest punct de vedere a fost susținut de faptul că rata de apariție a secvențelor de semnal de poliadenilare în MB-AL a fost semnificativ mai mică decât cea observată în biblioteca convențională ADNc (21). Trunchierea ADNc ar putea apărea în timpul sintezei ADNc datorită amorsării interne a ARN cu grundul cu coadă dT și grundul SP6. Deoarece întinderile homopolimerice apar frecvent în ARNm eucariote, metoda de decantare homopolimerică ar putea impune o tendință de dimensiune mai severă asupra amplificării cRNA cu mai multe runde decât metoda noastră de ligare a adaptorului. Deși creșterea temperaturii de reacție în timpul transcrierii inverse și scăderea concentrației de grund ar putea suprima amorsarea internă aberantă în sinteza ADNc într-o oarecare măsură, se știe că este dificil să se elimine complet acest lucru în prezent. Astfel, deși am efectuat amplificarea cRNA în două runde pentru demonstrarea protocolului general, în practică, vă recomandăm să săriți amplificarea cRNA din runda a doua atunci când se poate obține suficient cRNA în reacția din prima rundă.având în vedere aceste rezultate, concluzionăm că noua noastră metodă este utilă pentru construirea bibliotecii ADNc dintr-o cantitate mică de ARN de pornire. De fapt, am folosit cu succes și în mod obișnuit această metodă pentru construirea bibliotecilor ADNc atunci când cantitatea de ARN total este mai mică de 1 hectg (datele nu sunt afișate). Deoarece ARN-ul total de 1 hectolitru ar putea fi recuperat din 105-106 celule de mamifere sau 1 mg de țesuturi de mamifere, bibliotecile ADNc pot fi construite cu ușurință din celule fracționate prin sortare celulară sau microdisecție prin metoda noastră. Mai mult, deoarece calculăm că această metodă ne permite să obținem mai mult de 105 clone ADNc din 1 pg ARN total, care este aproape de cantitatea de ARN total dintr-o singură celulă, o singură bibliotecă ADNc derivată din celulă ar putea fi construită pe baza acestei amplificări Crna asistată de adaptor-ligare.