rezultate

caracterizarea celulelor dendritice Plasmacitoide ale intestinului subțire.

am aplicat proceduri standard pentru a izola celulele imune situate în epiteliu (intraepitelial, IE) și LP din intestin. În ambele preparate celulare am găsit o populație distinctă de celule CD11c + B220 + Ly6C + care au reprezentat până la 1% din toate celulele. Spre deosebire de PDC, mieloidul (m)DC (CD11c+MHCII+CD3−B220−Ly6C−) au fost prezenți doar la un număr foarte mic în preparatul IE (Fig. 1 A). Atât PDC al preparatului LP, cât și IE au prezentat niveluri scăzute de Expresie MHC clasa II de suprafață (Fig. 1 A). Analiza ulterioară a arătat că celulele CD11c + B220 + Ly6C+ ale ambelor preparate exprimă uniform markerii pDC PDCA1 precum și 120G8 (Fig. 1 B). Citospinele din PDC sortate (CD11c + B220 + Ly6C+) și DC mieloid (MDC) ale preparatului IE au evidențiat o morfologie rotundă și netedă, asemănătoare celulelor plasmatice ale pDC, în timp ce mDC a prezentat dendritele caracteristice (Fig. 1 C). Pentru a caracteriza în continuare localizarea pDC în intestin am aplicat anti-B220, anti-120g8 și anti-CD3 mAb în imunohistologie. Micrografele au fost luate aleatoriu din secțiuni și, așa cum este descris în Fig. 1 D, poziționarea celulelor 120G8+B220 + CD3 a fost determinată în raport cu celulele epiteliale prin utilizarea analizei imaginii (analiză; Olympus, Hamburg, Germania). Evaluând poziționarea a 150 pDC, s-a observat că 4,9% din aceste celule au fost clar localizate în stratul celular epitelial, în timp ce alte 6,7% s-au situat la o distanță de 5-10 mm de vârful apical al celulelor epiteliale (Fig. 1 D). Aceste date demonstrează că o anumită cantitate de pDC se localizează în interiorul sau în apropierea epiteliului intestinal, în timp ce >80% din celulele analizate au fost poziționate la distanțe >15, ceea ce le face ca celule LP (Fig. 1 D). Deoarece un număr similar de pDC a fost prezent în prepararea IE și LP în urma procedurilor standard de izolare, în prezent nu este clar dacă pDC din LP contaminează preparatul IE sau dacă localizarea pDC la epiteliu este izolată mai eficient. Pentru că cu greu găsim mDC în pregătirea IE, favorizăm această din urmă posibilitate. Cu toate acestea, rămâne de stabilit dacă ambele populații îndeplinesc funcții diferite sau aparțin unei populații celulare comune. Deoarece PDC al preparatului IE, spre deosebire de PDC al preparatului LP, poate fi izolat prin proceduri destul de blânde, exclusiv pDC al preparatului IE au fost utilizate pentru teste funcționale în acest studiu.

expresia Ccr9 pe PDC Intestinal.

pentru a identifica mecanismele moleculare care permit migrarea pDC în intestin, am analizat expresia moleculelor homing. Deși este bine stabilit că integrina ae (CD103) mediază adeziunea limfocitelor la celulele epiteliale din intestin, nu am reușit să identificăm expresia acestei integrine pe PDC intestinal. În mod similar, CCR7 (Fig. 1 E), implicat în mod esențial în homing de limfocite în organele limfoide periferice nu este exprimată prin PDC a intestinului. În schimb, s-au observat niveluri ridicate de CD18 (integrină-XT2) și niveluri intermediare de XT4 XT7, în timp ce 50% din PDC exprimă liganzi P-selectină (Fig. 1 E). De interes, marea majoritate a PDC intestinal a exprimat cantități mari de receptor de chemokină CCR9 (Fig. 1 E), în timp ce mDC din LP a exprimat no sau niveluri scăzute ale CCR9 .

expresia ccr9 a pDC izolată din diferite organe limfoide.

având în vedere expresia uniformă a CCR9 pe PDC intestinal, am analizat expresia ccr9 pe PDC izolată din organele limfoide secundare, inclusiv splina, Ln care drenează pielea, Ln mezenterică și plasturii lui Peyer (PP; Fig. 2 A) și timocitele CD4+CD8+ utilizate, cunoscute ca exprimând niveluri ridicate de CCR9, ca martor pozitiv (11); Fig. 2 B). Interesant este că doar o fracțiune din pDC prezentă în oricare dintre aceste organe a exprimat CCR9 (Fig. 2 A), în timp ce 95% din pdc izolat de BM transporta acest receptor (Fig. 2 C). Majoritatea BM PDC exprimă, de asemenea, CCR5 și CXCR3, în timp ce CCR2 este prezent doar pe aproximativ 25% din celule. CXCR4, cunoscut pentru a reține celulele la BM, este doar foarte slab exprimat (Fig. 2 C). Împreună, aceste date demonstrează că pDC sunt echipate cu diferiți receptori de chemokină înainte de a fi eliberați din BM. Această caracteristică permite, probabil, homing nu numai la locurile de inflamație, ci și la intestinul neinflamat.

analiza chemotaxiei Flt3L-PDC extins.

pe baza expresiei puternice a CCR9 pe BM și PDC intestinal, am comparat capacitatea de migrare a pDC și mDC față de chemokina CCL25 / TECK, care este singurul ligand cunoscut pentru acest receptor (12). Frecvența pDC variază între diferite tulpini de șoarece și este bine cunoscut faptul că, de exemplu, șoarecii c57bl/6 (B6) au mult mai puțin pDC decât șoarecii 129sv (13). Cu toate acestea, indiferent de fondul genetic, numărul de pDC care poate fi izolat din țesuturile de șoarece este insuficient pentru a efectua teste standard de chemotaxie in vitro. Pentru a depăși această limitare, am extins populația DC in vivo prin implantarea unei linii celulare tumorale secretoare Flt3-L (B16-FL) la șoareci B6 timp de 14 zile (14).

în această perioadă de timp, procentul de celule CD11c+ prezente în splină a crescut de la 3% la 30-35% (datele nu sunt prezentate). Optzeci la sută din pDC extins in vivo a exprimat CCR9, cu niveluri foarte similare cu cele prezente pe BM pDC (Fig. 2 C și Fig. 4 C) în timp ce MDC extins in vivo a exprimat doar cantități mici din acest receptor (si Fig. 6B). Splină pDC au fost îmbogățite cu cd11c + MACS-sortare, rezultând în puritate de 95% Pentru CD11c + celule care conțineau 15% li6c+B220 + pdc. Testele de migrare transwell in vitro au evidențiat un răspuns chemotactic puternic al pDC la CCL25, precum și la CXCL9, un ligand pentru CXCR3 și la CXCL12, care este un ligand pentru CXCR4. Doar un răspuns slab a fost observat față de CCL19, care servește ca ligand pentru CCR7. mDC a prezentat un răspuns chimiotactic redus față de CCL25 și CXCL9 și un răspuns moderat față de CXCL12 și CCL19 (Fig. 3 A).

număr redus de pDC în intestinul subțire al șoarecilor cu deficit de CCR9.

pe baza acestor observații, am caracterizat distribuția pDC la șoarecii cu deficit de CCR9. Am găsit procente similare de pDC în plămâni și ficat (si Fig. 7) precum și în ganglionii limfatici inghinali și mezenterici, în timp ce numărul de PDC splenic a fost ușor crescut la șoarecii CCR9−/−. În contrast, am observat o >scădere de 90% a intestinului și o reducere de 50% A PP pDC (Fig. 3 B).

PDC migrează preferențial la intestinul subțire.

pe baza constatărilor descrise până în prezent, părea probabil ca pDC să necesite CCR9 pentru a ajunge la intestinul subțire. Pentru a demonstra această ipoteză, am transferat adoptiv celule de la donatorii B6 și ccr9−/-care au purtat o tumoare secretoare Flt3-L timp de 14 zile. Sub influența Flt3L pDC extins într− o măsură similară în B6 și ccr9−/ – șoareci (Fig. 4 A și si Fig. 8) și au fost indistinguizabile în ceea ce privește expresia CCR2, CCR5 și CXCR3, în timp ce CCR9 a fost detectat doar pe pDC derivat din B6, dar nu pe donatorii cu deficit de CCR9 (Fig. 4 C). Fără purificare suplimentară, splenocitele acestor donatori au fost etichetate cu 5 (6)-carboxifluoresceină diacetat n-succinimidil ester(CFSE) și respectiv 5 (6)-carboxitetrametilrodamină n-succinimidil ester (TAMRA). Un amestec de celule cu deficit de WT și ccr9, ajustat pentru a conține un număr egal de pDC, a fost transferat i.v. la destinatarii B6. După 18 ore de transfer, am analizat mai întâi compoziția celulelor WT transferate adoptiv prezente în preparatul IE precum și LP și am observat că 54% și 25% din toate celulele recuperate din fracția IE și respectiv LP au fost pDC (Fig. 4 B). Aceste descoperiri demonstrează că printre diferitele populații de celule transferate pDC acasă cel mai eficient în intestin. Aceste transferuri competitive au arătat, de asemenea, că PDC cu deficit de CCR9 este în mare măsură afectată în capacitatea lor de a se adăposti în intestin, reflectată de raportul scăzut de migrare a PDC cu deficit de CCR9 vs.WT găsit în preparatul IE și LP (Fig. 4 D). În schimb, PDC cu deficit de CCR9 și B6 au migrat cu eficiență similară la ganglionii limfatici periferici și mezenterici (Fig. 4 D). Natura etichetării celulare nu a avut niciun impact asupra acestor experimente, deoarece schimbarea coloranților între celulele B6 și ccr9−/− a dat rezultate identice (datele nu sunt prezentate). Deși aceste date demonstrează clar că pDC necesită CCR9 pentru o localizare eficientă a intestinului, trebuie menționat că proprietățile de trafic ale pDC de la șoarecii tratați cu Flt3-ligand pot fi diferite de cele prezente în situații fiziologice.

pDC sunt recrutați în intestinul inflamat.

deoarece se știe că pDC joacă un rol important în imunitatea anti-virală (4, 10), am speculat că pDC ar putea fi recrutat în intestin în timpul proceselor inflamatorii pentru a consolida apărarea de primă linie. Toxina holerică (CT) este cunoscută pentru inducerea inflamației intestinale atunci când este administrată pe cale orală și s-a raportat că în decurs de 2 ore după administrarea orală numărul de mDC recrutat tranzitoriu în intestin crește de 4 ori (15). Am observat că, în plus față de MDC, numărul pDC a crescut de asemenea de 3 ori la hrănirea șoarecilor B6 cu 10 ectg de CT (Fig. 4 E). De interes, configurația experimentală identică nu a dus niciodată la o creștere a pDC nici în IE, nici în prepararea LP a șoarecilor cu deficit de CCR9 după 1, 2 sau 3 ore de tratament CT (Fig. 4 E și datele nu sunt afișate). Cerința specifică pentru CCR9 privind pDC pentru recrutarea lor în intestin în timpul proceselor inflamatorii a fost confirmată prin transferul adoptiv al PDC cu deficit de WT și ccr9 la destinatarii cu deficit de CCR9 urmată de aplicarea CT așa cum este descris mai sus. În timp ce PDC-ul WT transferat adoptiv a fost amplu prezent în preparatul IE și LP, PDC-ul cu deficit de CCR9 a fost aproape complet exclus din aceste compartimente (Fig. 4 F). Împreună, aceste rezultate arată că în timpul evenimentelor inflamatorii pDC poate fi recrutat la mucoasa intestinală și că acest mecanism se bazează într-o mare măsură pe CCR9.

un rol pentru PDC Intestinal pentru mobilizarea rapidă a LP mieloid DC.

s-a demonstrat recent că aplicarea orală a ligandului tlr7/8 resiquimod (R848) are ca rezultat mobilizarea rapidă a LP DC și că TNFa, posibil eliberat de pDC, este implicat în acest proces (16). Am speculat astfel că PDC intestinal ar putea fi sursa TNFa care ar putea declanșa mobilizarea MDC-ului vecin. Pentru a testa această ipoteză, am stimulat in vitro B6 pDC al preparatului IE și LP pentru 16 h cu R848. Într-adevăr, pDC a secretat cantități considerabile de TNFa, dar nu a reușit să producă cantități detectabile de IL-2, IL-4, IL-5 sau IFNy (Fig. 5 A). Apoi am analizat mobilizarea LP mDC in vivo după aplicarea orală a R848. În timp ce șoarecii B6 și ccr9−/− netratați nu au diferit în ceea ce privește prezența MDC intestinală (Fig. 5 B), în decurs de 2 ore r848 Oral a indus mobilizarea a 60% din MDC în greutate, dar numai 10,8% la șoarecii CCR9−/−. Important, odată ce șoarecii cu deficit de ccr9 i. v. au primit PDC splenic al donatorilor WT tratați cu Flt3L cu 16 ore înainte de aplicarea orală a R848, această deficiență în mobilizarea MDC intestinală ar putea fi complet salvată (Fig. 5 C). Aceste experimente arată că o homing dependentă de ccr9 a PDC în intestin este implicată în mobilizarea rapidă a MDC intestinal după aplicarea orală a unui ligand TLR7/8. Pentru că s-a demonstrat de către alții în modelul de șobolan că aplicarea LPS induce și mobilizarea LP mDC (17), am aplicat 50 de LPS i.p. la animalele cu deficit de WT și CCR9. De interes, în aceste condiții experimentale nu s-a observat nici o diferență între animalele cu deficit de WT și ccr9 în ceea ce privește mobilizarea LP mDC (si Fig. 9).