discuție

studiul de față a descoperit un rol pentru SR luminal proteina de legare a ca, CSQ2 în reglarea cuplării excitație-contracție și CICR în inimă. Mai exact, am arătat că supraexprimarea mediată de Ad a CSQ2 a crescut dramatic magnitudinea atât a tranzitorilor ca induși de ICa, cât și a scânteilor spontane de Ca în celulele inimii izolate. Analiza fazei de creștere și a ratei de schimbare a acestor semnale Ca au indicat că dimensiunea lor mărită s-a datorat încetinit încetarea fluxurilor de eliberare a ca subiacente din SR. în plus față de prelungirea eliberării active a ca, dinamica reîncărcării funcționale a depozitelor ca SR a fost, de asemenea, încetinită în celulele cu niveluri ridicate de proteine CSQ2, așa cum este indicat de timpul de recuperare încetinit pentru scânteile ca repetitive. Am obținut în esență rezultatele opuse în miocite, în care nivelurile CSQ2 au fost reduse prin transducția antisens mediată de Ad. Aceste miocite au prezentat o eliberare mai scurtă de Ca, dar restituirea accelerată a locurilor de eliberare a Ca. Mai mult, în miocitele stimulate periodic cu niveluri scăzute de CSQ2, aplicarea izoproterenolului a provocat oscilații aritmogene ale intracelulare . Aceste rezultate arată că CSQ2 este un determinant cheie al funcției de eliberare a ca SR care acționează guvernând durata eliberării ca și refractarea locului de eliberare. Având în vedere tulburările dependente de izoproterenol observate în ciclismul ritmic Ca în miocite subexprimând CSQ2, rezultatele noastre sunt relevante pentru înțelegerea mecanismelor celulare ale aritmiilor induse de catecolamină legate de mutațiile genei CSQ2.

mecanisme moleculare ale acțiunii CSQ2. Atribuim efectele observate ale CSQ2 asupra eliberării SR Ca capacității acestei proteine de a funcționa ca un tampon molecular care controlează liber în spațiul luminal SR (vezi schema propusă în Fig. 5). Din studiile cu două straturi lipidice se știe că legarea Ca de aspectul luminal al complexului RyR (adică senzorul luminal ca) crește activitatea canalului, în timp ce la luminalul redus, activitatea canalului este redusă (EC50 XCT 1 mM; ref. 26). Deoarece multe RyRs ar fi într-o stare activată la niveluri normale de ca luminal de repaus (1 mm), scăderea luminalului în timpul procesului de eliberare ar scădea, prin urmare, activitatea generală a canalului (un proces denumit dezactivare dependentă de ca luminal; ref. 3). Rezultatele noastre sugerează că prin stabilizarea luminalului liber local în vecinătatea RyRs în timpul procesului de eliberare, CSQ2 încetinește închiderea dependentă de ca luminal a canalului RyR, crescând astfel cantitatea de Ca eliberată din SR în citosol. CSQ2 controlează, de asemenea, dinamica de recuperare a intra-SR liber în timpul recaptării Ca, servind ca chiuvetă pentru Ca în lumenul SR. Astfel, CSQ2 nu numai că potențează efluxul ca SR, ci și stabilizează CICR prin modularea restituirii funcționale sau a pregătirii locurilor de eliberare a ca după fiecare eliberare. Recent, am invocat un mecanism similar pentru a explica efectele chelatorilor de CA cu afinitate scăzută (săruri organice) încărcate în SR asupra eliberării de Ca (3). Importanța constatărilor noastre actuale este că arată modul în care procesul de eliberare este controlat de o proteină endogenă, rezidentă în SR, csq2. Ele dezvăluie, de asemenea, consecințele patologice ale cantităților reduse de CSQ2 în SR a celulelor inimii.

s-a propus că CSQ2 ar putea afecta funcția canalului de eliberare a Ca prin interacțiuni directe cu proteinele care cuprind complexul canalului de eliberare a Ca (adică RyR, junctin și/sau triadină) (ref. 13; pentru revizuire, a se vedea ref. 9). Studiile noastre nu au evidențiat diferențe considerabile în parametrii eliberării SR Ca între celulele care conțin niveluri ridicate de aproximativ 3 ori de proteină CSQ2 și celulele în care tampoanele organice au fost încărcate în SR (3). Astfel, cea mai simplă explicație pentru constatările noastre este că efectele predominante ale CSQ2 asupra eliberării SR ca se datorează acțiunilor de tamponare ale acestei proteine în interiorul SR. elucidarea mecanismului detaliat prin care CSQ2 și proteinele asociate, cum ar fi junctina și triadina, reglează eliberarea Ca trebuie să aștepte studii care implică manipularea nivelurilor și exprimarea formelor mutante ale acestor proteine cu abilități modificate de a interacționa între ele și RyR.

rata maximă de eliberare a Ca din miocitele stimulate a fost similară indiferent de cantitățile de CSQ2 exprimate în SR (Fig. 2B și 3D). Aceste rezultate susțin ideea că CSQ2 controlează încetarea procesului de eliberare, dar aceste rezultate nu sunt ceea ce s-ar prezice în mod necesar pe baza efectelor de tamponare așteptate ale acestei proteine în SR. într-adevăr, rata maximă de eliberare ar fi de așteptat să fie mai mare în celulele cu concentrații crescute de tamponare luminală ca cauzate de declinul încetinit al intra-SR liber , deoarece, în aceste celule, scăderea întârziată a gradientului de Ca pe membrana SR ar fi de așteptat să producă intensități mai mari ale fluxului de Ca. Mai multe motive posibile explică de ce acest lucru nu a fost observat. O posibilitate este că intra-SR liber inițial poate fi mai mic în CSQ2-supraexprimare decât în CSQ2-subexprimare celule. Deși la starea de echilibru, liber într-un compartiment închis, cum ar fi SR, nu ar trebui să fie influențat de numărul de situsuri de legare a Ca (acest lucru ar trebui să influențeze doar cinetica la care se atinge intra-SR la starea de echilibru), este posibil ca o adevărată stare de echilibru să nu fi fost atinsă în experimentele noastre (adică miocitele supuse stimulării cu rată scăzută). O altă posibilitate este că prezența unor niveluri ridicate de proteină CSQ2 încetinește difuzia Ca în spațiul luminal, încetinind astfel exodul Ca prin canalele deschise. În mod clar, sunt necesare mai multe cercetări, atât experimentale, cât și teoretice, pentru a rezolva această problemă.

încetarea CICR. Modul în care CICR, un proces cu o înclinație inerentă spre auto-regenerare, este încheiat, a fost un subiect de cercetare intensă, mai întâi prin utilizarea măsurătorilor tranzitorilor Ca globali și, mai recent, prin examinarea scânteilor Ca (3, 27-30). O posibilitate care a fost luată în considerare este ca canalele RyR să fie supuse inactivării sau adaptării dependente de Ca ca urmare a creșterii pe partea citosolică a canalului (27-29). O altă posibilitate este că declinul intra-SR oferă un semnal activ pentru închiderea RyRs după ce se deschid (3, 30-32). Am găsit recent dovezi experimentale directe pentru rolul modificărilor induse de ca luminal în activitatea RIR (adică dezactivarea dependentă de ca luminal) în încetarea eliberării ca SR prin fixarea nivelurilor intra-SR cu tampoane Ca cu afinitate scăzută încărcate în cisternele SR (3). Folosind aceste tampoane, am prelungit dramatic durata eliberării active a Ca care stă la baza tranzitorilor Ca focali și globali din miocite. În concordanță cu aceste constatări, rezultatele noastre actuale arată că creșterea nivelurilor tamponului ca luminal SR de mare capacitate CSQ2 prelungește durata de eliberare a Ca, în timp ce reducerea cantităților acestui tampon endogen a scurtat durata de eliberare, aparent prin încetinirea sau accelerarea închiderii luminale dependente de ca a RyRs, respectiv. Împreună, aceste rezultate oferă dovezi convingătoare pentru rolul dezactivării luminale dependente de ca a RyRs în încetarea CICR. Deși demonstrează importanța modificărilor ca luminale în încetarea eliberării ca SR, rezultatele noastre nu exclud neapărat posibilitatea ca mecanisme suplimentare, cum ar fi inactivarea RyR sau adaptarea la situsurile de reglementare a Ca citosolice să influențeze, de asemenea, încetarea eliberării ca.

deși există dovezi clare pentru un rol pentru schimbări în luminal ca în încetarea scântei cardiace (ref. 3; studiul prezent), studiile anterioare au indicat faptul că scânteile Ca în mușchii scheletici nu pot fi însoțite de epuizarea substanțială a SR . Lacampagne și colab. (33) analiza cinetică utilizată a înregistrărilor de scânteie ca de înaltă rezoluție temporală pentru a sugera că fluxul de eliberare a Ca care stă la baza scânteii Ca este constant în fibrele musculare amfibiene. Deoarece fluxul ca SR trebuie să scadă ori de câte ori SR scade, acest rezultat ar putea însemna că nivelurile ca luminale rămân constante în timpul scânteilor Ca. Astfel, există posibilitatea ca mecanismele de bază responsabile de încetarea scânteii să fie diferite în mușchiul cardiac și scheletic. Efectuarea de studii complementare în aceste două tipuri de celule (de exemplu, modularea nivelurilor de proteine CSQ în fibrele musculare scheletice și măsurători rapide ale cineticii ca în miocitele cardiace) ar trebui să ajute la clarificarea acestei probleme.

relevanță pentru CPVT. Unul dintre cele mai importante aspecte ale rezultatelor noastre este că arată modul în care nivelurile reduse de CSQ2 pot provoca aritmii cardiace la nivel celular. CPVT este o boală aritmogenă caracterizată prin sincopă și moarte subită inductibilă prin exerciții fizice și perfuzie cu catecolamină (34). Până în prezent, patru mutații au fost legate de CPVT. Trei dintre aceste mutații par să ducă la reducerea expresiei CSQ2 (17) și s-a propus o mutație care să conducă la legarea întreruptă a Ca (16). Rezultatele noastre sugerează că cauza principală a CPVT ar putea fi legată de restituirea anormală a mecanismului de eliberare a Ca cauzată de nivelurile reduse de CSQ2 (Fig. 5). Datorită concentrației mai scăzute a situsurilor de legare a Ca în SR a celulelor subexprimând CSQ2, reumplerea depozitului De Ca de către pompa SERCA are loc mai repede decât în celulele normale. Reîncărcarea magazinului devine și mai rapidă atunci când activitatea SERCA este stimulată de protein kinaza A, reprezentând potențial dependența episoadelor clinice de CPVT de catecolamine. În miocitele cu niveluri scăzute de CSQ2, recuperarea prematură a canalelor de eliberare a Ca dintr-o stare refractară dependentă de ca luminal a dus la descărcări spontane, extrasistolice ale depozitelor de ca SR. Se știe că eliberarea spontană de Ca poate induce curenți și oscilații interioare în potențialul membranei, rezultând aritmie declanșată (4-7). Prin urmare, tulburările observate în manipularea Ca ar putea explica, cel puțin parțial, patogeneza CPVT asociată cu defecte genetice care duc fie la reducerea activității de legare a Ca (16), fie la niveluri reduse de expresie a CSQ2 (17).

comparație cu studiile anterioare la șoareci transgenici. Constatările noastre diferă de rezultatele anterioare obținute la șoarecii transgenici supraexprimând CSQ2 (14, 15). În aceste studii, o supraexpresie de 10 până la 20 de ori a CSQ2 a crescut capacitatea de stocare a ca SR a miocitelor cardiace izolate; cu toate acestea, ca luminal nu a fost disponibil pentru eliberare, ducând la semnale de eliberare globală și locală deprimată. Aceste modificări în manipularea Ca au fost însoțite de mai multe modificări structurale, funcționale și biochimice la nivel celular și subcelular și dezvoltarea hipertrofiei și insuficienței cardiace. Pe de altă parte, studiul de față menține nivelurile de proteine CSQ2 mai aproape de nivelurile fiziologice în condiții acute, mai degrabă decât cronice; astfel, este posibil ca aceste date să reflecte mai exact consecințele fiziologice directe ale modificărilor nivelurilor de proteine CSQ2 asupra manipulării intracelulare a Ca. Aceste rezultate evidențiază potențialele probleme în interpretarea efectelor expresiei constitutive la nivel înalt a proteinelor în modelele animale transgenice și valoarea studiilor complementare în medii mai acute.

concluzie. În concluzie, am constatat că CSQ2 este un determinant esențial al capacității SR de a stoca și elibera Ca în mușchiul cardiac. CSQ2 pare să servească drept rezervor pentru Ca care este ușor accesibil pentru CICR și, de asemenea, ca un tampon Ca activ care modulează închiderea locală dependentă de ca luminal a RyRs. În același timp, CSQ2 stabilizează mecanismul CICR prin încetinirea reîncărcării funcționale a magazinelor SR ca. Comportamentul anormal de reprimare al canalelor de eliberare a Ca ar putea reprezenta sau contribui la aritmii ventriculare asociate cu mutații ale genei CSQ2.