o compartimento mielóide do sistema imunitário inato consiste numa série de tipos de células cujas funções incluem a eliminação de células danificadas e apoptóticas, a apresentação do antigénio, a imunossupressão e a protecção do hospedeiro de microrganismos estranhos.os monócitos representam um subconjunto altamente plástico de células que compõem o sistema imunitário inato. Estas células são capazes de atravessar a vasculatura e, quando expostas a citoquinas específicas, sofrem diferenciação em diferentes tipos de células. Os monócitos em circulação são classificados como não-Clássicos ou clássicos e podem ser distinguidos pelo seu padrão de expressão do receptor da superfície celular. Os monócitos clássicos dentro da circulação exibem CD14+++Hi/CD16−/lo e estão presentes especialmente em locais de infecção ou doença (1,2).

monócitos Humanos não-clássicos no interior da circulação exibem a expressão de superfície CD16++++Hi/CD14 + / lo (1). Após a ativação, os monócitos sofrem várias alterações funcionais morfológicas e bioquímicas, resultando em diferenciação de monócitos em novos tipos de células, tais como macrófagos (3).num paradigma denominado activação clássica, os monócitos humanos apresentam plasticidade fenotípica que pode ser iniciada pela exposição ao interferão—γ da citocina promotora da resposta Th1 (IFN-γ) ou ao factor de necrose tumoral α (TNF-α), bem como ao lipopolissacárido da endotoxina (LPS) (4,5). Este mecanismo de activação clássica gera macrófagos M1, que funcionam para produzir mediadores pró-inflamatórios que proporcionam protecção ao hospedeiro contra bactérias e vírus (6). Os monócitos humanos também podem ser diferenciados para macrófagos M2 por exposição a citoquinas promotoras da resposta Th2, tais como interleucina—10 (IL-10) e fator de crescimento transformador-β (TGF-β) (4,7). Os macrófagos M2 expressam níveis elevados de CD206 (receptor da manose) e CD163, produzem níveis baixos de citoquinas pró-inflamatórias e promovem a cicatrização da ferida e a remodelação da matriz.

células dendríticas (DCs) são outro conjunto de células imunitárias derivadas de monócitos cuja função é apresentar antigénios às células T para iniciar uma resposta imunitária baseada em células T adaptativa. DCs podem ser categorizados em grande parte em três subgrupos: clássico (cDCs), plasmacitóide (pDCs), e Derivado de monócitos (moDCs). os CDC são tipicamente encontrados no tecido linfóide, baço, gânglios linfáticos e medula óssea. os pDCs assemelham-se às células do plasma e são tipicamente encontrados na circulação sanguínea (8). Os monócitos podem ser diferenciados em DCs, que são frequentemente denominados DCs derivados de monócitos (moDCs), após exposição ao fator de estimulação de colónias de macrófagos granulocitários (GM-CSF) e IL-4 (9,10). os moDCs expressam os marcadores de superfície celular CD80, CD83, CD86 e CD1a in vitro (11-13). Embora os moDCs diferem dos macrófagos em forma e função celular, eles compartilham expressão de vários antigénios de superfície celular, incluindo CD11c, CD206, e CD1a (14).vários grupos notificaram uma diferenciação bem sucedida dos monócitos CD14+ humanos em macrófagos; no entanto, muitos destes protocolos publicados são diferentes. Uma variação comum entre estes métodos é a inclusão (15) ou omissão (16) da IL-6. Outra diferença entre protocolos é o tempo de tratamento. Esta falta de consistência entre protocolos é problemática.para abordar estas questões, examinámos e comparámos a inclusão e omissão da IL-6 no tratamento da citocina utilizado em metodologias comuns de diferenciação monocitária humana. Descobrimos que na ausência do IL-6, estas estratégias produzem células com um baixo grau de homogeneidade, o que pode produzir resultados experimentais ambíguos. Em segundo lugar, para abordar este problema, desenvolvemos uma nova estratégia in vitro faseada com a inclusão da IL-6. Descobrimos que esta estratégia melhorou muito a homogeneidade celular dos macrófagos M1 e M2, bem como moDCs que foram diferenciados dos monócitos CD14+ humanos. Esta melhoria na metodologia proporcionará aos pesquisadores melhores modelos para investigar o sistema imunológico e os estados da doença.materiais e métodos preparações celulares foram colhidos do sangue total de cinco ou mais dadores saudáveis do sexo masculino que tinham sido agrupados. Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram preparadas a partir de batas buffy por Ficoll-Paque (densidade de 1,077 g/mL) (17-1440-02; GE Healthcare Bio-sciences, Piscataway, NJ) gradiente de densidade de centrifugação a 400 × g a 18°C por 35 minutos para separar constituintes do sangue. As células foram lavadas várias vezes usando 1× PBS e contadas usando um Celômetro Nexcelom Auto T4 plus cell counter (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA). Uma vez contados, os monócitos CD14+ foram isolados a partir de CPSP por etiquetagem magnética utilizando micro-cabeças conjugadas CD14 MAb (130-050-201; Miltenyl Biotec, San Diego, CA), seguido de separação magnético utilizando colunas (130-042-401 e 130-042-302; Miltenyl Biotec), de acordo com as instruções do fabricante, com uma exceção: quando a coleta de CD14+ células do magnética de coluna, as células foram lavadas inicialmente utilizando 5 mL de tampão de depender apenas da gravidade (sem usar o fornecido êmbolo). Após a lavagem inicial de 5 mL, foi adicionado um tampão de 5 mL adicional e corado suavemente utilizando o êmbolo fornecido.os monócitos CD14+ humanos foram semeados com uma densidade celular de 2, 0–3.0 × 105 células/mL em RPMI 1640 médio, com 2 mM de L-glutamina (Life Technologies, Frederick, MD) suplementado com 10% inactivado pelo calor FBS (Sigma, Carlsbad, CA), 100 U/mL de penicilina (Life Technologies), e 100 mg/mL de estreptomicina (Life Technologies) a 37°C em uma umidificado 5% de CO2 incubadora. Para diferenciar as células em macrófagos M1, as citoquinas utilizadas foram GM-CSF (20 ng/mL) (PeproTech, Rocky Hill, NJ), IFN-γ (20 ng/mL), IL-6 (20 ng/mL) e endotoxina LPS (20 ng/mL). Para a diferenciação dos macrófagos M2, as citoquinas utilizadas foram o factor de estimulação de colónias de macrófagos (M-CSF), IL-4, IL-6 e IL-13 a uma concentração de 20 ng/mL (PeproTech). os moDCs foram gerados pela adição de GM-CSF (100 ng/mL) e IL-4 (20 ng/mL). O calendário de cada estratégia é descrito na Figura 1.

Flow cytometry

Polarized macrophages and DCs were cultured for 9 days on 10 cm2 dishes (BD Falcon, Billerica, MA). No dia 9, os meios de comunicação e as células não aderentes foram recolhidos; as células aderentes foram lavadas utilizando 1× PBS, removidas utilizando o tampão de dissociação celular (tecnologias de vida) e, em seguida, adicionadas às células colectadas de meios de comunicação/células não aderentes a lavar. Suspensão de células foram centrifugadas e lavadas duas vezes (1× PBS, 0,5% DE BSA, 2 mM EDTA), contados, e, em seguida, incubadas com o fluoróforo conjugado primária de anticorpos contra CD206 (FITC), CD36 (PE), CD163 (PE-Cy7), E-cadherin (AlexaFluor-488), CD86 (PE), CD1a (FITC), CD83 (PE), CD80 (PE), CD124 (PE), e CD64 (FITC) no escuro por 45 min a 4°C. Fluorescência foi detectado por um S3TM Cell Sorter (Bio-Rad, Hercules, CA).os macrófagos Polarizados foram banhados em lâminas de vidro de 4 poços de câmara (MA Nunc Lab-Tek II, Thermo Scientific, Waltham, MA) Com uma densidade de 3.0 × 105 células / mL no dia 7 e continuou a ser cultivada com as citoquinas adequadas durante os restantes 2 dias. Perylene bisimide (PBI-12-Man) (17) foi um presente gentil de Ke-Rang Wang na Universidade Hebei. As células foram cultivadas com 10 µg / mL de PBI-12-Man durante 30 minutos a 37°C e depois lavadas com 1× PBS. As células foram fixadas usando etanol a 70% e montadas com DAPI (P36962; Life Technologies). Para visualizar a endocitose do homem PBI-12, as lâminas estavam excitadas e emitidas a 585 nm. Imagens de fluorescência vermelha foram quantificadas usando o software de scanning Metafer slide (MetaSystems, Boston, MA). O teste estatístico foi formado usando o software MATLAB R2015a (The Mathworks, Inc., Natick, MA). Foram realizados testes de Rank-sum para testar a significância estatística univariada entre as amostras.os macrófagos foram diferenciados utilizando métodos previamente descritos durante 7 dias e depois transferidos para as lâminas de câmara de vidro de Nunc Lab-Tek II 4 com as citoquinas apropriadas. As células foram deixadas para crescer durante os próximos 7 dias; 14 dias após o revestimento inicial, as células foram fixas usando etanol a 70% e montadas usando o diamante prolongado mountant anti-fade com DAPI. As células foram visualizadas usando contraste de fase e microscopia de fluorescência no EVOS FL Auto (Life Technologies).

resultados e discussão

estratégias e condições para diferenciação MONOCITÁRIA CD14+ humana

começámos por avaliar quais as estratégias mais eficazes na produção de populações homogéneas de macrófagos M1 e M2 humanos, bem como moDCs. Os monócitos CD14+ humanos foram isolados e semeados em placas de cultura de tecidos para serem diferenciados em macrófagos ou moDCs in vitro. Em seguida, testamos três condições de tratamento específicas para determinar o método que produziu as populações de macrófagos e moDC mais uniformes. Para a primeira condição, cultivamos células com a adição de apenas GM-CSF ou M-CSF por 9 dias (Figura 1). Esta condição é denominada “apenas” (Figura 1). A segunda estratégia de tratamento foi expor continuamente as células ao meio citocino aplicável no dia 0, reabastecer o meio, citocinas e LPS no dia 5 e, analisar as células no dia 9. Esta condição é denominada “contínua” (Figura 1). A terceira estratégia foi a de estimular CD14+ monócitos com GM-CSF, M-CSF, durante 5 dias, seguindo-se a adição de novas mídias contendo LPS para humanos M1 macrófagos e de todas as citocinas para um determinado grupo de tratamento (GM-CSF, IFN-γ e IL-6 para M1 macrófagos (M-CSF, IL-4, IL-13 e IL-6 por M2 macrófagos). Esta estratégia de tratamento foi denominada “faseada” (Figura 1). Tratamento de monócitos CD14+ com 100 ng / mL de GM-CSF e IL-4 durante 5 dias e substituição de meios e de todas as citocinas no moDCs gerado no dia 5. Os moDCs foram então estimulados com IL-6 e LPS por 24 h antes da análise (dia 8) para promover a maturação e ativação da DC. Este método de cultura foi chamado de “estimulado” (Figura 1). Os moDCs que nunca receberam a exposição IL-6 e LPS foram denominados “não estimulados” (Figura 1). Após 9 dias de cultura nas condições específicas descritas acima, foram analisadas a expressão do receptor da superfície celular e a funcionalidade celular.a exposição a

IL-6 aumenta a eficiência de polarização do M2 in vitro

estudos anteriores demonstraram que a exposição aos macrófagos à citoquina IL-6 não só prolonga a diferenciação monocitária de uma célula dendrítica para um fenótipo de macrófagos, como também aumenta o perfil de expressão do mRNA associado aos macrófagos do M2 (15,18). Para confirmar estes resultados e testar o efeito da IL-6 na polarização M1 e M2, os monócitos CD14+ humanos nas condições de cultura contínua e faseada foram tratados com ou sem IL-6. O exame da expressão do marcador de superfície de macrófagos do M2 em células diferenciadas do M1 não mostrou alterações significativas quando cultivados com IL-6 (Figura 2), sugerindo que o tratamento com IL-6 não desvia os macrófagos polarizados do M1 para um fenótipo do M2.inversamente, a análise dos grupos de cultura de macrófagos de M2 em contínuo e faseado revelou que o tratamento com IL-6 aumentou a expressão dos marcadores de superfície de macrófagos de M2. Nas populações de macrófagos M2, a expressão CD206 e CD36 manteve-se elevada e parecia inalterada quando exposta à IL-6 (Figura 2, a e B). No entanto, o CD163 e o e-cadherin apresentaram aumentos significativos nos níveis de expressão superficial e na homogeneidade da população quando tratados com IL-6 (Figura 2, C E D). Isto é demonstrado pela diminuição dos picos CD163 e e-cadherin de baixa expressão (setas vermelhas na Figura 2, C E D) e pela mudança resultante para uma população homogênea de alta expressão.

IL-6 is often used to induce moDC maturation (18,19). A fim de determinar se o tratamento com IL-6 poderia resultar em moDCs indesejáveis dentro das populações polarizadas com macrófagos, foi examinada a expressão marcador de superfície de DC Maduro (CD83). A análise citométrica do fluxo demonstrou que nenhuma das condições de cultura M1 ou M2 promoveu qualquer aumento significativo na expressão CD83 (figura 2E). Isto sugere que não houve contaminação moDC nestas populações de macrófagos ou que qualquer modc contaminante foi insensível à IL-6.

de Fases de polarização leva ao aumento da expressão da canonical M1, M2, e moDC célula-superfície de marcadores

Para confirmar que humanos CD14+ monócitos foram totalmente diferenciadas em macrófagos ou moDCs Dia 9, a citometria de fluxo foi utilizada para analisar da superfície celular e marcadores de avaliar diferenças morfológicas (Figura 3, A-C). Os monócitos CD14+ humanos foram diferenciados (Figura 1) para avaliar que estratégia produziria uma elevada expressão de marcadores de superfície adequados do tipo celular. Foi testado um painel de marcadores da superfície celular para cada um dos tipos de células. O nosso painel de marcadores de superfície celular M1 consistia nos marcadores canônicos CD86 e CD80 (Figura 3, A-C). Para o painel de macrófagos M2, utilizámos CD206, CD163, CD124 (receptor-α IL-4), e-cadherina e CD36 (receptor de necrófago de Classe B) (Figura 3, A-C). Para moDCs, CD83, CD86 e CD1a foram utilizados. Os níveis de expressão da superfície para todos os marcadores testados foram determinados para todos os tipos de células (figura suplementar S1). A intensidade média de fluorescência (MFI) foi calculada e mostrada como alteração da dobra em relação ao controlo não encadeado correspondente (ver quadros na Figura 3).

curiosamente, a análise dos marcadores da superfície celular do M2, CD36 e IL-4Ra, nos macrófagos polarizados M1 GM-CSF apenas revelaram aumentos dramáticos (figura 3A). Ao comparar as células tratadas apenas com GM-CSF com todos os grupos de tratamento com M1, o grupo apenas com GM-CSF teve uma expressão CD36 marcadamente mais elevada. Estas células GM-CSF apenas expressaram também níveis baixos dos marcadores associados ao M1 CD86 e CD80. Da mesma forma, a condição contínua rendeu células que não eram apenas baixas em CD86 e CD80, mas também eram altas na expressão CD36 e IL-4Ra. Inversamente, quando os monócitos CD14+ humanos foram diferenciados sob a condição de fase M1, CD86 e CD80 foram visivelmente regulados, enquanto a expressão CD36 e IL-4RA permaneceu baixa. Uma análise adicional por citometria de fluxo da expressão marcador de superfície celular revelou que os macrófagos M1 tinham uma expressão mais baixa de CD206, CD36 e CD163 em relação aos macrófagos de M2 em exposição faseada e contínua (figuras suplementares S1 e S4). Além disso, estas variadas condições de cultura geram células com características morfológicas e estrutura distintas (figura 3A). Enquanto as células tratadas apenas com GM-CSF parecem ser maiores, os dados de dispersão para a frente (FSC) revelaram diferenças mínimas de tamanho entre os grupos (figuras suplementares S2 e S3). A comparação da complexidade interna (SSC) entre as condições de tratamento revelou um aumento da granularidade nos grupos GM-CSF e faseados (figura suplementar S2). Em conjunto, estes resultados mostram que apenas GM-CSF e o tratamento contínuo produzem células que expressam baixos níveis de marcadores M1 e altos níveis de certos marcadores M2, bem como exibindo alterações morfológicas.as condições de cultura de macrófagos

M2 produziram resultados ligeiramente mais ambíguos do que os encontrados com as condições de cultura de macrófagos M1 (figura 3B). Em relação ao grupo apenas M-CSF, os grupos faseados e contínuos apresentaram níveis de expressão aumentados de CD206. Inversamente, os níveis de superfície IL-4Ra foram marcadamente mais elevados em condições de apenas M-CSF, em relação ao contínuo e ao faseado. A expressão e-cadherin permaneceu uniforme entre os grupos, enquanto o CD163 foi significativamente maior tanto nos grupos m-CSF-somente quanto nos grupos faseados. Note-se que o grupo de exposição contínua foi consistentemente muito menos homogéneo no que diz respeito à expressão do marcador da superfície celular. Isto é ilustrado pela distribuição bimodal e grande variância nos níveis de expressão encontrados no histograma. Além disso, podem ser observadas diferenças morfológicas dramáticas entre os grupos de tratamento. Com base nas imagens de contraste de fase, o Grupo M-CSF produziu células que parecem ser menores e altamente granulares (figura 3B). A análise citométrica do fluxo demonstra que estas células têm tamanho semelhante (FSC), no entanto, há um aumento na granularidade celular nas condições de tratamento em fase e contínuo (figura suplementar S2). Por último, a privação de glutamina alterou a polarização M2, demonstrando que os produtos metabólicos são necessários ao abrigo desta estratégia (figura suplementar S5). Ao todo, estes dados sugerem que as condições faseadas produzem a maior eficiência para a polarização de macrófagos M2.em seguida, examinamos a expressão de marcadores de superfície de moDCs que não foram estimulados ou estimulados com IL-6 e LPS 24 h antes da análise citométrica de fluxo. A estimulação com IL-6 e LPS resultou num aumento na expressão CD80, CD83 e CD86 (figura 3C). A expressão madura da superfície celular CD83 aumentou dramaticamente após a ativação usando IL-6 e LPS no dia 8 em relação ao grupo não estimulado. Isto confirmou que IL-6 e LPS foram capazes de promover a maturação das células dendríticas (figura suplementar S1L). A expressão CD1a permaneceu uniforme entre os grupos não estimulados e estimulados. Curiosamente, os DCs estimulados permaneceram em suspensão, no entanto, pareceram começar a agregar-se e aderir uns aos outros (figura 3C). Estes resultados confirmam resultados anteriores relativos à polarização do moDC e proporcionam um controlo adicional para a análise do marcador de superfície para identificar populações de moDC indesejáveis nas várias condições de cultura de macrófagos.os macrófagos de

M2 gerados pela exposição às citocinas em fase possuem funcionalidade associada ao M2

o receptor de manose (CD206) é um receptor endocítico e de reciclagem que é altamente expresso nas nossas populações de macrófagos de M2 em condições de tratamento em fase. Em seguida, queríamos avaliar a captação endocítica mediada por CD206 em nossos macrófagos. Isto foi determinado utilizando o PBI-12-Man, um agente biocompatível que fluoresce ao ligar-se ao receptor da manose (17). Após um tratamento de 1 h de macrófagos M1 e M2 com PBI-12-Man, A fluorescência vermelha de PBI-12-Man foi predominantemente intracelular nos macrófagos M2 em condições de tratamento faseado e contínuo (Figura 4, A e B). Este achado sugere que a ligação da superfície celular ao CD206 e endocitose resulta na localização vesicular. Tal está de acordo com os dados anteriores da citometria de fluxo, que demonstraram que, em condições de tratamento faseado, os macrófagos M2 apresentavam uma expressão de superfície celular mais elevada de CD206 em relação à população de macrófagos M1. Curiosamente, descobrimos que as células GM-CSF-somente apresentaram altos níveis de endocitose PBI-12-homem (figura 4, A e B). Isto correlaciona-se com os nossos dados citométricos de fluxo (Figura 2), que demonstraram que as condições de cultura GM-CSF apenas produzem células M1 com expressão de marcador de superfície associada ao M2. Ao todo, demonstramos que estas células possuíam as características normais dos macrófagos e que o CD206 era funcional na população de macrófagos M2.

após 14 dias de cultura, os macrófagos M2 também mostraram capacidade de fusão, atingindo mais de 200 µm de tamanho e contendo múltiplos núcleos por célula (figura 4C). Estas semelhantes células gigantes multi-nucleadas (MNGCs) que têm sido relatadas possuir fagocíticas e outras habilidades (20). Adicionalmente, MNGCs têm sido associados com material estranho no corpo, tuberculose e câncer (20-23). Esta fusão celular foi encontrada exclusivamente em nossas populações de macrófagos M2 e foi muito mais significativa na condição de fase M2. Embora os grupos apenas com M-CSF tivessem algumas células multinucleadas( figura 4C), o seu tamanho e número eram muito inferiores ao grupo faseado. Dada a capacidade destas células para desempenhar esta função associada aos macrófagos, estes resultados indicam ainda que as condições de cultura faseada produzem macrófagos de tipo altamente M2.

aqui descrevemos o nosso protocolo de fase recentemente desenvolvido para a polarização macrófaga. Descobrimos que a inclusão da IL-6 e o escalonamento do tratamento de polarização são absolutamente críticos na geração de macrófagos mais M1 e M2 in vitro. Este achado foi testado rigorosamente quando comparado com outros métodos de polarização. Por esse motivo, consideramos que o método de polarização faseada constitui um passo substancial em frente. Isso dará aos pesquisadores padrões experimentais unificados para produzir populações homogêneas de macrófagos para uso in vitro e a capacidade de comparar seus resultados. Enquanto este protocolo oferece uma série de melhorias em comparação com as estratégias de polarização atuais, acreditamos que a pesquisa adicional e otimização dos tempos de exposição e o coquetel citocino seria útil. Isto irá ajudar-nos a compreender melhor os papéis complexos dos macrófagos M1 e M2 em várias formas de progressão da doença e a promover o desenvolvimento de novos terapeutas.