Animais

peixe-zebra foram mantidos em 28,5 °C em 14 de rh ON/10 hr FORA ciclo de luz em Danieau solução . O mutante cristal combinatorial (albb4 / b4;nacrew2 / w2;roya9 / a9) foi gerado pela cruzamento sequencial de três diferentes estirpes mutantes, nomeadamente nacrew2/w2 (ref. 9), roya9/a9 (ref. 4) e albb4 / b4 (ref. 18) mutantes. O que é importante é que tanto as larvas como os peixes-zebra de cristais adultos são viáveis e não apresentam anomalias morfológicas, funcionais ou comportamentais visíveis para além do fenótipo da pigmentação. O mutante casper foi obtido cruzando os mutantes nacrew2/w2 e roya9/A9, como descrito anteriormente4. A linha AB foi usada para obter peixes-zebra de tipo selvagem. As linhas transgénicas utilizadas neste estudo incluem o Tg (elavl3:GCaMP5G)21 e o TG (elavl3:GCaMP6f)28. Foram realizadas experiências de imagiologia funcional Confocal no mutante de nacre. Experimentos de imagens em placas de luz foram realizados em mutantes de nacre, casper e cristal. Experiências de imagiologia funcional de dois fótons foram realizadas em larvas de cristal. Para tratar as larvas de peixe-zebra com PTU, seguimos os procedimentos padrão 8, especificamente as larvas foram levantadas em 200 µM de PTU (Sigma) na solução de Danieau a partir de 24 horas após a fertilização (hpf). As larvas Tg (elavl3:GCaMP5G) utilizadas para imagiologia confocal funcional de actividade neural evocada visualmente no tectum óptico foram tratadas com uma PTU de 200 µM de 24 hpf para 3 dpf e imagadas a 4 dpf. Este trabalho foi aprovado pelo local de bem-estar Animal e a Revisão Ética Corpo (King’s College London), e foi realizada em conformidade com os Animais (Procedimentos Científicos) Act 1986, sob licença, do Reino Unido Home Office (PPL70/8057).imagens de animais inteiros de peixes adultos foram tiradas com uma câmara SLR digital Nikon D7000 equipada com uma macro lente Sigma de 150 mm. O peixe-zebra adulto foi anestesiado com 0.2% de tricaína (MS222, Sigma) na água da instalação para peixes e colocada numa placa de petri de 90 mm contendo água da instalação para peixes. Imaging of larvae was performed using a ZEISS Axioskop microscope connected to EXi Blue CCD cameras (Retiga) and Volocity acquisition software (PerkinElmer). Os peixes-Zebra larvares foram anestesiados com 0, 02% de tricaína na solução de Danieleau e imobilizados em agarose de ponto de fusão baixo (Sigma) em lâminas de vidro.a imagiologia do cálcio Confocal foi realizada utilizando um microscópio confocal ZEISS LSM 710 equipado com uma cabeça de varrimento espectral de detecção e uma 20X/1.0 objectivo de imersão em água (Carl Zeiss). Séries cronológicas funcionais de respostas de cálcio evocadas visualmente em células de ganglionamento da retina (RGCs) foram adquiridas a uma taxa de resolução de 4,1 Hz e 0,415 × 0,415 µm (256 × 256 pixels), e uma abertura AU pinhole. A luz de excitação foi fornecida por um laser multi-linha de 488 nm. As larvas Tg não anestesiadas (elavl3:GCaMP5G) foram imobilizadas em agarose (Sigma) de ponto de fusão 2% baixo, preparadas em solução de Danieau e montadas do lado dorsal numa plataforma de vidro levantada que foi colocada numa câmara de Danieleau cheia por medida. A agarose foi suficiente para conter as larvas, pelo que não foi necessária anestesia. A imagem foi realizada na tarde (1-8 pm).a imagem da folha de luz de todo o cérebro foi realizada utilizando uma folha de luz Z. 1 do ZEISS, equipada com dois objectivos de iluminação 10X/0.2 NA e um objectivo de detecção de imersão em água 20X/1.0 (Carl Zeiss). A luz de excitação laser de 488 nm foi usada para provocar fluorescência GCaMP6f e um filtro BP 505-545 foi usado para detecção de luz emitida. O scanner pivot (Carl Zeiss) foi usado para fornecer iluminação homogênea e, portanto, evitar sombras ao longo do eixo de iluminação. A espessura da folha de luz era de 5,39 µm no centro e 10,8 µm nas bordas do campo de visão. Tempo de exposição foi de 29,97 ms. O tamanho do volumétrica de imagens foi de 623 × 798 × 283 µm3 (1500 × 1920 × 490 pixels) com uma resolução de 0.415 × 0.415 × 0.631 µm. 4 larvas dpf, casper e crystal Tg (elavl3:GCaMP6f) foram paralisadas pela primeira vez durante 10-15 minutos Em α-bungarotoxina (1 mg/ml; Biotium) preparada em solução de Danieau. Subsequentemente, as larvas foram imobilizadas em agarose (Sigma) de ponto de fusão 2% baixo e colocadas dentro de um capilar de vidro (20 µl de volume, 701904; marca). Posteriormente extrusamos a seção do cilindro de agarose contendo a cabeça da larva do capilar, e orientamos as larvas de modo que o lado dorsal da cabeça estava voltado para o objetivo de detecção e os olhos estavam voltados para os dois objetivos de iluminação. A imagem em folha de luz de casper mutant foi realizada usando um microscópio de folha de luz feito sob medida construído pelo Dr. Martin Meyer (King’s College London) e equipado com um objectivo de detecção XLUMPlanFLN de imersão EM água 20X/1.0 NA (Olympus).a imagiologia funcional de dois fotões na retina foi realizada utilizando um microscópio Nikon A1R MP equipado com um GaAsP NDD de 4 canais e um Apochromat 25X/1, 1 na objectivo de imersão em água (Nikon). Excitation was provided by a Chameleon Ultra II Mode-locked titanium-sapphire laser (Coherent) tuned to 930 nm. As séries cronológicas das respostas de cálcio evocadas visualmente foram adquiridas a uma taxa de resolução de 4 Hz e 0.248 × 0.248 µm (512 × 256 pixels). Após a ativação da varredura laser, esperámos 60 segundos antes de iniciar a estimulação visual para garantir que a retina se adaptasse ao nível de luz de fundo causado pelo laser multi-fóton. 4 larvas de cristal dpf (elavl3: GCaMP6f) foram paralisadas pela primeira vez durante 10-15 minutos Em α-bungarotoxina (1 mg/ml; Biotium) preparada em solução de Danieau. Subsequentemente, as larvas foram imobilizadas em agarose de ponto de fusão 2% baixo (Sigma) e montadas numa plataforma de vidro feita sob medida com o lado dorsal para cima (inclinação de ângulo de 45°) e um olho virado para um ecrã LCD (ver estimulação Visual) que foi colocado debaixo de uma câmara cheia de Danieleau feita sob medida. A imagem foi realizada na tarde (1-8 pm).foram gerados estímulos de barras móveis, como descrito anteriormente 22, 33. Um filtro de difusão (3026, Rosco) foi ligado a um lado da câmara para servir como uma tela de projeção. A agarose na frente do olho virado para a tela de projeção foi removida, permitindo uma visão desobstruída da imagem projetada no lado da Câmara. As larvas foram posicionadas a 3 cm da tela e a imagem projetada preencheu um campo visual de ~97° × 63°. Os estímulos visuais consistiram em luz (56 cd/m2) ou barras escuras (8 cd/m2) (175% e 25% da luminância média, respectivamente) sobre um fundo cinzento médio (32 cd/m2). Como não se observaram diferenças qualitativas entre as barras clara e escura, os dados obtidos utilizando os dois estímulos foram combinados. Cada barra tinha 10° de largura, movendo-se a uma velocidade de 20°/s e separada da barra anterior por 30°, permitindo mais de uma barra no ecrã de cada vez. Os eixos longos das barras eram ortogonais para a direção do movimento. Cada uma das 12 direções de movimento foi apresentada uma vez (3 segundos) em uma ordem pseudo-aleatória única para cada fatia em cada animal fotografado. Cada intervalo inter-epoch foi de 10 segundos para permitir que os sinais GCaMP5G retornassem à linha de base. A blank-screen null condition of 2 seconds was also interleaved. Experimentos visuais foram gerados e controlados usando Labview e matlab code (MathWorks), implementados em um ViSaGe stimulus presenter (Cambridge Research Systems) e entregues através de um DLP Pico Projector (Optoma).as grelhas móveis em preparação de dois fótons foram geradas e controladas utilizando Psicopy39, e entregues através de um ecrã LCD (SKD5VA-3, Tecnologia GoodWell) colocado sob uma câmara Perspex personalizada. Um filtro de vidro vermelho de passagem longa (Fgl610, Thorlabs) foi posicionado entre o ecrã LCD e a câmara para permitir imagens simultâneas e estimulação visual. As larvas foram posicionadas a 2 cm do ecrã e a imagem no ecrã LCD encheu um campo visual de ~140° × 100° (luminância média de fundo de 30,4 cd/m2). Estímulos visuais consistiram em grelhas de ondas quadradas (100% de contraste, frequência espacial 1,66 ciclos/cm, frequência temporal 1 ciclos/s). Cada barra de grade tinha 8,5° de largura e os eixos longos das barras eram ortogonais para a direção do movimento. Cada uma das 12 direções de movimento foi apresentada uma vez (6 segundos) com e intervalo inter-epoch de 10 segundos para permitir que os sinais GCaMP6f retornem à linha de base. A blank-screen null condition of 6 seconds was also interleaved. TTL desencadeia (0-5-0 Volts) para gravar eventos de tempo da época quando gerados através de um dispositivo USB LabJack DAQ (U3-LV, LabJack Corporation). Após a ativação da varredura laser, esperámos 60 segundos antes de iniciar a estimulação visual para garantir que a retina se adaptasse ao nível de luz de fundo causado pelo laser multi-fóton.5 larvas de dpf individuais foram posicionadas numa placa de petri de 35 mm contendo solução de Danieau. O ecrã LCD de um iPhone 5 (Apple) controlado por um MacBook Pro (Apple) através do Duet Display (Kairos Technologies) foi usado para exibir grelhas quadradas em preto e branco (85% de contraste, frequência espacial 0,33 ciclos/mm, frequência temporal 3,5 ciclos/s) movendo-se em 4 direções (90° de distância angular) na parte inferior da placa de petri. Estímulos visuais foram gerados em Keynote (Apple). Cada larva foi testada 5 vezes no total (cada ensaio durou 6 s seguido de 10 s de grelhas estáticas) e pontuada de acordo com os ensaios a que respondeu (ou seja, voltas de peixe e nadam na direcção das grelhas em movimento). O comportamento das larvas foi visualmente monitorizado utilizando um estereomicroscópio FC M165 (Leica).foram analisados dados de imagiologia do cálcio in vivo,como descrito anteriormente. Em resumo, as séries cronológicas funcionais foram processadas antes da análise da seguinte forma:: imagens de séries temporais de cada experimento foram corrigidas para o movimento com um algoritmo de corpo rígido (SPM12; http://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/), filtrado com um tamanho de núcleo de 1 voxel para remover o ruído escuro e de tiro, e suavizado espacialmente com um kernel gaussiano 2D = 2 voxels para melhorar o sinal-ruído. A baseline (b) that corrects for low-frequency drifts was determined using a cubic-spline algorithm extrapolating between knots averaged from 5 s of the inter-epoch interval data. Ambas as variações da intensidade do sinal relativo (ΔF = F-B); em que F = fluorescência bruta) e alterações normalizadas da intensidade do sinal foram calculadas em cada voxel. ΔF foi usado para dados funcionais da população (análise voxel-wise), enquanto % ΔF / F0 foi usado para regiões de interesse definidas manualmente (Ris). Para cada voxel ou ROI, a resposta integral ao longo do intervalo epoch foi calculada para fornecer uma única métrica de resposta de cada direção de movimento de estímulo apresentada. A integral dentro de cada janela De época é uma métrica de resumo mais resistente aos efeitos de saturação da sonda de cálcio do que a mudança de sinal máxima. A threshold for each voxel within an acquisition image sequence was determined from the variance of ΔF changes during the inter-epoch intervalos and null condition, threshold = 5 × SDs. Todos os voxels que eram supra-threshold dentro de pelo menos duas epochs de apresentação visual foram considerados como sensíveis visualmente e submetidos a maior caracterização.

para analisar a direção e orientação seletividade dos índices seletivos de direção e orientação do voxels (DSI e OSI)40, baseados em von – Mises instalados ou perfis Gaussianos 41, foram calculados juntamente com uma estimativa de sua bondade de fit, R2. O DSI foi definido como(Rpref−Rnull)/(Rpref + Rnull), onde o Rpref, a resposta à direção preferida, era a resposta integral sobre o intervalo de tempo de direção preferido. Rnull foi igualmente calculado como a resposta integral evocada pela direção oposta à direção preferida. O OSI foi definido como(Rpref−Rorth)/(Rpref + Rorth), onde o Rpref, a resposta à orientação preferida, foi a resposta integral sobre o intervalo epoch-orientation preferido. Rorth was similarly calculated as the integral response evoked by the orthogonal orientation. Para minimizar a conversa cruzada e sobre-ajuste associado com as métricas DSI e OSI, uma abordagem rigorosa foi realizada. Para que um voxel seja considerado selectivo de direção (DS) ou selectivo de orientação (OS), foram utilizados critérios mutuamente exclusivos: DS se DSI > 0,5 e OSI < 0.5; and OS if OSI > 0.5 and DSI< 0.5. Em ambos os casos, a bondade do ajuste (R2) para DSI e OSI, respectivamente, teve que ser >0,8; assim, as curvas ajustadas explicaram pelo menos 80% das respostas integrais. Uma única distribuição de von-Mises foi usada para ajustar as respostas de DS voxels e estimar sua direção preferida de ângulo de movimento a partir do centro da curva ajustada. A soma de dois von-Mises (distância angular de 180°) foi usada para ajustar as respostas dos voxels e estimar a sua orientação preferida de ângulos de movimento a partir dos centros das curvas ajustadas. Variância Circular também foi calculada para comparação como uma métrica alternativa de selectividade de orientação (variância Circular < 0,4)41.

análises morfológicas

para determinar o volume cerebral imaginado em 4 dpf nacre, casper e cristal Tg(elavl3:GCaMP6f) larvas, foi calculado o número de GCaMP6f+ voxels em cada volumétrico de imagem, aplicando-se o ajuste de>função de limite seguido pela analise>histograma>lista de comandos em ImageJ42. Posteriormente, os valores obtidos foram multiplicados pelo volume de um único voxel (0.415 × 0.415 × 0.631 µm3 = 1.086 × 10-1 µm3).os resultados dos ensaios estatísticos são apresentados em figuras e lendas de figuras. Análises e testes estatísticos foram realizados utilizando Prism 6 (GraphPad) ou MATLAB R2014b (MathWorks). Antes de realizar testes estatísticos, foram utilizadas estatísticas descritivas (por exemplo, testes de normalidade para verificar se os valores provêm de uma distribuição gaussiana ou de um teste F para comparar variâncias) para escolher o teste estatístico adequado (indicado nas legendas das figuras juntamente com os resultados dos testes). O critério de significância estatística foi estabelecido em p < 0,05.