O fungo Candida guilliermondii é amplamente distribuído na natureza, incluindo o homem microbiota da pele e superfícies mucosas.22 embora esta espécie apresente uma virulência reduzida em comparação com outras espécies de Candida 3, é actualmente considerada um agente patogénico emergente, com uma grande incidência na América Latina.18C. guilliermondii tem sido reconhecido como o agente etiológico de uma ampla variedade de infecções clínicas, incluindo disseminada queridos, principalmente em pacientes imunocomprometidos,22 e surtos nosocomiais em pacientes cirúrgicos com dispositivos intravasculares.Actualmente, o tratamento recomendado para a candidíase invasiva em doentes neutropénicos inclui a caspofungina (CFG) ou a micafungina (MFG) como terapêuticas de primeira linha, a anfotericina B (LAMB) lipossómica e a anidulafungina (AFG) como alternativas, enquanto o fluconazol (FLC) é recomendado apenas quando a susceptibilidade a este medicamento é confirmada.No entanto, vários estudos demonstraram que C. guilliermondii tem uma susceptibilidade diminuída aos FLC8,15,19, e foram notificadas falhas terapêuticas associadas a isolados com elevadas concentrações inibitórias inibitórias mínimas da anfotericina B (Mic).9,12,24, Embora cerca de 90% dos isolados mostra echinocandins Microfones iguais ou inferiores a clínica pontos de interrupção (CBP) de susceptibilidade (2µg/ml),17 similar a outras espécies de Candida, como C. parapsilosis, alguns isolados de C. guilliermondii mostrar MICs consideravelmente alta.Os dados disponíveis relativos à eficácia AFG na candidíase invasiva são limitados e o potencial papel desse medicamento na prática clínica é pouco conhecido.23 neste contexto, os estudos em animais podem desempenhar um papel importante para uma melhor compreensão da correlação in vitro–in vivo.11 portanto, nosso principal objetivo foi avaliar as atividades in vitro e in vivo da AFG contra diferentes isolados de C. guilliermondii, comparando os resultados com os de AMB e FLC.4 isolados clínicos de C. guilliermondii (UTHSC 11-142, UTHSC 10-499, UTHSC 11-685 e UTHSC 10-3207) foram utilizados no estudo in vitro, e dois deles (UTHSC 11-685 e UTHSC 11-142) foram selecionadas para o modelo murino com base em suas diferentes in vitro susceptibilidades. Os isolados foram identificados sequenciando a região interna transcrita do spacer (ITS) e os domínios D1–D2 do rRNA, comparando as sequências com as do tipo de estirpe desta espécie.estudos in vitro
a susceptibilidade in vitro das quatro estirpes à AMB, FLC e AFG foi avaliada utilizando um método de microdilução de caldo de referência,sendo a 6candida parapsilose ATCC 22019 e Candida krusei ATCC 6258 incluída como controlos de qualidade.as curvas de tempo-morte foram desenvolvidas para todas as estirpes de acordo com estudos anteriores.Em resumo, foi preparada uma solução-mãe de cada antifúngico, AMB (Sigma–Aldrich Co., St.Louis, USA) e AFG (Pfizer Inc., Madrid, Espanha) foram dissolvidos em sulfóxido de dimetilo e FLC (Pfizer Inc., Madrid, Espanha)em água destilada. Além disso, foram preparadas diluições do fármaco em 9 ml do meio padrão RPMI 1640 para obter concentrações de 0.03, 0.12, 0.5, 1, 2, 8 e 32 µg / ml de cada droga. Os isolados foram subculturados a 35 ° C durante 24h em placas de ágar de dextrose de batata (PDA). As culturas de C. guilliermondii foram suspensas em solução salina estéril e as suspensões resultantes foram ajustadas a 5×106 unidades formadoras de colónias (UFC)/ml por Contagem de hemocitómetros e por revestimento em série em PDA para confirmar a viabilidade. Diluições e controles (sem drogas) foram inoculados com 1 ml das suspensões fúngicas, resultando em uma partida de inóculo de 5×105CFU/ml e incubados a 35°C. Uma alíquota de 100 µl de cada tubo foram coletadas em 0, 2, 4, 6, 8, 24, e 48h após a inoculação e diluído em água destilada; 30 µl deles foram cultivadas em PDA placas e incubados a 35°C por 48h para CFU/ml determinação. Uma diminuição da UFC ≥99, 9% ou 3 log10 unidades em comparação com o inóculo inicial foi considerada fungicida, enquanto uma redução de log10 unidades, foi considerada fungistática. O limite de detecção foi de 50CFU / ml. Todos os estudos da curva de tempo-morte foram realizados em duplicate.In foram utilizados na experiência estudos vivo em ratos machos de-1 (Rio Charles; Criffa SA, Barcelona, Espanha) com um peso médio de 30 g. Os ratos eram alojados em caixas padrão com livre acesso a comida e água. Todos os procedimentos em matéria de animais foram supervisionados e aprovados pelo Comité de Ética e bem-estar dos animais da Universitat Rovira i Virgili.ratinhos ficaram neutropénicos um dia antes da infecção por uma injecção intraperitoneal de 200 mg / kg de ciclofosfamida (Genoxal; Laboratorios Funk SA, Barcelona, Espanha) mais uma injecção intravenosa (I. V.) injecção de 5-fluorouracilo (Fluorouracilo; Ferrer Farma SA, Barcelona, Espanha) a 150mg/kg.10,14 O dia de infecção, os ratos foram desafiados eu.v. com 1×108CFU/animal de cada uma das duas cepas de C. guilliermondii, UTHSC 11-685 e UTHSC 11-142, em 0,2 ml de soro fisiológico na veia caudal lateral.Foram estabelecidos aleatoriamente 3,4 grupos
de oito animais para cada estirpe e fármaco. Os grupos foram tratados da seguinte forma: anfotericina B deoxycholate (AMBd) (Xalabarder Farmácia, Barcelona, Espanha) em doses de 0,8 mg/kg eu.v. uma vez ao dia (QD); lipossomas anfotericina B (CORDEIRO) (Gilead Sciences, S. A., Madrid, Espanha) a 10mg/kg I. V., QD; FLC (Pfizer Inc., Madrid, Espanha) a 25 mg/kg oralmente (P.O.) por gavage, duas vezes por dia (BID); e AFG (Ecalta; Pfizer Ltd., Sandwich, Kent, Reino Unido) com 10 mg/kg de peso corporal/dose I. p., QD. Todos os tratamentos começaram 24h após o desafio, e durou 7 dias. Os controlos não receberam tratamento. Para prevenir infecções bacterianas, todos os ratinhos receberam 5 mg/kg de ceftazidima diária por via subcutânea nos dias 1 a 7 após a infecção. Os ratos foram verificados diariamente e eutanasiados no dia 8 após a infecção por anoxia de CO2. A eficácia de cada fármaco foi avaliada através de estudos histopatológicos e de redução da carga tecidular. Os rins foram removidos assepticamente, e um deles foi pesado e homogeneizado em 2 ml de solução salina estéril. Diluições em série de 10 vezes dos homogeneizados foram revestidas a PDA e incubadas durante 48h a 35°C para o cálculo da ufc/g. Para o estudo de histopatologia, o rim restante foi fixado com formalina tamponada a 10%, desidratada, parafina incorporada e cortada em secções de 2 µm, as quais foram manchadas com hematoxilina–eosina (H-E) e coloração ácido-Schiff (PAS) periódica para exame por microscopia luminosa.
Statistics
Colony counts from tissue were analyzed using the Mann-Whitney U-test, using Graph Pad Prism 4.0 for Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Quando os valores de P foram inferiores a 0, 05, as diferenças foram consideradas estatisticamente significativas.os estudos resultantes de estudos in vitro
de AMB foram de 0, 25–1 µg/ml, 0, 06–0, 25 µg/ml para AFG e 0, 5–1 µg/ml para FLC. Após os cortes de susceptibilidade para o AMB,FLC e AFG contra C. guilliermondii, 16 todos os isolados eram suscetíveis aos três medicamentos. As estirpes de controlo de qualidade sensíveis encontravam-se dentro dos intervalos aceites.6
a cinética de occisão de AMB demonstrou uma actividade fungicida rápida que aumentou com a concentração do fármaco. Em concentrações equivalentes ao CIM, este fármaco demonstrou um efeito fungicida contra três dos quatro isolados testados(Fig. 1). Esta actividade começou imediatamente após a inoculação em concentrações superiores a 1 µg/ml, sendo atingido o objectivo fungicida após 4h a 32 µg/ml. O AFG, em concentrações superiores a 0, 5 µg/ml, revelou actividade fungicida que se inicia após 4h de incubação. O objectivo fungicida foi atingido às 12-24h de incubação a 32 µg / ml (Fig. 2). FLC mostrou actividade fungistática contra todos os quatro isolados(Fig. 3).
estudos In vivo
CORDEIRO em 10mg/kg, foi a única droga capaz de reduzir a carga fúngica nos rins de camundongos infectados com cada uma das duas estirpes, sendo a redução significativamente maior do que a das outras terapias (P = 0.04). AMBd e FLC só foram capazes de reduzir o tecido de peso em camundongos infectados com a cepa que apresentaram a menor Microfones para estas duas drogas, por exemplo, de 0,25 µg/ml para a AMB e 0,5 µg/ml para o FLC (P = 0.008). No caso da AFG, a redução da carga fúngica foi modesta e inferior à do AMBd, e reduziu significativamente a carga tecidular no rim apenas em relação ao grupo de controlo da estirpe UTHSC 11-685 (P=0, 002) (Fig. 4).
Effects of antifungal treatment on colony counts of C. guilliermondii in kidney of neutropenic mice, 8 days post infection. LAMB 10, liposomal amphotericin B at 10mg/kg QD; AMBd 0.8, amphotericin B deoxycholate at 0.8mg/kg QD; AFG 10, anidulafungin at 10mg/kg QD. aP0.05 versus control; bP0.05 versus AMBd 0.8, AFG 10 e FLC 50; cP0. 05 versus AFG 10 e FLC 50.
O estudo histológico mostrou focal infiltração de células fúngicas em rins de animais não tratados e em camundongos tratados com AMBd, FLC ou AFG. Os rins de ratos tratados com cordeiro mostraram apenas uma ligeira invasão fúngica. Os sinais de necrose, resposta inflamatória ou alterações do parênquima não foram nem observados nos controlos nem nos animais tratados (Fig. 5).
presença de infiltração fúngica( seta negra) na secção renal de um rato infectado com C. guilliermondii, 8 dias após a infecção (coloração ácida periódica, ampliação 1000×). Bar=10µm.
Discussão
Os estudos in vitro não revelou diminuição da susceptibilidade de C. guilliermondii isola a FLC ou AFG. De acordo com estudos anteriores, as curvas tempo-morte de AMB mostraram uma actividade fungicida dependente da concentração contra todos os isolados,4,5,7 e FLC mostraram um efeito fungistático independentemente da concentração testada.Sabe-se que o AMBd apresenta uma eficácia superior à sua formulação lipídica, especialmente no rim, quando administrado em ambas as doses.No entanto, estudos farmacocinéticos demonstraram que, após a administração de 0, 75 mg/kg de AMBd, a Cmax da AMB atingida no ratinho foi de 0, 30 µg/ml.25 No entanto, a MIC de AMB de um dos dois isolados testados é superior a este valor; por isso, usamos uma dose elevada de cordeiro para alcançar concentrações mais elevadas.De facto, a administração de borrego a 10 mg/kg foi eficaz na redução da carga fúngica de ambas as estirpes. Este facto correlacionou-se com as curvas de occisão, em que a AMB atingiu a sua actividade fungicida contra os dois isolados testados in vivo, em concentrações de 1µg/ml. Tanto quanto sabemos, este foi o primeiro estudo que tentou estabelecer uma relação entre a cinética de occisão e a eficácia experimental in vivo da AFG e da FLC contra isolados clínicos de C. guilliermondii. Apenas existe um estudo anterior sobre as equinocandinas, particularmente sobre a caspofungina (CFG) na infecção disseminada por C. guilliermondii. O CFG com 1 mg/kg foi eficaz na redução da carga fúngica renal em ratinhos infectados com uma estirpe de C. guilliermondii com uma MIC de 8µg/ml, enquanto que o abate do tempo revelou que não foi atingida actividade fungicida em concentrações de 64µg / ml.4 inversamente, o nosso estudo mostrou uma actividade dependente da concentração de AFG, que a 32 µg/ml exerceu uma actividade fungicida, como anteriormente relatado,17 a 24h e 8 µg/ml. Estudos anteriores relataram concentrações de AFG no soro e rim de aproximadamente 13 µg/ml após 7 dias de tratamento com doses de 10 mg/kg.21 Aqui, AFG foi capaz de reduzir de forma modesta a carga fúngica nos rins de neutropénicos ratos infectados com uma das duas estirpes testadas, o que não parece estar relacionado com a baixa AFG MICs diferença entre as duas estirpes testadas (diluição 1), sugerindo que a resposta a AFG tratamento é de tensão dependente. Da mesma forma,a FLC também só foi capaz de reduzir ligeiramente a carga fúngica no rim dos ratinhos desafiados com uma das duas estirpes, apesar da dose administrada que atinge concentrações séricas acima dos MICs 2, o que também não foi surpreendente devido à sua actividade fungistática.em conclusão, o nosso estudo mostrou a maior actividade e eficácia do Cordeiro contra as duas estirpes de C. guilliermondii, em contraste com o fraco efeito da FLC e AFG. No entanto, devem ser realizados outros estudos com mais isolados de C. guilliermondii que representem uma gama mais vasta de CMI AFG para avaliar se existe qualquer relação entre os valores CIM e a eficácia AFG.
conflito de interesses
nenhuma declaração.
