CPZ atenua colite independentemente do TRPV1

Para desafiar o mecanismo pelo qual CPZ enemas atenuar experimental de colite, nós induzida dextran sulfato de sódio (DSS), colite em wild-type (WT) e TRPV1-deficiente ratos (cada grupo de n = 8). Embora existam relatórios conflitantes, ratos deficientes em TRPV1 desenvolveram colite DSS e perda de peso no mesmo grau que os ratos congênicos em WT em nosso laboratório, o que está em conformidade com os nossos resultados do modelo de colite TNBS que tínhamos publicado anteriormente 7,8,9,10,11,12. Para os tratamentos com enema de CPZ, foi utilizada a mesma concentração de CPZ (531 µM) que foi previamente notificada para atenuar a colite DSS (5%) em rats8. O curso da colite foi monitorado diariamente por medições de peso corporal e endoscopia. Aplicações duas vezes ao dia de enemas atenuados de colite DSS atenuados na mesma medida em ratinhos WT e TRPV1−/− ratinhos, o que se reflectiu numa melhoria da pontuação endoscópica e numa redução da perda de peso corporal (Fig. 1A-C). H&e manchas do cólon distal no final do experimento de 7 dias DSS revelou destruição da arquitetura do tecido mucoso com numerosas células imunitárias infiltradas nos colões dos controles. Esta situação contrasta fortemente com uma mucosa muito intacta e com a ausência de infiltração significativa de células imunitárias nos cólons de ratinhos tratados com CPZ de ambos os genótipos (Fig. 1D). De acordo com estes resultados, a pontuação histológica foi fortemente reduzida nos ratinhos tratados com CPZ de ambos os genótipos (Fig. 1E).a observação in vivo de que o enemas de CPZ inibiu eficazmente a colite em ratinhos mutantes nulos de TRPV1 impôs a questão aos efeitos neuronais independentes de TRPV1 da CPZ. Uma vez que o TRPA1 mostrou ser crucial em vários modelos de inflamação,incluindo colitis6,12, 14, testamos se o CPZ atua no TRPA1.os experimentos com pinça Patch foram realizados em modo grampo voltal em células HEK293t expressando células htrpa1 recombinantes (células hTRPA1-HEK293t). Num potencial de retenção de -60 mV, a CPZ (10 µM) induziu uma corrente interna que foi quase completamente inibida (inibição de 93%, n = 5) pelo antagonista selectivo TRPA1 HC-030031 (HC, 10 µM) (Fig. 2A). Em todas as células em que foi registada uma corrente interna induzida pela CPZ, carvacrol (100 µM) um agonista TRPA1 estabelecido, evocou também grandes correntes internas no mesmo potencial de retenção, demonstrando a expressão funcional de hTRPA1. Estas células hTRPA1-HEK293 também foram submetidas a rampas de tensão de -100 a +100 mV de 400 ms de duração a cada 4 s (Fig. 2B). A relação tensão-corrente induzida pela CPZ apresentava uma ligeira retificação exterior e um potencial reverso próximo de 0 mV (Fig. 2C). As correntes evocadas pela CPZ (10 µM) foram inibidas pela HC (10 µM). O efeito foi mais pronunciado a potenciais negativos (inibição de 89% ± 5% a -80 mV, média ± DP, n = 7) do que a potenciais positivos (inibição de 80% ± 9% a +80 mV).

influxo de cálcio induzido pela CPZ através da hTRPA1

a acção selectiva da CPZ sobre a TRPA1 foi confirmada através da técnica de microfluorimetria do cálcio. as células hTRPA1-HEK293 foram estimuladas por duas aplicações de CPZ (50 µM) durante 10 s a intervalos de 5 minutos (Fig. 2D). Os antagonistas selectivos HC (20 µM) e a-967079 (10 µM) foram aplicados durante 1 min antes e durante o primeiro desafio da CPZ. A resposta da CPZ foi completamente abolida por ambos os antagonistas. Vale a pena notar que a remoção de HC levou a um influxo de cálcio, provavelmente devido à ação residual da CPZ, enquanto este efeito fora ausente no caso de a-967079 que pode se separar mais lentamente (Fig. 2D). Analisamos então a concentração-dependência dos efeitos da CPZ. As concentrações crescentes de CPZ (100 nM, 500 nM, 5 µM e 50 µM) foram aplicadas às células hTRPA1-HEK293 durante 20 s cadA, em intervalos de 3 minutos. Começando com 100 nM, todas as concentrações de CPZ evocadas transitam com amplitudes cada vez maiores (Fig. 2E). Carvacrol (100 µM) foi aplicado no final do experimento para controlar a expressão funcional TRPA1, mas a resposta carvacrol após 50 µM CPZ foi visivelmente pequena, sugerindo dessensibilização cruzada. As células HEK293 não detectadas foram submetidas às mesmas aplicações de CPZ e apenas a concentração mais elevada testada (50 µM) induziu um aumento mínimo de cálcio. Nós esperávamos que a CPZ iria envolver os três resíduos críticos de cisteína no domínio N-terminal do canal porque é um composto eletrofílico. HEK293 células que expressam WT hTRPA1 e células que expressam o triplo cisteína mutante hTRPA1-3C (C621S, C641S, C665S) foram submetidos a CPZ aplicação (1 µM, 20 s), seguido pelo não-electrophilic agonista carvacrol (100 µM, 20 s) e altamente electrophilic AITC (50 µM, 30 s). A ionomicina foi aplicada no final do experimento como um controle positivo. A amplitude do transitório de cálcio evocado por uma CPZ de 1 µM foi substancialmente reduzida (>80%) nas células que expressam hTRPA1-3C em comparação com as células que expressam WT hTRPA1 (Fig. 2F), enquanto a diferença de sensibilidade da CPZ entre os genotipos foi abolida com uma concentração de CPZ de 100 µM (Fig. 2G). A resposta AITC diminuiu nas células mutantes, enquanto carvacrol evocou grandes transientes de iões de cálcio em ambos os mutantes WT e 3C. Em conjunto, estas respostas celulares indicam que a potência relativamente elevada da CPZ depende das três cisteínas críticas. No entanto, quando a concentração de CPZ é 100 vezes superior, outros locais de ligação assumem a activação do hTRPA1. Esta alta concentração da CPZ lipofílica também pode interagir com a membrana lipídica celular, ativando indiretamente TRPA1, Como anteriormente mostrado para o componente lipídico a do lipopolissacarídes16. Além disso, na presença do necrófago electrófilo N-acetil cisteína (NAC) a uma concentração saturada (15 mM) de 50 µM CPZ não foi possível obter qualquer resposta. Após a remoção da ACN, a CPZ evocou grandes transientes de cálcio nas células Htrpa1 transfectadas de HEK293t (Fig. 2H) o que confirma que a CPZ actua como agonista electrofílico do hTRPA1.

a CPZ activa uma subpopulação de neurónios de raiz dorsal sensíveis à AITC

os neurónios de DRG foram mantidos na cultura primária e investigados por microfluorimetria de cálcio. As células foram estimuladas pela CPZ (50 µM, 20 s), seguida pela AITC (100 µM, 30 s), capsaicina (CAP, 1 µM, 10 s) e KCl (60 mM, 30 s). A figura 3A ilustra exemplos de neurônios DRG respondendo a todos esses quatro estímulos. Uma fração típica de neurônios DRG foi ativada pelo AITC (301 de 906 neurônios, 33%, n = 8 ratos) indicando expressão funcional do TRPA1. Uma subpopulação desses neurônios sensíveis AITC também foi ativada pela CPZ (185 de 301 neurônios, 61%). A sensibilidade à CPZ era quase completamente restrita aos neurônios que respondiam a AITC. De um total de 200 neurônios sensíveis à CPZ, 185 (93%) também foram ativados pela AITC, indicando uma forte concordância de sensibilidades para a CPZ e AITC (Fig. 3). Tal como no caso das células HEK293 com expressão de hTRPA1, os transientes de cálcio evocados pela CPZ nos neurónios DRG foram dependentes da concentração com um valor de EC50 estimado em 30 µM CPZ e a pequena resposta da AITC após 100 µM CPZ sugeriu novamente a dessensibilização cruzada (Fig. 3B, C). A figura 3D mostra a sobreposição de CPZ, PAC e AITC-capacidade de resposta em WT DRG neurônios em determinadas concentrações: 14% dos neurônios do GRD respondeu a AITC, mas não ao PAC (125/906), 16% responderam ao PAC, mas não AITC, considerando que a CPZ induzida por cálcio transientes em 78% dos neurônios que responderam a ambos os AITC e CAP (137 176). Para demonstrar a especificidade dos efeitos observados, os neurônios TRPV1−/− e TRPA1−/− DRG foram expostos ao protocolo acima. Cerca de 90% dos neurónios DRG deficientes em TRPV1 que eram sensíveis ao AITC também responderam ao CPZ (509/572 células), enquanto nenhum dos neurónios DRG deficientes em 448 TRPA1 testados mostrou influxo de cálcio em resposta ao CPZ (100 µM), como ilustrado por exemplos representativos na Fig. 3E, F.

Sistêmica dessensibilização através TRPA1 atenua a dor

Depois que descobriram que a CPZ é um potente TRPA1 agonista, entendemos por que o primeiro CPZ enemas (duas vezes ao dia) foram, obviamente, dolorosa na camundongos WT. Em seguida, quantificamos o comportamento nocifensor induzido pelo enema em animais saudáveis (cada n = 6) contando as reações de contração e registrando respostas de reflexo visceromotor (VMRs) através da eletromiografia integrada (EMG) da parede muscular abdominal (Fig. 4A, B). Durante o curso de repetição dos tratamentos de CPZ duas vezes por dia, notamos que os knockouts TRPA1 não mostraram comportamento relacionado com a dor em qualquer momento. Além disso, os ratos WT apresentaram uma diminuição progressiva das respostas inicialmente fortes à dor, com um declínio acentuado em torno do dia 3, o que levou a uma dessensibilização completa em ambos os parâmetros. Esta perda da percepção da dor colónica em ratinhos normais aumentou a expectativa de que o enemas possa ter fornecido ao CPZ uma quantidade farmacodinâmica suficiente para induzir hipoalgesia sistémica. Para testar esta hipótese, empregamos o teste de limpeza ocular usando AITC (100 µM) e tampa (1 mM) (Fig. 4C, D) (n = 6). Ambos os testes mostraram uma atenuação distinta da contagem de toalhetes oculares nos ratos WT que tinham sido tratados com enemas CPZ (até 12-16 h antes do teste). Estes efeitos foram mais provavelmente mediados pela dessensibilização TRPA1 do que pelo bloco TRPV1, uma vez que ratos deficientes em TRPV1 eram insensíveis à instilação de óleo de mostarda (AITC, 100 µM) no olho com o mesmo grau que ratos WT (Fig. 4C). Vice-versa, o enemas CPZ foi ineficaz em ratinhos TRPA1−/−, quando estes ratinhos foram desafiados por estilhaços de CAP no olho (Fig. 4D).

Uma vez que os enemas repetidos são uma via de administração desagradável, testámos um possível efeito anti-nociceptivo da CPZ peroral (531 µM) na água de beber. O regime de bebida durante 10 dias foi bem tolerado sem que ocorressem efeitos adversos óbvios. Durante a administração oral contínua de CPZ, a latência de paw-withdrawal à estimulação térmica radiante (método Hargreaves) aumentou progressivamente em ambas as patas (Fig. 4E). O tempo de tolerância foi cerca do dobro no dia 7 e permaneceu significativamente elevado desde o dia 2 até ao dia 10. Após 2 semanas de recuperação com água potável pura, as latências de retirada voltaram ao nível de base. A resposta mecânica à estimulação com a força linearmente crescente de um filamento electrodinâmico de von Frey não foi significativamente afetada durante os dez dias de ingestão de CPZ(Fig. 4F). Levantou-se a questão de saber se o calor e a hipoalgésia química representavam um efeito de classe de agonistas dessensibilizantes TRPA1 ou se era específico para a CPZ. Assim, administrámos AITC numa concentração semelhante e bem tolerada (500 µM) através da água de beber. O mesmo regime posológico para a AITC descrito para a CPZ resultou num aumento progressivo da latência de retirada das patas para estimulação térmica radiante que foi significativamente menor do que o induzido pela CPZ (Fig. 4E). A capacidade de resposta mecânica não foi alterada sob o regime de ingestão de AITC(Fig. 4F).

CPZ causa a dessensibilização sustentada de neurônios sensoriais peptidergicos de TRPA1/TRPV1 expressando neurônios sensoriais peptidergicos

então perguntamos se a dessensibilização de animais inteiros pela CPZ poderia ser reproduzida a nível celular. Para este efeito, realizámos experiências de imagiologia do cálcio com neurónios DRG isolados que tinham sido obtidos a partir de ratinhos de controlo e de animais tratados durante 7 dias, duas vezes por dia, com enemas CPZ. Estes neurônios foram necessariamente mantidos em cultura por 16 a 24 horas, na presença de NGF. Um total de 399 neurónios de ratinhos de controlo e 584 neurónios de ratinhos tratados com enema foram carregados com Fura-2 e transientes de cálcio evocados por AITC, carvacrol, CAP e uma solução rica em KCl foram registados. As respostas a estes agonistas TRPA1 (AITC e carvacrol) e TRPV1 (CAP) não foram significativamente diferentes nos neurónios DRG dos animais de controlo e dos animais tratados com enema (Fig. S1). No entanto, a expressão de mRNA TRPA1 (qPCR) foi cerca de duas vezes aumentada em DRG lumbosacral preparado imediatamente após o enema final da CPZ (Fig. S2) enquanto que não foi detectada alteração na expressão TRPA1 quando decorreram 24 h in vivo após o Clister final. O mRNA TRPV1 não se alterou em ambas as circunstâncias. Assim, a regulação transcripcional da expressão do gene TRPA1 teve lugar, devido aos múltiplos enemas da CPZ, mas foi rapidamente revertida quando a oferta da CPZ foi descontinuada. Em condições de cultura DRG, a mesma reversão epigenética provavelmente ocorreu e todo o CPZ residual foi provavelmente lavado, de modo que nenhuma dessensibilização residual poderia ser realmente esperado. Como os modelos celulares não refletiam a dessensibilização in vivo induzida pelo CPZ, procurávamos outro forte indicador do surpreendente efeito sistêmico. A maioria dos neurónios nociceptivos é peptidergico, expressando predominantemente peptídergico relacionado com o gene da calcitonina (CGRP) e a substância P (SP)15,17. Após a despolarização, como por KCL e influxo de cálcio, devido à ativação de canais de cálcio voltados para a tensão, estes neuropeptídeos são liberados das fibras nervosas em uma função quasi-eferente (inflamação neurogênica). Por outro lado, os canais TRP activados são muito bons condutores de cálcio por si só e não necessitam de suporte por quaisquer canais de sódio ou cálcio alimentados por voltagem, a fim de evocar exocitose vesiculosa do CGRP18. Assim, a libertação estimulada de CGRP pode servir como um índice de ativação nociceptor (peptidergic). Da mesma forma,neuropeptídeos vasoativos têm vários efeitos sobre o processo de inflamação per se e depleção ou dessensibilização da população de neurônios sensoriais peptidergicos tem sido mostrado para atenuar as colitis19,20, 21. Para determinar se a CPZ (531 µM) enemas dessensibiliza através da TRPA1, local e sistemicamente, empregamos colonatos isolados de ratos e preparações de pele. Os cólons de ratos saudáveis C57BL/6 (n = 8) foram expostos a CPZ (100 µM) o que induziu uma libertação massiva de CGRP (Fig. 5); aplicações subsequentes de AITC (100 µM) 5 min ou 15 min após a CPZ (Fig. 5A, B) não poderia mais induzir a libertação de CGRP, sugerindo uma profunda dessensibilização funcional cruzada ao agonista TRPA1. Este efeito não pode ser devido à depleção, uma vez que a resposta KCL (60 mM) subsequente foi normal. Os cólons de ratinhos que foram repetidamente tratados com enemas de CPZ (531 µM) in vivo, duas vezes por dia durante 7 d, foram isolados e testados 12-16 h após o último Clister. Nem a CPZ (100 µM) nem AITC (100 µM) induziram qualquer libertação de CGRP nesta condição (Fig. 5C, D); notavelmente, a libertação de CGRP induzida por CAP (30 nM) foi fortemente reduzida, mas não abolida (Fig. 5E). Em contraste, a liberação de CGRP induzida por KCL (60 mM) por despolarização inespecífica não foi apenas não reduzida, mas realmente melhorada após o enemas CPZ. Isto indica que as fibras do nervo colônico não foram esgotadas de CGRP, mas sim sobrelotadas, mas essencialmente dessensibilizadas de forma sustentada para a ativação química através de TRPA1, bem como TRPV1 (n = 6). Finalmente, também a preparação da pele, isolada 12-16 h após o último enema da CPZ, mostrou que a libertação de CGRP induzida pela AITC (100 µM) e CAP (1 µM) foi fortemente reduzida de acordo com a dessensibilização de todo o corpo observada nos testes comportamentais (Fig. 5F, G, ver Fig. 4A-F) (n = 6).