Abstract
transcrição do VIH-1 é regulada pelo CDK9 / cyclin T1, que, ao contrário de uma típica cinase dependente do ciclo celular, é regulada pela associação com o complexo de proteínas ribonucleares de 7SK (snRNP). Enquanto os componentes proteicos deste complexo são bem estudados, o mecanismo da formação complexa ainda não é totalmente compreendido. A associação CDK9/cyclin T1 com a 7SK snRNP é, em parte, regulada por uma fosforilação cdk9 reversível. Aqui, apresentamos uma revisão abrangente das cinases e fosfatases envolvidas na fosforilação CDK9 e discutimos o seu papel na regulação da replicação do HIV-1 e o potencial para ser direcionado para o desenvolvimento de drogas. Propomos uma nova via de regulação da transcrição do VIH-1 através da fosforilação CDK9 Ser-90 pela CDK2 e CDK9 ser-175 pela desforilação da proteína fosfatase-1.
1. Introdução a erradicação completa da infecção pelo VIH-1 requer novas abordagens para induzir o vírus VIH-1 integrado, que não é afectado pelos medicamentos anti-retrovirais existentes e que se recupera após o fim da terapêutica anti-retroviral . A latência do HIV-1 pode ser um resultado de vários fatores, tais como deficiência de proteína do ativador transcritional do HIV-1 (Tat) ou ativadores de transcrição celular, interferência transcritional com promotores celulares, local de integração desfavorável, epigenética, e provavelmente outros fatores . Assim, uma melhor compreensão dos mecanismos de activação da transcrição do VIH-1 é importante para a concepção de novos terapeutas destinados à indução, bem como à inibição da transcrição do VIH-1. Aqui, podemos analisar as cinases e fosfatases envolvidos na ativação de CDK9/cyclin T1 e discutir como essas enzimas podem ser potencialmente usados para inibir ou ativar o HIV-1, para o desenvolvimento de futuras intervenções terapêuticas para o tratamento de HIV-1 de infecções.2. A ativação do HIV-1 Transcrição por P-TEFb
HIV-1 transcrição é ativado pelo HIV-1 Tat proteína que se liga ao bojo de ALCATRÃO de RNA, um grampo de cabelo-estrutura de loop localizado no 5′-fim de todas as nascentes do HIV-1 transcrições, e recrutas CDK9/cyclin T1, um componente positivo da transcrição do fator de alongamento b (P-TEFb) para o HIV-1 promotor (revista em detalhe ; veja também a ilustração na Figura 1). Durante o início da transcrição, os fosforilatos ser-5 associados a TFIIIH/cyclin H na sequência heptapeptídica 1YSPTSPS7 repetida 52 vezes no domínio C-terminal (CTD) do RNAPII . O RNAPII fosforilado Ser-5 acumula-se em 20-40 nucleótidos (nt) A Jusante do local de início da transcrição, em parte devido às ações do complexo de fator de elongação de ação negativa, o NELF, e o complexo de indução de sensibilidade DRB, o DSIF . Recentemente, o CDK7 associado ao TFIIIH mostrou fosforilar também resíduos de CTD Ser-7, que podem primar a fosforilação do Ser – 2 pelo P-TEFb . O recrutamento de P-TEFb para o promotor do VIH-1 localizado na região U3-R-U5 do LTR de 5′ é facilitado pela Tat, que visa o CDK9/cyclin T1 para o ARN do alcatrão, onde o ciclo T1 se liga ao ciclo rico em G de ARN do alcatrão . O recrutamento de CDK9 / cyclin T1 promove o alongamento da transcrição pelo RNA polimerase II (RNAPII), que de outra forma está em pausa após a síntese do RNA TAR . O lançamento do RNAPII da pausa por P-tefb complex é acompanhado por mRNA capping e perda de NELF . O P-TEFb desencadeia o alongamento da transcrição da ARN polimerase II (RNAPII) por fosforilação do factor de Elongação negativo (NELF) e do complexo indutor da sensibilidade ao DRB (DSIF/Spt4/Spt5), promovendo assim a libertação de resíduos de ser-2 de NELF e de ser-2 fosforilantes no RNAPII CTD (revisto em ). Após a dissociação de NELF, DSIF torna-se um fator de alongamento positivo e aumentou a processividade RNAPII . Embora P-TEFb viaja com o complexo de alongamento, sua atividade cinase CTD não é mais necessária uma vez que o complexo é liberado da pausa .
representação Esquemática do HIV-1 de transcrição regulamento por CDK9 fosforilação e dephosphorylation. A figura mostra uma rede de fatores de células hospedeiras que interagem Tat que afetam a fosforilação CDK9. As setas indicam fosforilação (Violeta), desfosforilação (laranja), e transição de complexo P-TEF e complexos de transcrição (preto). Fosforilatos CDK2 CDK9 Ser-90. Os quelantes do ferro reduzem a actividade celular do CDK2/ciclina e inibem a transcrição do VIH-1 (indicada pela linha vermelha). Fosforilatos CDK7 Cdk9 Thr-186. A desphosphorilação do Thr-186 por PPM1A ou PP1 facilita a dissociação do CDK9/cyclin T1 do grande complexo P-TEFb e o Recrutamento do CDK9 / cyclin T1 por Tat ou BRD4. O BRD4 liga-se preferencialmente ao CDK9 Ser-175-fosforilado. Desphosphorylation Of Ser-175 by PP1 activates CDK9 kinase activity and activates HIV-1 transcription. O recrutamento de CDK9 / cyclin T1 pela Tat para ARN do alcatrão leva à fosforilação da NELF, que dissocia e também à fosforilação dos resíduos de ser-2 da DSIF e da RNAPII CTD, o que é facilitado pela fosforilação da CTD Ser-7. CDK7 como parte dos fosforilatos TFII CTD Ser-5 e possivelmente dos resíduos Ser-7. CDK7 também fosforilatos CDK9 Thr-186 e mantém a fosforilação CDK9 Thr-186 durante o alongamento da transcrição.
devido à importância do P-TEFb, a regulação deve ser mantida para assegurar a função adequada. A fosforilação e a desphoforilação de locais específicos em CDK9 devem ocorrer durante todo o processo de transcrição e devem ser rigorosamente controladas. Esta revisão centra-se na regulação do CDK9 através de alterações à fosforilação.
3. A composição do P-TEFb e seu papel na ativação da transcrição do HIV-1
P-TEFb é um heterodímero composto pela cinase 9 (CDK9) e uma das ciclinas do tipo C T1, T2a, ou T2b, da qual o cyclin T1 é o parceiro mais abundante . Cyclin K, que foi originalmente pensado para ser um cyclin menor do CDK9, é agora reconhecido como um parceiro de cyclin para CDK12 e CDK13 . Apenas a proteína ciclina T1 forma eficientemente um complexo com Tat VIH-1 ligado ao ARN do alcatrão . Isto deve-se à presença de um resíduo de cisteína na cyclin T1 na posição 261, em vez de uma asparagina encontrada nas proteínas cyclin T2a e T2b. Cyclin T1 with mutated Cys-261 binds to Tat but is unable to recruit Tat to TAR RNA. A interacção da Tat com o ARN do alcatrão e a ciclina T1 é dependente dos iões de zinco, o que requer novamente a presença de Cys-261 .existem duas isoformas funcionais de CDK9: uma forma de 42 kDa predominantemente expressa em baço, timo e testis e uma forma de 55 kDa que é expressa em vários tecidos, mas em níveis significativamente mais baixos que é a isoforma de 42 Kd . Todas as ciclinas associam-se a ambas as isoformas do CDK9 e exibem actividade cinase em direcção ao CTD em RNAPII . Cerca de metade do P-TEFb encontra-se num complexo inactivo de grande dimensão ligado a 7SK snRNA e a várias proteínas adicionais , incluindo a proteína 1 indutível de hexametileno-bisacetamida (HEXIM1), a proteína LARP7 relacionada com a La e a enzima mepce da metilfosfatase . A forma de massa molecular mais baixa do P-TEFb consiste em CDK9 e cyclin T1 e é enzimaticamente activa . A elevada massa molecular P-TEFb é inactiva devido à HEXIM1 que introduz a sua sequência inibitória de PYNT no local activo do CDK9 .
O complexo de elevada massa molecular P-TEFb serve como fonte de CDK9/cyclin T1 para o recrutamento por Tat HIV-1 . Nas células induzidas pelo stress, o complexo CDK9/cyclin T1 dissocia-se da proteína 7 SK RNA/HEXIM1 e liga-se então à BRD4 e forma um pequeno complexo transcripcionalmente activo que é recrutado para vários promotores celulares . Apesar da inatividade do grande complexo P-TEFb in vitro, o grande complexo, e não o pequeno complexo, é importante para a ativação da transcrição do HIV-1 como HIV-1. A Tat compete com a HEXIM1 pela ligação à cyclin T1 promovendo a dissociação de P-TEFb do grande complexo . A proteína Tat VIH-1 também demonstrou recrutar grande complexo P-TEFb para o promotor VIH-1, onde o ARN do alcatrão foi capaz de deslocar 7 ARN SK e activar o P-TEFb .
Tat também facilita a formação de super complexo de Elongação (SEC) contendo p-TEFb ativo e fatores de Elongação adicionais e coativadores de transcrição . Estes factores incluem AF4, ENL, AF9 e elongation factor ELL2 . A proteína AFF4 emerge como o andaime central que recruta outros fatores através de interações diretas. AFF4 binds cyclin T1, ELL2, and ENL or AF9 acting as a bridge that links this complex to P-TEFb . Através das funções de ligação de Tat e AFF4, P-TEFb e ELL2 se combinam para formar um complexo de Elongação bifuncional que ativa grandemente a transcrição do HIV-1 . Sem Tat, AFF4 pode mediar a interação ELL2-P-TEFb, embora ineficiente. Tat supera esta limitação trazendo mais ELL2 para P-TEFb e estabilizando ELL2 em um processo que requer p-TEFb ativo .4. A fosforilação CDK9
a actividade de P-TEFb depende da fosforilação de vários resíduos de serina e de treonina e discutiremos isto a seguir e que são apresentados no modelo CDK9/cyclin T1/Tat na Figura 2.
Estrutura de CDK9/cyclin T1/Tat complexo (modelo com base no PDB 3MIA). A representação da coluna vertebral dos resíduos CDK9 presentes na estrutura original do PDB é mostrada em cor verde, cyclin T1—in violet, e Tat—in red. É indicada a posição do aglomerado ser/Thr-29, Ser-175, Thr-186 e C-terminal. Também são mostrados locais de ligação ATP e íons Zn que facilitam a interação Tat-ciclin T1.
4.1. A fosforilação C-Terminal CDK9
um conjunto de resíduos C-terminal CDK9 (Ser-347, Ser-353 e Ser-357; Thr-350 e Thr-354) é autofosforilada e esta fosforilação é importante para a ligação do CDK9/cyclin T1 ao ARN TAR . Isto foi evidenciado pela incapacidade do C-cdk9 enzimaticamente activo para ligar o ARN TAR . O CDK9 recombinante / ciclin T1 que foi autofosforilado in vitro foi eficientemente desphorilado pela proteína fosfatase 2A (PP2A), mas não pela proteína fosfatase-1 (PP1) . Também o tratamento com PP2A impediu a ligação in vitro do CDK9/cyclin T1 ao Tat e ao ARN do alcatrão . Estas observações sugerem que o PP2A pode atingir o C-terminus do CDK9 e controlar potencialmente a interacção do P-TEFb com o ARN do alcatrão. A autofosforilação do CDK9 associada ao complexo de pré-iniciação in vitro foi inibida pela TFIIH . Mais tarde, o PP2A foi considerado essencial para a transcrição basal do VIH-1 in vitro, uma vez que a depleção do PP2A inibiu a transcrição basal do VIH-1 e a adição do PP2A aos extractos empobrecidos restaurou a transcrição . O alvo PP2A foi considerado Thr-29 (ver abaixo), mas isso não foi provado com certeza e o efeito não foi reproduzido in vivo. Num estudo inicial, observou-se uma indução ligeira da transcrição VIH-1 basal, mas não induzida pela Tat, por baixas concentrações inibitórias de PP2A do ácido okadaico . Também observámos a indução da transcrição basal e não da transcrição activada pelo Tat para o VIH-1 com a sobre-expressão da proteína LIS1 que descobrimos se ligar e inibir a PP2A in vitro e interagir com a proteína Tat do VIH-1 . Colectivamente, estes estudos indicam que a PP2A pode regular a transcrição basal do VIH-1 e também controlar a interacção do P-TEFb com o ARN TAR por desphosphorilação do C-terminus do CDK9.
4.2. A fosforilação N-Terminal de Thr-29
fosforilação de thr-29 do CDK9 demonstrou ser induzida pela proteína fiscal HTLV-1 . CDK9 / cyclin T1 é recrutado para cromatizado HIV-1 LTR e outros promotores pela BRD4 . Este recrutamento da BRD4 foi ligado à fosforilação do CDK9 Thr-29 e à exigência de desphoforilação PP2A pelo grupo de John Brady . No entanto, o grupo de Qiang Zhou relatou que o CDK9 é necessário para ser fosforilado no Ser-175 para se ligar ao BRD4 , o que foi recentemente confirmado pelo grupo de Jonathan Karn (ver discussão detalhada abaixo). O Thr-29 do CDK9 é homólogo ao Thr-15 no CDK2, no qual a fosforilação inibe a actividade do CDK2 . De facto, a fosforilação do Thr-29 demonstrou inibir a actividade do CDK9 e a transcrição do VIH-1 . No entanto, não conseguimos detectar CDK9 Thr-29 de fosforilação em células tratadas com ácido ocadaico que inibiu tanto PP2A e PP1 usando uma combinação de Caçador 2D fina camada de electroforese de alta resolução de espectrometria de massa, que apenas mostrou a fosforilação de resíduos de C-terminal de Ser/Thr cluster e Ser-175, de que apenas o Ser-175 fosforilação foi induzida por ácido ocadaico . Assim, a fosforilação CDK9 Thr-29 pode não ser controlada pela PP2A e necessita de ser validada para clarificar o seu papel durante a transcrição do VIH-1.
4. 3. A fosforilação do ciclo T-186 do CDK9
o ciclo T CDK9 contém vários locais de fosforilação, incluindo o Ser-175 E o Thr-186 (Figura 2). A fosforilação do Thr-186 conservado é necessária para a actividade enzimática do CDK9 . Também a associação de CDK9 / cyclin T1 com 7SK RNA snRNP requer a fosforilação THR-186 do CDK9 . Em CDKs, a fosforilação do laço-T desencadeia grandes mudanças conformacionais que abrem o bolso de ligação ATP e um site de ligação de substrato fazendo CDKs totalmente ativos como uma cinase .recentemente, a análise química-genética utilizando a inibição química selectiva do CDK7 demonstrou ser a única responsável pela fosforilação CDK9 Thr-186 e pela fosforilação CTD dependente do P-TEFb e pela ubiquitilação histona H2B in vivo . Assim, CDK7/cyclin H, o que foi previamente identificado como CDK-activating kinase (CAK) para as CDKs envolvidas no ciclo celular, tais como CDK1, 2, e 4 também funciona como CAK para CDKs envolvidos na regulação da transcrição que incluem CDK8, 9, 12, e 13 (revisados ). A análise Global das quinases que podem fosforilar o ciclo-T CDK9 utilizando siRNA identificou a CA(2+)/a quinase dependente de calmodulina 1D (CaMK1D) neutralizada pelo siRNA diminuiu a fosforilação Thr-186 . Consequentemente, a pequena inibição molecular da via sinalizadora Ca(2+) diminuiu a fosforilação Thr-186 e inibiu a transcrição VIH-1 induzida pela Tat, mas não a transcrição HTLV-1 mediada por impostos . Uma vez que a transcrição mediada por impostos é impulsionada por P-TEFb, continua a ser investigada a razão pela qual apenas a transcrição do VIH-1 foi afectada.a fosforilação pode também ser controlada pelas fosfatases celulares. Nossos estudos na última década focaram em PP1 que inicialmente observamos para estimular a transcrição dependente de Tat do HIV-1 in vitro . Quando nós sobreexpressed uma das subunidades reguladoras nucleares principais de PP1, NIPP1 (inibidor nuclear de PP1), nós observamos a inibição PP1-específica da transcrição do HIV-1 e replicação viral . Notamos que a Tat contém uma sequência semelhante a um motivo rvxf de ligação PP1 conservado e mostrou que este motivo mediou a ligação Tat à PP1 in vitro e in vivo e que a mutação de resíduos no motivo de ligação PP1 (V36A e F38A) impediu a Tat de induzir a transcrição VIH-1 . CDK9 que foi fosforilada em células cultivadas misturados com (32P)orthophosphate e tratados com ácido ocadaico foi eficiente dephophosphorylated in vitro por PP1, mas não PP2A em contraste com a in vitro autophosphorylated CDK9 que foi dephosphorylated por PP2A e não por PP1 . Estes resultados sugerem que a PP1 pode controlar a fosforilação CDK9 durante a transcrição do VIH-1. Com efeito, demonstrou-se que a subunidade catalítica alfa de PP1, PP1a, actua de forma cooperativa e sequencial com (Ca2+)-calmodulina-proteína fosfatase 2B (PP2B) em células tratadas com UV irradiadas ou com hexametileno bisacetamida (HMBA) nas quais o P-TEFb é libertado do complexo 7SK snRNP . Enquanto PP2B induz uma mudança conformacional em 7SK snRNP, PP1a dephosphorylates CDK9 Thr-186 e facilita a libertação de P-TEFb a partir de 7SK snRNP . O CDK9 permaneceu desphosphorilado enquanto associado ao BRD4 e foi recrutado para o complexo de pré-iniciação, onde pode ser reativado pelo CDK7 associado ao TFIIIH. De acordo com este estudo, observou-se um aumento da fosforilação CDK9 Thr-186 nas células que expressaram estavelmente um peptídeo inibitório PP1, o domínio central de NIPP1, e também observou-se um aumento da Associação de CDK9/cyclin T1 com ARN 7SK . A expressão estável do cdNIPP1 interrompeu a interação entre Tat e PP1 e inibiu a transcrição do HIV-1, sugerindo que um equilíbrio precisa ser mantido entre a fosforilação e a desphorilação do Cdk9 Thr-186 e que a mudança deste equilíbrio para a fosforilação é inibitória para a transcrição do HIV-1. Expressão do cdNIPP1 de forma fisiologicamente relevante como parte do genoma do VIH – 1 em vez da replicação do VIH-1 inibida potentemente , sugerindo ainda que os inibidores visados pelo PP1 podem ser usados como potencial terapêutica anti-VIH-1. Enquanto o PP1 é um candidato para a desfosforilação Thr-186, nós também descobrimos que ele desphosphorylates CDK9 Ser-175 (ver abaixo). Um CDK9 Thr-186 fosfatase, proteína dependente de magnésio fosfatase 1A (anteriormente 2C) (PPM1A) foi identificado usando uma biblioteca de expressão de fosfatase e anticorpos Thr-186-fosfospecíficos . A sobreexpressão PPM1A diminuiu a fosforilação Thr-186 e a depleção mediada por siRNA aumentou-a, E P-TEFb e PPM1A também coprecipitaram juntos sugerindo que o CDK9 pode ser um substrato fisiológico para o PPM1A . Um estudo mais recente mostrou que a fosforilação de Thr-186 do CDK9 é diminuída nas células T CD4(+) em repouso, que não são permissivas para a replicação do VIH-1 e que esta diminuição está correlacionada com a abundância de PPM1A e o recrutamento limitado de CDK9 para o grande complexo P-TEFb . Este achado ainda suporta a necessidade do grande complexo para a transcrição do HIV-1 e o papel crítico do PPM1A na supressão do HIV-1 nas células T em repouso. Uma vez que a expressão PPM1A não foi alterada aquando da activação das células T , podem estar envolvidos factores regulamentares desconhecidos na regulação da actividade PPM1A.
4. 4. Uma vez que CDK9/cyclin T1 dissocia-se do grande complexo P-TEFb, CDK9 pode tornar-se fosforilado no Ser-175. Embora a dephosphorilação Thr-186 tenha inibido totalmente a actividade da cinase CDK9/cyclin T1, não se detectou qualquer diferença nas actividades da cinase dos mutantes CDK9 S175A e CDK9 s175d por David Price e colegas . Em contraste, Qiang Zhou e o seu grupo mostraram que o mutante CDK9 s175a estava inactivo, enquanto o mutante CDK9 s175d estava activo como kinase . Eles também mostraram que a fosforilação Ser-175 promove a ligação de CDK9/cyclin T1 a Brd4 . Foi sugerido que a fosforilação do Ser-175 pode causar uma alteração conformacional no CDK9, permitindo que o BRD4 se ligue ao cyclin T1 . Em nosso estudo recente, descobrimos que a inibição dinâmica do PP1 levou à fosforilação exclusiva do CDK9 Ser-175, determinado por uma combinação de mapeamento do peptídeo 2D Hunter e análise LC-MS in vivo . A inibição da PP1 conduziu à inibição da actividade CDK9 e à redução da fosforilação RNAPII in vitro e in vivo . Descobrimos que o mutante CDK9 S175A era enzimaticamente activo e induzido pela transcrição do VIH-1 . Curiosamente, enquanto o mutante CDK9 S175D era menos ativo como a cinase, ele mais rapidamente formou um pequeno complexo P-TEFb especialmente quando a PP1 foi inibida. Assim, concluímos que o PP1 activa a transcrição do VIH-1 por resíduos de CDK9 Ser-175 desfosforilantes. Também notamos que a atividade de fosforilação Ser-175 era muito mais abundante do que a atividade Thr-186 em extratos celulares sugerindo que a atividade CDK9 pode ser naturalmente suprimida através da sobrefosforilação do Ser-175. Um estudo recente do grupo de Jonathan Karn mostrou que a ativação das células T através do receptor de células T (TCR) ou éster de fobol (PMA) sinalizando fortemente induzida fosforilação do CDK9 Ser-175 . Com base na modelagem molecular, propuseram que o ser-175 fosforilado formasse uma ligação de hidrogênio com o Tat Lys-14 fortalecendo a ligação do Tat ao CDK9/cyclin T1 e promovendo a ativação da transcrição do HIV-1 . Também de acordo com as primeiras observações, a mutação CDK9 S175A foi encontrada para abolir a ligação ao BRD4 . Além disso, de acordo com as nossas observações, o mutante CDK9 S175A foi encontrado para induzir grandemente a reactivação latente do VIH-1 dependente da Tat, que Jonathan Karn e os seus colegas atribuíram à incapacidade deste mutante de ligar a BRD4 enquanto era capaz de se ligar à Tat . Eles também descobriram que o CDK9 fosforilado no Ser-175 é excluído do complexo 7SK RNP , o que é paralelo à nossa observação anterior de que o mutante fosfomimético CDK9 S175D foi encontrado em pequeno complexo P-TEFb . Assim, este último estudo aponta para o Ser-175 como um alvo importante para a reativação do HIV-1 e potencial desenvolvimento de pequenas moléculas terapêuticas.
We recently developed PP1-targeted small molecules that were modeled to fit the RVxF-accommodating cavity on PP1 . Nós rastreamos virtualmente cerca de 300.000 compostos e, em seguida, fisicamente rastreamos cerca de 1000 compostos e identificamos um composto hit, 1H4, que inibiu a transcrição e replicação do HIV-1 em concentrações não citotóxicas . 1H4 preveniu a desphoforilação mediada pelo PP1 de um péptido substrato contendo uma sequência RVxF in vitro, interrompeu a associação do PP1 com Tat em células cultivadas e impediu a translocação do PP1 para o núcleo . Estamos atualmente em processo de refinação do composto hit e também desenvolvendo compostos PP1-direcionados para a ativação do vírus latente.
4, 5. A fosforilação ser-90 do CDK9
We e outros mostraram anteriormente que a transcrição do VIH-1 é activada pela Tat na fase G1, mas não na fase G2 . Assim, hipotetizamos que a Tat poderia envolver uma cinase regulatória do ciclo celular, que mostramos ser CDK2/cyclin E. O VIH-1 é inibido nas células knockdown CDK2 e também na diferenciação dos macrófagos em relação às células estaminais pluripotentes induzidas com knockdown CDK2 , sugerindo ainda que o CDK2 é importante para a transcrição e replicação do VIH-1. A ligação funcional entre o CDK2 e o CDK9 foi encontrada quando analisámos a inibição do VIH-1 pelos quelantes do ferro. A transcrição do VIH-1 foi inibida nas células T tratadas com quelantes de ferro 311 e ICL670, que também inibiram a actividade celular de CDK2 e CDK9 . Os quelantes de ferro mais potentes à base de tridentato de di-2-piridilcetona, inibiram a transcrição do VIH-1 e a replicação do vírus em concentrações muito inferiores às de 311 ou ILC670 e também inibiram a actividade CDK2 e CDK9 . Embora o mecanismo de inibição do CDK2 ainda não esteja clarificado, é provável que inclua a indução do p21 através do aumento do factor 1 induzido pela hipoxia (HIF-1), uma vez que a depleção do ferro remove o ferro da prolil-hidroxilase e aumenta os níveis das proteínas HIF-1 e HIF-2, imitando o efeito da hipoxia . Analisamos a fosforilação CDK9 pela CDK2 in vitro e identificamos um motivo (90SPYNR94) que representou um consenso no local de fosforilação CDK2 e que foi eficientemente fosforilado . A fosforilação do CDK9 no Ser-90 foi detectada com anticorpos fosfospecíficos, tendo sido reduzida após a queda do CDK2. A associação mutante CDK9 S90A com o grande complexo P-TEFb foi reduzida e a sua sobre-expressão inibiu a transcrição do VIH-1. Em contraste, o mutante CDK9 S90D mostrou associação inalterada com complexos P-TEFb grandes e pequenos e induziu transcrição VIH-1 dependente da Tat. No entanto, o S90 fosfomimético mostrou uma diminuição global na expressão CDK9 sugerindo que um equilíbrio de fosforilação/dephosforilação deve ser mantido para formar os complexos P-TEFb grandes e pequenos. A modelagem Molecular mostrou que o Ser-90 do CDK9 estava localizado em um loop flexível exposto ao solvente, sugerindo que ele poderia estar passando por fosforilação (também visto na Figura 2). Assim, os nossos estudos recentes identificaram um novo local de fosforilação regulamentar no CDK9 que pode ser alvo de activação ou inibição da transcrição do VIH-1.
5. A conclusão
fosforilação e desphoforilação de locais específicos em CDK9 ocorre durante todo o processo de transcrição e deve ser rigorosamente controlada. Modificações em determinados resíduos de treonina / serina determinam se o CDK9 associa-se ao grande complexo P-TEFb para se tornar disponível para o recrutamento e se a dissociação do grande complexo ocorrerá de forma eficiente. A fosforilação de Thr-186 no laço T de CDK9 e Ser-90, que se encontra fora do laço T, determina se o CDK9 permanece sequestrado no complexo inactivo de grande dimensão e também se a cinase é enzimaticamente ativa uma vez dissociada do 7SK snRNP. A desfosforilação em qualquer um destes locais conduz à desestabilização do grande complexo e à libertação do CDK9/Cyclin T1, restringindo assim o recrutamento de Tat ao VIH-1 LTR. Modificações no C-terminus do CDK9 permitem a ligação do ciclin T1: a ligação do TAR e a desphoforilação nestes locais impedem a ligação do ARN toTAR. Em contrapartida, a fosforilação nos resíduos de Thr-29 ou Ser-175 inibe o CDK9. Assim, a imagem emergente da regulação CDK9 através da fosforilação parece ser complexa e, em parte, paralela ao que é conhecido por outros CDKs. As cinases CDK9, CDK7, CDK2, e fosfatases, PP1, e PPM1A, recentemente identificadas, irão provavelmente surgir como novos alvos para a terapêutica anti-VIH-1 e contra o cancro.
conflito de interesses
os autores declaram que não há conflito de interesses em relação à publicação deste artigo.este projeto foi apoiado pelo District of Columbia Developmental Center for AIDS Research (P30AI087714), RCMI-NIH 2G12RR003048 from the Research Centers in Minority Institutions (RCMI) Program (Division of Research Infrastructure, National Center for Research Resources, NIH), Russian Foundation for Basic Research (no. 12-04-9144-NIZ) e Russian Ministry of Education and Science (no. 2012-1.5-12-000-1001-030). Os autores também gostariam de agradecer aos membros do Laboratório Nekhai por sugestões e pedir desculpas por aqueles cujo trabalho não foi citado devido à falta de espaço.
