Preparação de componentes de proteína para reconstituição

os Componentes das E. coli tradução aparelhos, incluindo fatores de conversão e aaRS, foram preparados como anteriormente described46. A preparação dos componentes RNaseP, ARN M1 e proteína C5 também foram preparados como descrito anteriormente 29. Modificámos o Protocolo para a proteína C5, precipitando-a com 80% de sulfato de amónio saturado, e dissolvendo-a por dialisação contra tampão A (pH 6,5 mM de acetato de sódio, EDTA 5 mM, NaCl 0.25 M E 2-mercaptoetanol 7 mM). O precipitado resultante foi recuperado por centrifugação e dissolvido por dialisação contra o tampão B com 50 mM de HEPES-KOH pH 7,6, 100 mM NH4Cl, 6 M ureia e 10 mM de ditiotreitol (DTT). Dissolvidas as proteínas foram aplicadas sobre um 5 mL HiTrap SP PS coluna (#17115101, a GE Healthcare, EUA), lavadas com tampão B com 7 mM 2-mercaptoethanol como um substituto para 10 mM DTT, e eluídas com um gradiente linear a partir de 100 mM a 2 M de NH4Cl em tampão B. Frações contendo C5 proteínas foram analisadas por SDS-PAGE, recuperado, dialyzed contra buffer D (50 mM de HEPES-KOH pH 7.6, 0,8 M NH4Cl, 10 mM MgCl2, 2 M de uréia, 7 mM 2-mercaptoethanol)e , em seguida, mais dialyzed contra buffer D sem uréia. As soluções resultantes estavam concentradas utilizando um Amicon Ultra 3 kDa (#UFC800324, Merck Millipore, EUA) e dialisado contra tampão D sem ureia contendo 50% de glicerol. A proteína C5 purificada foi armazenada a -30 °C. notamos que podemos compartilhar todos os plasmídeos a pedido.a preparação de enzimas de modificação para iVTtRNAs foi preparada da seguinte forma. Os genes de E. coli de TsaB, TsaC, TsaD, TsaE, TrmD, GlyA, MnmC, MnmE e GidA foram amplificados a partir do genoma de E. coli A19 utilizando primers apropriados (dados suplementares 5). Amplificado genes para TsaC, TsaD, TsaE, GlyA, MnmC, MnmE, e GidA foram clonados em pET15b (#69661, a Merck Millipore, EUA) como pequeno hidrolase-como modificador (SUMO) de proteína de fusão de proteínas, onde a Sua marca, o SUMO de proteínas e enzimas de modificação foram tandemly organizado. Genes para TsaB e TrmD foram clonados em pET15b como proteína de fusão. Todos os genes foram clonados com Gibson assembly technique (#E2611, New England Biolabs, USA). Os plasmídeos resultantes foram transformados numa estirpe E. coli BL21 (DE3) e cultivados em meio LB até um OD660 de 0, 6-1, 0 a 37 ° C. Sobreexpressão foi induzida pela adição de IPTG para uma concentração final de 1 mM para TsaB, TsaC, TsaD, TsaE, e TrmD, ou 0,1 mM para GlyA, MnmC, MnmE, e GidA. Após 3 h de cultivo a 37 ° C, As células foram colhidas. TsaB, TsaC, TsaE, TrmD, e MnmE-overexpressed de células em suspensão em 40 mL de tampão de Lise (50 mM de Hepes-KOH, pH 7.6, 1 M NH4Cl, 10 mM MgCl2, e 7 mM 2-mercaptoethanol) e interrompido por sonicação. O lisato resultante foi centrifugado e o sobrenadante foi recuperado e misturado com 5 mL de resina de purificação completa (#05893801001, Roche, Suíça) durante 1 h com rotador. A resina foi lavada com 100 mL de tampão de Lise e depois a proteína foi eluída com 25 mL de tampão de eluição (50 mM Hepes-KOH, pH 7, 6, 400 mM KCl, 10 mM MgCl2, 400 mM imidazol e 7 mM 2-mercaptoetanol). TsaB e TrmD foram concentrados por Amicon Ultra 3 kDa (#UFC800324, Merck Millipore, EUA) e, em seguida, dialisados contra Tampão de estoque (50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 500 mM KCl, 10 mM MgCl2, 7 mM 2-mercaptoetanol e 30% glicerol). Eles foram congelada com nitrogênio líquido e armazenados a -80°C. Para TsaC, TsaE, e MnmE, Ulp1 (#12588018, Thermo Fischer Scientific, EUA) foi adicionado ao recuperados frações para uma concentração final de 23 µg/ml para remover o Seu marcados SUMO de proteína. As frações foram dialisadas contra o tampão de clivagem (50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 100 mM KCl, e 7 mM 2-mercaptoetanol) durante a noite, enquanto o tampão de clivagem continha 500 mM KCl para a preparação MnmE. As amostras dialisadas foram novamente misturadas com 5 mL de resina de purificação completa com rotador. Em seguida, as frações de fluxo que contêm enzimas de modificação foram coletadas. As amostras recuperadas foram concentradas pela Amicon Ultra 3 kDa para TsaE ou Amicon Ultra 10 kDa (#UFC901024, Merck Millipore, USA) para TsaC e MnmE. Eles foram dialisados contra tampão de reserva, flash congelado com nitrogênio líquido, e armazenados a -80 °C. Para a preparação de GlyA, todos os tampões continham 10% de glicerol e os outros procedimentos eram os mesmos que a preparação MnmE. TsaD foi encontrado para ser insolúvel após sonication. Por conseguinte, a proteína foi granulada por centrifugação a 20,400 × g A 4 °C durante 45 minutos e foi ressuspendida em tampão de Lise complementada com Triton X-100 a 4%. A suspensão foi novamente granulada por centrifugação a 20,400 × g durante 45 minutos. O sedimento foi dissolvido com tampão de Lise complementado com 6 m de ureia. O outro procedimento foi o mesmo que a preparação MnmE, exceto que todos os tampões continham 2 m de ureia. Para a preparação do MnmC, todos os passos até a remoção de sua marcada proteína sumô foram os mesmos que a preparação de GlyA. Como MnmC não especificamente ligado à resina de purificação de sua marca, a purificação com cromatografia de troca de aniões foi selecionada. A solução após o tratamento com Ulp1 foi dialisada contra o tampão IEX (50 mM Hepes-KOH, pH 7, 6, 100 mM KCl, 10 mM MgCl2 e 7 mM 2-mercaptoetanol) e, em seguida, foram aplicados numa coluna HiTrap Q HP de 5 mL (#17115401, GE Healthcare, EUA). A coluna foi lavada com 25 mL de tampão IEX e, em seguida, o MnmC foi eluído com um gradiente de revestimento de 100 mM a 1 m KCl em tampão IEX. Frações contendo MnmC foram concentradas por Amicon Ultra 30 kDa (#UFC903024, Merck Millipore, EUA), dialisadas contra Tampão de estoque, flash congelado com nitrogênio líquido, e armazenado a -80°C. notamos que podemos compartilhar todos os plasmídeos a pedido.

preparação de Genes de iVTtRNA

para cada Genes de iVTtRNA (dados suplementares 1) foram clonados para o vector pGEMEX-1 (#P2211, Promega, EUA) entre os locais de restrição de XbaI e BamHI. Utilizando os plasmídeos resultantes como modelos, os modelos de ADN para transcrição in vitro foram amplificados por PCR utilizando um iniciador promotor T7 como iniciador avançado e iniciadores inversos adequados para cada iVTtRNA (dados suplementares 1). Cada iniciador reverso continha uma modificação de 2 ‘- metoxi no segundo nucleótido do 5’-terminus para evitar a adição independente do modelo de um nucleótido extra28. Os produtos foram purificados por fenol / clorofórmio / álcool isoamílico (25:24:1) extração, seguido de precipitação de etanol, e os precipitantes foram dissolvidos em água. Run-off transcription of precursor iVTtRNAs with 27 extra nucleotides introduced at the 5′-terminus (5′-GGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGA-3′) was performed using the resultant DNA templates for 3 h at 37°C in 20 mL reaction mixtures containing 30 nM T7 RNA polymerase, 1 mM each ATP, GTP, CTP, and UTP, 40 mM HEPES-KOH pH 7.6, 20 mM MgCl2, 1.5 mM spermidine, 5 mM DTT, 20 μg PCR products, and 0.2 U/mL inorganic pyrophosphatase (#10108987001, Roche, Switzerland). Os componentes RNase P compostos de proteína C5 e ARN M1 foram posteriormente adicionados a misturas de reacção a 150 nM para remoção dos 27 nucleótidos extra, e as reacções foram incubadas durante 1 h a 37 °C. As iVTtRNAs transcritas foram então processadas com extracção de fenol ácido, seguido de extracção de clorofórmio/álcool isoamílico (10:1) e, em seguida, purificação por cromatografia de troca de aniões. As amostras contendo iVTtRNAs foram carregadas em 10 mL de colunas HiTrap Q HP (#17115401, GE Healthcare, EUA) e lavadas com tampão Q (20 mM HEPES-KOH pH 7.6 e 200 mM KCl). as iVTtRNAs foram eluídas com um gradiente linear de 200 mM para 1 m KCl em q buffer. Frações contendo ivttrnas alvo, determinadas por página de ureia, foram recuperadas por precipitação de isopropanol, e precipitados iVTtRNAs foram dissolvidos em água e armazenados a -80°C até à sua utilização. Notamos que podemos compartilhar todos os plasmídeos em pedidos.a modificação da iVTtRNA

t6A37 foi realizada na mistura de reacção contendo 50 mM de Hepes-KOH, pH 7.6, 300 mM KCl, 20 mM MgCl2, 5 mM DTT, 50 mM NaHCO3, 1 μM CaCl2, 1 mM ATP, 1 mM Thr, 5 μM TsaC, 5 μM TsaB, 5 μM TsaD, 5 μM TsaE, 4 A260 unit/mL tRNAIleGAU or tRNAAsnGUU or tRNAPheGAA. m1G37 modification was performed in the reaction mixture containing 50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 200 mM KCl, 10 mM MgCl2, 36.4 μM S-adenosyl methionine (SAM), 1.5 μM TrmD, 10 A260 unit/mL tRNAProGGG or tRNAPheGAA. mnm5U34 was performed in the reaction mixture containing 50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 150 mM KCl, 12.5 mM MgCl2, 5 mM DTT, 500 μM FAD, 1 mM tetrahydrofolate, 4 mM GTP, 2.5 mM NADH, 0.2 mM piridoxal-5′-fosfato, 1 mM Ser, 1 mM Gly, 36,4 µM SAM, 0, 1 unidade/µL inibidor recombinante da RNase (#2313 a, TaKaRa, Japão), 10 µM GlyA, 3 µM GidA, 3 µM MnmE, 2, 5 µM MnmC, 6 A260 unidade/mL tRNAGluUUC ou tRNAGluCUC. Após incubação a 37 ° C para 2 h para a modificação t6A37 e m1G37 ou 4 h para a modificação mnm5U34, as tRNAs foram processadas com extração de fenol ácido, seguida de extração de clorofórmio/álcool isoamílico (10:1) e recuperadas por precipitação de isopropanol. As tRNAs precipitadas foram dissolvidas em água e armazenadas a -80 °C. Para a modificação mnm5U34, a reação foi novamente realizada com tRNAs recuperadas. Eles foram processados com extração de fenol ácido seguido por extração de clorofórmio / álcool isoamílico (10: 1), dessalinizado por colunas MicroSpin G-25 (#27532501, GE Healthcare, EUA), e recuperado pela precipitação de isopropanol. As tRNAs precipitadas foram dissolvidas em água e armazenadas a -80 °C. para quantificar a eficiência de modificação, foi utilizada uma Thr de 57,1 µM em vez de uma Thr de 1 mM e a mistura sem TsaD foi utilizada como controlo para a modificação t6A37. 36.4 µM S — adenosil-metionina foi usada e a mistura sem TrmD foi usada como controle para modificação m1G e sem GidA foi usada como controle para modificação mnm5U34. Após incubação a 37 ° C, as alíquotas (10 µL) foram retiradas e detectadas nos discos de filtro Whatman de 25 mm GF/C (#1822-025, GE Healthcare, EUA). Os discos filtrantes foram lavados duas vezes com TCA de 10%, em seguida etanol, seguido pela medição da radioatividade por um contador de cintilação líquida. Para a quantificação da modificação mnm5U, tRNAs foram purificadas como acima e então 0.02 A260 unidade foi avistada nos discos filtrantes em vez disso.as experiências de Aminoacilação foram realizadas de acordo com um relatório anterior 47. Misturas de reacção (10 µL) contidos 100 mM HEPES-KOH pH 7.6, 15 mM MgCl2, de 40 mM de KCl, 1 mM DTT, com 4 mM de ATP, 1 unidade/µL recombinante inibidor de RNase (#2313 Um, de TaKaRa, Japão), a 50 nM ou 1,5 µM aaRS correspondente para cada aminoácido, 20 µM de aminoácidos ou 68 µM Asn para asparagina aminoacylation, e 2 A260 unidade/mL tRNA. Para medir a metilação, foi utilizada uma mistura de 0,6 µM de Met e 3,4 µM de L-metionina fria. O Cys foi obtido por redução da cistina com 50 mM de ITC a 37 ° C durante 15 minutos. Para medir a cisteinilação, a concentração de DTT foi de 5 mM. quando foram utilizadas misturas autóctones de tRNA, foram adicionadas 40 misturas A260 unidades/mL de tRNA (#10109541001, Sigma-Aldrich, EUA). Após incubação a 37 ° C durante 30 minutos, as alíquotas (8 µL) foram retiradas e detectadas nos discos de filtro Whatman de 25 mm GF/C (#1822-025, GE Healthcare, EUA). Os discos filtrantes foram lavados duas vezes com TCA de 10%, em seguida com etanol, seguido pela medição da radioatividade por um contador de cintilação líquida.

Octapeptide síntese com o PURO sistema

DNA modelos de codificação octapeptides foram de PCR amplificado com os primers apropriados (Dados Suplementares 2) utilizando o pURE1 vetor (#PUREV001, BioComber, Japão), contendo um promotor T7 sequência e do ribossoma, o sítio de ligação (Shine-Dalgarno sequência) como um modelo. Modelos de DNA amplificados foram purificados usando um kit de purificação QIAQUICK PCR (#28104, QIAGEN, Alemanha). As reacções à síntese dos octapeptídeos continham 50 mM de HEPES-KOH pH 7.6, 100 mM glutamato de potássio, 13 mM acetato de magnésio, 2 mM espermidina, 1 mM DTT, 2 mM ATP, 2 mM GTP, 1 mM UTP, 1 mM CTP, 20 mM fosfato de creatina, 10 µg/mL ácido 10-formil-5,6,7,8-tetrahidrofólico, ribossoma de 0,2 µM, modelo de ADN de 4 nM, componentes do sistema puro proteico, incluindo factores de tradução e enzimas, aminoácidos e tRNAs. As concentrações dos componentes do sistema proteináceo puro foram descritas em um protocol46 anterior. Notamos que todas as 20 aaRSs foram incluídas nesta experiência, independentemente dos modelos de DNA e codões de teste. A composição e a concentração dos aminoácidos, que dependem dos codões de ensaio, constam dos dados suplementares 2. A composição do iVTtRNAs depende do modelo, e as reações foram realizadas usando o ivttrnas basal (dados suplementares 2) na presença ou ausência do teste iVTtRNAs (dados suplementares 2). A concentração de cada iVTtRNA foi fixada em 6 µM. Quando foram utilizadas misturas autóctones de tRNA, foram adicionadas 56 A260 unidades/mL de misturas de tRNA (#10109541001, Sigma-Aldrich, EUA). As reações foram realizadas durante 60 minutos a 37 ° C e alíquotas foram retiradas, manchadas em documentos de filtro Whatman 3 MM (#1822-025, GE Healthcare, EUA), fervidas em 10% TCA a 90 °C por 30 minutos para diacilato aminoacil-RNAs. A radioactividade na fracção insolúvel em TCA a 10% foi medida com um contador de cintilação líquido.

síntese proteica com o sistema puro

síntese proteica experimentos foram realizados com um PUREfrex 2.0 kit (#PF201, Genefront Corporation, Japão) sem misturas tRNA na solução I (Buffer mix). Adicionamos 0.2 µM Met, 4 nM PCR-amplified DNA template for DHFR or sfGFP expression (Supplementary Data 3), and a specified amount of iVTtRNA mixture or native tRNA mixture. As reações foram realizadas a 30 ou 37 °C durante 12 h, e as proteínas sintetizadas foram analisadas.

A análise de proteínas sintetizadas

DHFR sintetizadas e Sfgfp contendo Mets radioativos foram analisados em 15% da página SDS, e a imagem gel foi visualizada usando um analisador BAS-5000 Bio-imaging (GE Healthcare, EUA). A análise de tempo-curso da expressão do sfGFP foi realizada medindo a fluorescência do sfGFP a cada 3 minutos usando um sistema qRT-PCR StepOne (#4376373, Applied Biosystems, EUA). Imagens fluorescentes de sfGFP sintetizado em misturas de reação foram obtidas usando um instrumento LAS-4000 (GE Healthcare, EUA). A actividade do DHFR sintetizado foi medida como descrito anteriormente44. Misturas de reacção (2 mL) continham 50 mM MES-KOH pH 7.0, 25 mM TRIS-HCl pH 7.0, 25 mM etanolamina, 100 mM NaCl, 10 mM 2-mercaptoetanol, 0.EDTA de 1 mM, ácido dihidrofólico de 100 µM e alíquota de 10 µL da mistura de reacção pura, incubados a 37°C durante 15 minutos. Em seguida, 20 mM de NADPH foi adicionado a uma concentração final de 200 µM, e a diminuição na absorvância a 340 nm foi medida durante um período de 10 minutos com um espectrofotômetro V-550 (Jasco, Japão). Uma unidade de DHFR foi definida como a quantidade de enzima necessária para o processo de 1 µmol de dihydrofolic ácido em 1 min a 37 °C.

LC-MS a análise de proteínas sintetizadas

DHFR com sequência de SINALIZADOR no seu terminus (Dados Suplementares 3) foi sintetizada com um PUREfrex 2.0 kit (#PF201, Genefrontar Corporation, Japão) sem misturas tRNA na solução I (Buffer mix). Adicionámos adicionalmente um modelo de ADN amplificado por PCR de 4 nM para o DHFR marcado com sequência de FLAG no seu c-terminus (dados suplementares 3) e uma quantidade especificada de mistura iVTtRNA ou mistura tRNA nativa. As reações foram realizadas a 30 ° C durante 12 h. O DHFR sintetizado foi purificado com contas magnéticas Anti-FLAG M2 (#M8823, Sigma-Aldrich, EUA). As alíquotas (55 µL) das misturas de reacção foram misturadas com 245 µL do tampão de lavagem da bandeira (50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 150 mM NaCl, 20 mM Mg (OAc)2) e posteriormente misturados com 30 µL de esferas durante 1 h. as esferas foram lavadas com 210 µL do tampão de lavagem da bandeira seguido de lavagem com o tampão sem Mg(OAc)2 duas vezes (210 µL e 180 µL). Em seguida, DHFR foi eluídas com 50 µL da BANDEIRA de tampão de lavagem sem Mg(OAc)2, mas suplementado com 100 µg/mL 3xFLAG peptídeo (#F4799, Sigma-aldrich, EUA), depois delicadamente a mistura por 1 h. Preparação de amostras para LC-MS a análise foi realizada de acordo com a fase de transferência de surfactante (PTS) com auxílio de protocol48. Adicionou-se a 40 µl das amostras eluídas os 4 µL de um tampão PTS denso (100 mM deoxicolato de sódio, 100 mM de N-lauroilsarcosinato de sódio e 500 mM NH4HCO3). Foram reduzidos com 10 mm de TCEP a 37 ° C durante 30 minutos, alquilados com 20 mM de iodoacetamida a 37 °C durante 30 minutos e extintos com 20 mM de Cys. Cada solução de reacção foi dividida em duas porções. Um foi digerido por 10 ng/µl Lys-C (#90051, Thermo Fisher Scientific, USA) e 10 ng / µl tripsina (#90057, Thermo Fisher Scientific, USA) a 37 °C durante a noite. O outro foi digerido por 10 ng / µl Asp-N (#90053, Thermo Fisher Scientific, USA) a 37 °C durante a noite. Após a digestão, 10% de ácido trifluoroacético (TFA) foi adicionado a uma concentração final de 1%, e as soluções de reação foram centrifugadas a 15.000 × g durante 5 minutos para precipitar os detergentes. Os sobrenadantes foram dessalinizados utilizando pistas de fase self-preparedo49 e secos com o velocímetro. LC-MS a análise foi realizada utilizando um Orbitrap espectrômetro de massa (LTQ Orbitrap Velos Pro, Thermo Fisher Scientific, EUA) equipado com um nanospray fonte de íons (Nanospray Flex, Thermo Fisher Scientific, EUA) e um nano-LC sistema (UltiMate 3000, Thermo Fisher Scientific, EUA). Dissolveram-se as misturas peptídicas secas numa solução contendo 5% de acetonitrilo e 0,1% de TFA, tendo cada amostra sido aplicada ao sistema nano-LC. Os peptídeos estavam concentrados usando uma coluna de armadilha (#164535, 0.075 × 20 mm, 3 µm, Elogios PepMap 100 C18, Thermo Fisher Scientific, EUA) e, em seguida, separadas através de um nano coluna capilar (#NTCC-360/100-3-153, 0.1 × 150 mm, 3 µm, C18, Nikkyo Technos, Japão) utilizando dois móveis fases de Um (0,1% de ácido fórmico) e B (acetonitrilo e 0,1% de ácido fórmico) com uma gradação (5% de B por 5 min, 5-45% B em 45 min, de 45 a 90% de B em 1 min, e 90% B em 4 min) a uma vazão de 500 nL/min. A eluição foi diretamente eletrospraiada (2,2 kV) para o MS (modo positivo, alcance de varredura de 200-1500 m/z, resolução de 60.000 FWHM)50.