quando se trata de solubilização e desnaturação de proteínas antes da focagem isoeléctrica e da electroforese em gel 2-D, A maioria dos investigadores escolhe a ureia. Isto não é surpreendente, uma vez que este agente chaotrópico ligeiro pode perturbar completamente as interacções entre moléculas proteicas e aumentar a eficiência da actividade da protease na digestão proteica, ao mesmo tempo que impede eficazmente a agregação e/ou precipitação de proteínas. Além disso, a ureia é também utilizada para renaturar proteínas de amostras previamente desnaturadas.apesar da sua popularidade como um desnaturante proteico eficaz, o uso de solução de ureia na digestão de proteínas vem com um desafio particular – aumenta o risco de carbamilação. Porque é que isso lhe diz respeito? Aqui estão algumas razões pelas quais a carbamilação pode ser prejudicial para a sua experiência e por que deve ser evitado a todo o custo.para além de bloquear as extremidades n-terminais das moléculas proteicas, a carbamilação interfere com a caracterização proteica e torna-as indisponíveis para utilização posterior.ataca agressivamente as cadeias laterais de resíduos de arginina e lisina e torna a proteína imprópria para digestão enzimática.impede a digestão enzimática das proteínas e afecta negativamente a identificação e quantificação das proteínas na análise em.confunde os resultados obtidos a partir dos peptídeos com tempos de retenção inesperados e aumenta a complexidade da amostra.reduz a eficiência de ionização e afeta negativamente a intensidade do sinal dos picos detectados.induz uma mudança no ponto isoelétrico das proteínas e conduz a resultados artificiais.pode afectar os resultados dos estudos de carbamilação in vivo.o que causa a Carbamilação?por definição, a carbamilação refere-se à modificação pós-translacional que altera as propriedades estruturais e funcionais das proteínas. Isto é causado pela reação não enzimática entre o ácido isociânico e os grupos aminados livres.em soluções aquosas, a ureia existe em equilíbrio com o cianato de amónio. É importante notar que (1) uréia em solução dissocia-se, espontaneamente, produzir cianato e íons de amônio, (2) diminui a isocyanic ácido (CNOH), o formulário que ativamente reage com a proteína grupos de aminoácidos e induz carbamylation, e (3) a taxa de uréia dissocia e o grau de carbamylation depende da temperatura, pH e tempo de incubação.algumas dicas úteis para considerar Nada pode mudar o fato de que a ureia na presença de calor e proteínas sempre levará à carbamilação. Você pode usar a ureia de grau mais alto disponível e ainda correr o risco de carbamilação.Felizmente, Existem várias formas de proteger os peptídeos da carbamilação. Aqui estão algumas estratégias eficazes que podem ser usadas para alcançar este objetivo.utilizar sempre reagentes recém-preparados à base de ureia para a realização de procedimentos proteómicos. Utilize tampões pré-misturados e prontos a usar de alta qualidade à base de ureia seca de fontes credíveis e tenha extrema precaução na preparação das suas amostras. Nota: armazenar material sólido à temperatura ambiente e manter o manuseamento no mínimo.remover a ureia da amostra de proteínas antes da digestão por diálise e/ou cromatografia de fase reversa rápida ou por meio de colunas spin.manter a amostra a uma temperatura relativamente baixa para diminuir a taxa de decomposição da ureia. Evite aquecer tampões contendo ureia acima de 37oC para reduzir o risco de carbamilação.Desionizar a solução de ureia usando uma resina de permuta iónica para reduzir a concentração de cianatos.acidificar a solução de ureia (HCL 100 mM) para impedir a formação de ácido isociânico.
Admittly, these strategies have their own disvantages (i.e., requer tempo de manipulação prolongado, induzir precipitação de proteínas prontamente desnaturadas, e pode ser inadequado para inúmeras técnicas de digestão enzimática), mas uma vez que os digestos enzimáticos são realizados em temperaturas elevadas ao longo de um longo período de tempo, você não tem escolha a não ser remover a ureia da mistura de digestão. Caso contrário, correrá sempre o risco de carbamilação. É um risco que não queres correr.
