Estudo de Caso: a Descoberta de Inibidores de Voltage-gated Canais de Sódio
Como uma forma de ilustrar as questões relacionadas com o canal de iões de descoberta de drogas descritas acima, o restante deste artigo descreve um estudo de caso com foco na identificação de voltage-gated inibidores de canais de sódio para tratar a dor neuropática. O tratamento da dor é um problema médico grave e há um grande esforço na indústria farmacêutica para desenvolver novas terapias para esta condição. Em particular, o tratamento da dor neuropática, definida como “a dor crônica que resulta de uma lesão primária ou disfunção do sistema nervoso periférico” pela Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP), continua a ser uma grande necessidade médica não atendida.
é evidente que os canais de sódio voltados para a tensão (Nav1) desempenham um papel fundamental na originação e propagação dos potenciais de Acção sensorial dos nervos necessários para a sinalização da dor. As aplicações locais dos bloqueadores dos canais de sódio selectivos Não-Tipo, tais como a novocaína, proporcionam um alívio completo da dor através do bloqueio de condução. No entanto, esta abordagem ao alívio da dor é limitada a muito poucas aplicações, tais como procedimentos dentários, uma vez que os canais de sódio também são vitais para a condução no coração, SNC, músculo esquelético, e neurônios sensoriais nonnociceptivos. A super família Nav1 é composta por 10 membros (Yu e Catterall, 2004). Sete desses subtipos, Nav1.1, Nav1.3, Nav1.5, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8, e Nav1.9, estão presentes no sistema nervoso periférico (SNP). Destes, Nav1. 7, Nav1. 8, e Nav1. 9 são expressos predominantemente em neurônios nociceptivos, e Nav1.3 é predominantemente embrionário, mas é up-regulado no PNS adulto após lesão. Este padrão de expressão limitada torna estes subtipos alvos atraentes para o desenvolvimento de novos agentes analgésicos. No entanto, a sua relativa contribuição para a sinalização da dor, e especificamente para a sinalização da dor neuropática, não é clara e pode variar com diferentes etiologias e qualidades sensoriais da dor.
Na ausência de molecular seletividade para um Nav1 subtipo, é possível segmentar especificamente Nav1 canais em um determinado estado conformacional preservando canais de sódio dependentes de condução do impulso. Este tipo de inibição dependente do Estado é a base para a janela terapêutica observada com anticonvulsivantes bloqueantes do canal de sódio e antiarrítmicos, tais como lamotrigina e lidocaína. Estes medicamentos têm maior afinidade para os canais nos Estados abertos e/ou inactivados do que para os canais fechados em repouso. Este mecanismo de inibição favorece a ligação em tecidos rapidamente disparados ou parcialmente despolarizados. A dor neuropática deve ser sensível a este mecanismo inibitório, uma vez que se pensa que resulta de áreas de despolarizações induzidas por lesões, uma hipótese que é suportada pela eficácia clínica da lidocaína administrada sistemicamente em doses subanestésicas. Além disso, bloco não seletivo por tipo, dependente do Estado pode permitir a maior eficácia, uma vez que nocaute individual de Nav1.3, Nav1.7, Nav1.8 ou Nav1.9 não forneceu provas convincentes de um papel dominante de qualquer um destes canais na sinalização da dor neuropática.
com base nesta lógica, foi tomada a decisão de inicialmente perseguir inibidores Nav1 selectivos do tipo Nãoubtipo, dependentes do Estado, enquanto monitorava a selectividade molecular testando compostos de interesse em Nav1.7, Nav1.5 (Canal cardíaco primário de sódio) e Nav1.8 em paralelo.foi utilizado um doseamento à base de potencial de membrana para detectar ∼200 000 compostos no Nav1.8, expresso de forma estável numa linha celular recombinante. Este ensaio HTS baseou–se na transferência de energia por ressonância de fluorescência (FRET) entre dois membros de um par de corantes potencialmente sensível à membrana desenvolvido pela Aurora Biosciences (Priest et al., 2004). Os canais Nav1.8 foram pré-incubados com o composto de ensaio e o agonista químico deltametrina na ausência de sódio extracelular. A adição subsequente de sódio resultou na despolarização da membrana e o bloco Nav1 foi quantificado como interferência com esse processo de despolarização celular.
embora o ecrã inicial no Nav1.8 rendeu uma variedade de hits, apenas um único composto foi considerado uma pista viável para os esforços de Química medicinal. Antes de cometer recursos para este chumbo, o composto, uma succinimida disubstituída chamada BPBTS (N-{ metil }-N’-(2,2′-bithien-5-il metil)succinimida), foi examinado em detalhe por grampo manual de tensão celular inteira. Verificou-se que os BPBTS inibem todos os subtipos Nav1 com potência semelhante, e a inibição foi dependente do potencial de membrana e da frequência de estimulação. Este mecanismo inibitório foi consistente com uma maior afinidade do composto para os canais em estado aberto e inactivado, em comparação com os canais em estado de repouso. Além disso, BPBTS foi duas ordens de magnitude mais potente do que a usada clinicamente anticonvulsivante e antiarrítmicos Nav1 bloqueadores, inibindo a vacina inativada estado de Nav1.8, Nav1.7, Nav1.5, e Nav1.2, com valores de Ki de 0,09, 0.15, 0.08, e de 0,14 µM e o estado de repouso com Kr valores de 1,5, 1.3, 0.3, e 1,2 µM, respectivamente (Padre et al., 2004).como tal, as BPBTS eram um chumbo atraente para a química medicinal.; o seu principal passivo é um perfil farmacocinético fraco. Ao longo do curso dos análogos de perfis dos BPBTS, bem como dos inibidores Nav1 publicados, utilizando o ensaio de rastreio fluorescente à base de potencial de membrana, observaram–se discrepâncias baseadas na estrutura entre as potências determinadas no ensaio fluorescente e pela electrofisiologia relativamente a alguns compostos. Estas discrepâncias foram atribuídas a uma interacção entre estes compostos e a veratridina agonista utilizada para abrir canais Nav1.7. Subsequentemente, o ensaio fluorescente foi modificado de tal forma que os canais Nav1 foram pré-incubados com o composto de ensaio em concentrações fisiológicas extracelulares de sódio e a despolarização dependente do Nav1 foi iniciada por adição de agonistas (Fig. 1). As potências inibitórias dos canais medidas neste doseamento modificado correlacionaram-se muito bem com a inibição do estado inactivado determinada por electrofisiologia em muitas classes estruturais de inibidores Nav1 (Felix et al., 2004; Liu et al., 2006).
a functional, membrane potential FRET-based assay for Nav1.7 channels. Na ausência de outras condutâncias iônicas que podem hiperpolarizar a célula, a expressão heteróloga dos canais Nav1. 7 fornece um sistema onde na membrana de repouso celular a maioria dos canais residirá no estado não-induzido inactivado. A remoção da inativação rápida pela adição de veratridina muda o equilíbrio do canal para o estado condutivo aberto que permite a entrada de sódio levando à despolarização celular. As mudanças de tensão podem ser monitoradas com um par de corantes sensíveis à tensão FRET, cumarina e oxonol. A despolarização celular altera a distribuição do oxonol através da membrana, causando uma mudança no sinal de traste. Na presença de um inibidor Nav1.7, o equilíbrio do canal muda para a conformação inactivada, ligada ao fármaco, reduzindo o número de canais que estarão disponíveis para modificação da veratridina, e prevenindo o sinal de FRET induzido pelos agonistas. A curva dose-resposta para a alteração induzida pela veratridina no sinal FRET é íngreme, sugerindo que a modificação de um pequeno número de canais Nav1.7 é suficiente para causar despolarização celular.
Embora farmacêutica BPBTS não conseguiu superar o principal inicial em potência, química medicinal conseguiu melhorar o perfil farmacocinético, eventualmente, gerar trans-N-{metil }-N-metil-N’-ciclopentano-1,2-dicarboxamide (CDA54) com 44% biodisponibilidade oral, uma hora de meia-vida, e uma taxa de depuração de 14 ml/min/kg, que foi perfilado extensivamente in vivo (Brochu et al., 2006). Em dois modelos de dor neuropática no rato, o CDA54 (10 mg/kg, administrado por via oral) reduziu significativamente a hipersensibilidade comportamental induzida por lesões nervosas em 44–67%. A mesma dose/concentração plasmática de CDA54 não afectou a nocicepção aguda (teste de placa quente no rato), a coordenação motora (ensaio de rotorod no rato) ou a condução cardíaca (parâmetros electrofisiológicos medidos no cão cardiovascular). Estas propriedades estão em contraste com as dos bloqueadores dos canais de sódio usados na clínica, que causam diminuição da coordenação motora em ratos e efeitos secundários do SNC no homem em todas as doses eficazes. Curiosamente, após a administração oral, a razão cérebro-plasma para CDA54 foi de 0, 03. Em contraste, bloqueadores Nav1 clinicamente usados acumulam-se no SNC, com uma razão cérebro / plasma superior a 10 para a mexiletina. Estes dados obtidos com o CDA54 sugerem fortemente que a inibição dos canais de sódio PNS por si só é eficaz em modelos animais de dor neuropática, e que limitar as exposições ao SNC dos inibidores Nav1 é uma abordagem viável para o desenvolvimento de inibidores Nav1 com um índice terapêutico melhorado.
A campanha UHTS, utilizando o doseamento com potencial de membrana descrito para detectar inibidores da Nav1. 7, descobriu os novos inibidores do canal 1-benzazepina-2-one (Hoyt et al., 2007; Williams et al., 2007). Esta classe de inibidores demonstrou uma relação estrutura–actividade definida e, quando avaliada in vivo, os membros desta série foram eficazes oralmente em modelos de dor neuropática e epilepsia em roedores. Mais importante, Alguns membros desta classe exibiram selectividade molecular para canais Nav1. 7 (Williams et al., 2007). Por exemplo, composto 2 De Figo. 2 era altamente dependente do estado e ∼10 vezes seletivo para Nav1. 7 sobre Nav1. 8 e Nav1. 5. O mais potente, embora não subtipo-selectivo, membro desta classe de inibidores Nav1.7 (composto 1, BNZA; Fig. 2) foi tritiado. O BNZA liga-se com elevada afinidade (Kd de 1, 6 nM) aos canais Nav1.7 recombinantes. Esta é a primeira demonstração de ligação ligando ligando de alta afinidade ao Nav1.7 e fornece uma valiosa ferramenta de triagem com a qual procurar compostos seletivos Nav1.7. Os dados obtidos com a série estrutural 1-benzazepin-2-one sugerem que Nav1.7-análogos seletivos podem ser identificados, e com as propriedades farmacocinéticas e metabólicas apropriadas, tais compostos podem ser desenvolvidos como agentes analgésicos, potencialmente exibindo maior tolerabilidade sobre os medicamentos existentes utilizados para tratar a dor neuropática. O apoio à viabilidade do desenvolvimento de inibidores selectivos do canal de sódio subtipo-selectivos como novos analgésicos vem do recente relatório de um agente selectivo Nav1.8 de elevada afinidade, que, dado intraperitonealmente, foi eficaz numa vasta gama de modelos de dor de roedores (Jarvis et al., 2007).
1-Benzazepina-2-ona inibidores Nav1. As estruturas de dois inibidores Nav1 1-benzazepina-2-ona são ilustradas juntamente com as suas potências para os canais hNav1.5, hNav1.7 e hNav1.8, conforme determinado em potenciais membranares funcionais, ensaios à base de FRET. São também apresentadas as potências estimadas destes compostos para o estado inactivado dos canais hNav1.5 e hNav1.7, determinadas a partir de registos electrofisiológicos. Note que apenas o composto 2 exibe selectividade para o canal hNav1.7. Ambos os compostos são inibidores mais fracos do canal hnav1.8.
Vários peptídeos têm sido mostrados anteriormente para modificar a coloração dos canais de sódio, mas poucas moléculas pequenas, especialmente inibidores, têm sido descritas para funcionar desta forma. Um desses agentes é ProTx-II, um peptídeo de 30 aminoácidos purificado do veneno da Tarântula; este peptídeo bloqueia os canais de sódio e mostra selectividade para Nav1. 7 (Smith et al., 2007). ProTx-II liga-se ao estado de repouso dos canais de sódio e muda a dependência de voltagem da ativação do canal para potenciais mais despolarizados. As despolarizações fortes superam a inibição do canal, que é uma característica deste tipo de peptídeo modificador Gante. Uma possível estratégia para identificar a pequena mimética molecular de um peptídeo modificador Gante é a radiomarcação do ProTx-II em forma biologicamente ativa, e desenvolver um ensaio de ligação com os canais Nav1.7 heterologicamente expressos numa linha celular. O rastreio de pequenas moléculas que modulam a ligação ao ProTx-II pode revelar novas classes de inibidores do canal que se dividem na membrana e interferem com o movimento da raquete, impedindo assim a abertura do canal. Uma vantagem adicional deste tipo de UHTS é que podem ser utilizadas elevadas concentrações de compostos de ensaio, uma situação que é impedida na triagem baseada em corantes devido à interferência de fluorescência que normalmente ocorre com altas concentrações de muitas pequenas moléculas orgânicas. Dado que alguns peptídeos modificadores de gação se ligam a regiões que são únicas a canais específicos dentro de uma super família, inibidores seletivos de subtipo podem ser identificados usando tal estratégia.
