resultados e discussão

HANCs são originários da epiderme da cabeça e requerem função do Gene lb. Estudos anteriores (5, 11, 17, 19) descreveram o papel dos genes lb nos processos de especificação do Destino celular. Em Drosophila, ganho e perda de função experimentos revelaram que lb genes especificar a identidade de um subconjunto de cardíacas e células musculares e que esta função de resultados altamente restrito, linhagem-específicos mesodermal expressão de lb. Além disso, uma análise precisa do lbe (Fig. 1) e LBL (dados não mostrados) padrão de expressão no início da fusão cardíaca revelou um aglomerado triangular de células lb positivo situado apenas anteriormente à ponta do coração (Fig. 1 A, arrowhead). Para produzir uma descrição mais precisa da posição destas células no que diz respeito às glândulas linfáticas e glândulas anelares associadas ao coração, temos embriões duplamente rotulados para lb e marcadores de glândulas específicas(Fig. 1 B E C). Os precursores da glândula linfática revelaram com anticorpos anti-serpente flanco de ambos os lados da ponta do coração(Fig. 1B) mas não se sobreponham à área identificada por lb. Da mesma forma, a coloração dupla de l(2)1857 armadilha potenciadora, que expressa especificamente LacZ no primórdio embrionário da glândula do anel (15), demonstra que as células lb-positivas estão situadas imediatamente na frente da glândula do anel (Fig. 1C).

para determinar a origem das células lb positivas associadas ao coração, seguimos a expressão lb na parte anterior dos embriões desde a fase inicial em diante. Nos estágios embrionários que precedem a fusão cardíaca, não conseguimos detectar a expressão lb associada à parte anterior de dois primórdios cardíacos. Este achado sugere que as células lb-positivas não são originalmente especificadas na área cardíaca e podem representar células de origem diferente que se tornam associadas com as células cardíacas em estágios posteriores. Na verdade, no final da fase 11, um grupo de células lb positivas na epiderme dorsal da cabeça(Fig. 2A) pode ser detectado. Estas células começam a invaginar ligeiramente mais tarde e formam a parte principal da epiderme dobrada(Fig. 2B). A posição e o tempo desta invaginação assemelham-se a uma dobra da epiderme da cabeça, dando origem à parte posterior da Bolsa dorsal chamada saco frontal (20). Para verificar se as células que expressam lb correspondem à extremidade do saco frontal, usamos a linha N516 de escargot-LacZ que expressa lacZ em células que formam bolsas dorsais (20). Manchas duplas do estágio 14 (Fig. 2B) e fase 16 (Fig. 2C) N516 embriões que utilizam anticorpos anti-Lbe e anti-β-galactosidase demonstram claramente que lb e esg são coexpressos na ponta do saco frontal invaginado. Vista dorsal da região da cabeça embrionária (Fig. 2D) confirma que estas células exibem o mesmo arranjo triangular que as células lb positivas associadas ao coração mostradas anteriormente (comparar figos. 2D e 1).Fig. 2. HANCs são originários da epiderme da cabeça e não são especificados em embriões com deficiência de lb. (A–D) Confocal micrografias combinado com luz transmitida canais mostrando lateral (A–C) e dorsal (D) vistas da região da cabeça do WT (A) e escargot enhancer armadilha N516 (B–D) embriões clique duas vezes o nome de Lb (verde) e de β-galactosidase (vermelho). A) no estádio 11 embrião, algumas células da epiderme dorsal express lb (ponta de flecha). Na fase 14 (B) e na fase 16 (C), As células lb-positivas coexpressam escargot (pontas de flecha) e localizam-se na ponta do saco frontal invaginante. D) visão Dorsal do estádio 16 N516 embrião, mostrando a co-expressão de lb e LacZ na parte distal do saco frontal (ponta da flecha). (E E F) micrografos Nomarski representando os pontos de vista dorsais dos embriões da fase 16 e (G E H) pontos de vista dorsolaterais dos embriões da fase 14 manchados por transcrições escargot. (E E G) expressão de GEE em embriões WT. A seta indica os HANCs. (F E H) em embriões com deficiência em lb, a expressão de GEE na ponta do saco frontal está ausente (*). A distância entre as células do saco frontal mais distal e o saco da gema (com cor de fundo marrom) é muito maior em embriões com deficiência de lb (comparar setas bidirecionais em G E H). (Ampliação: A E B, ×300; C, ×350; D, ×600; E E F, ×100; G e H, ×350.)

no seu conjunto, estes dados indicam que as células expressoras de lb que se encontram imediatamente à frente do coração provêm da epiderme da cabeça e migram para a ponta do coração durante a invaginação do saco frontal. Esta observação levanta uma questão adicional sobre o papel dos genes lb na especificação deste grupo de células. Temos mostrado anteriormente que os genes lb desempenham um papel importante na especificação de um subconjunto de precursores cardíacos e musculares (11, 19). A análise funcional do gene lb ortholog lbx1 do rato (21, 22) também revelou sua implicação no controle da especificação e migração direcionada dos precursores musculares apendiculares. Além disso, os dados mais recentes indicam que Lbx1 em ratinhos especifica uma subpopulação de células nervosas cardíacas necessárias para o desenvolvimento cardíaco normal (23).

para testar se a Drosophila lb é necessária para a especificação das células associadas ao coração, analisámos a formação da Bolsa dorsal em embriões deficientes em ambos os genes lb (ver materiais e métodos). Utilizando a sonda esg RNA como marcador, demonstrámos que nos embriões lbdef a expressão esg na parte distal do saco frontal com células associadas ao coração está ausente (compare Fig. 2 E E G com F E H). Além disso, como demonstrado pela visão dorsolateral dos embriões da fase 14 (Fig. 2 G E H), a distância entre o saco da gema e as células esg mais distais positivas é significativamente aumentada em embriões com deficiência de lb. Este achado, apoiado pela observação óptica Nomarski revelando que a parte posterior do saco frontal alterou a morfologia (dados não mostrados), indicou que os HANCs não são especificados ou não migram corretamente em embriões lbdef. Como a deficiência analisada também abrange genes BAP adjacentes e C15, testamos a formação de saco frontal em embriões mutantes bap e braço-GAL4>UAS-RNAiC15 embriões. Em ambos os embriões bap208 e RNAiC15, o saco frontal com manchas de esg tinha uma forma normal (dados não mostrados), excluindo assim a influência dos genes bap e C15 na diferenciação ou migração das células associadas ao coração. Estes dados sugerem fortemente que o padrão anormal das células do saco frontal ESG distal positivas nos embriões lbdef resulta da perda da função lb.componentes Mesodérmicos e não-subcutâneos envolvidos no padrão da região de saída cardíaca. Os nossos experimentos de Imuno-detenção mostraram que as células lb positivas para ancorar o coração estão muito perto dos cardioblastos que expressam lb(Fig. 1). Como a maioria dos cardioblastos anteriores expressam estanho (5), nós embriões duplamente rotulados com anticorpos anti-estanho e anti-Lbe para visualizar as respectivas posições da ponta do coração e a parte mais distal do saco frontal. Surpreendentemente, estas duas estruturas sobrepõem-se por cerca de três comprimentos celulares quando observadas do lado dorsal (Fig. 3A). Além disso, a visão confocal lateral da região do coração anterior (Fig. 3B) mostra claramente que a ponta do saco frontal, que consiste em células que expressam lb não-esodérmicas, está diretamente ligada ao coração. Mais precisamente, observamos que a parte anterior da aorta (parcialmente sobrepondo as células lb associadas ao coração) se dobra ventricalmente, formando uma área morfologicamente distinta correspondente à região de saída cardíaca. Esta morfologia sugere que pode haver um componente celular adicional que favorece a flexão ventral do coração. Decidimos procurar a presença de um músculo ventral ligado à ponta da aorta. A visão lateral do embrião, duplamente manchada para a cadeia pesada de miosina (Mio) e Lbe (Fig. 3C), mostra claramente que o fluxo do coração está de fato ligado a um músculo da cabeça, que propomos chamar de COM. A análise mais precisa das seções confocais revelou que o primórdio cardíaco está, de fato, ligado por duas COMs que se estendem do esôfago e se ligam a ambos os lados da região de saída cardíaca (pontas de flechas abertas no Figo. 3D). Surpreendentemente, estes músculos embrionários da cabeça não foram descritos anteriormente ao nosso conhecimento. A falta de documentação publicada para COMs é provavelmente porque a morfologia e a origem dos músculos da cabeça somática no embrião de Drosophila não foram sistematicamente analisadas. Usando a única descrição disponível da musculatura da cabeça adulta feita por Miller (24), não conseguimos identificar os músculos da cabeça adulta que podem corresponder às COMs embrionárias apresentadas aqui.Fig. 3. localização espacial da região de saída cardíaca. Confocal micrografias mostrando dorsal (A e D) e lateral (B, C, E, G, e H) vistas de WT embriões de duplo manchado para Lbe (verde), Estanho (A e B), ou Myo (C–E), G) e H) (vermelho). (A E B) HANCs lb-positivos (ponta de flecha) sobrepõem-se às células cardíacas tin-positivas (seta). Note que na etapa 16 (A E B) lb não é mais expressado dentro do coração. C) visão lateral Geral de um embrião de fase 15 que mostre que a ponta do coração (asterisco) se dobra ventricalmente quando ligado a COMs (ponta da flecha aberta) e HANCs (ponta da flecha). D) visão Dorsal que mostra que os COMs (ponta da seta aberta) se sobrepõem em ambos os lados da ponta do coração (seta) e os HANCs lb-positivos (ponta da flecha). E) os HANCs (ponta de flecha) ligam-se selectivamente ao segundo par de cardioblastos (seta) que exprime lb. Note que o fluxo cardíaco ( * ) é coberto por HANCs do lado dorsal e COMs do lado posterior-dorsal. F) reconstrução 3D assistida por Computador da região de saída do coração de um embrião de fase 16 que mostra o posicionamento espacial da ponta do coração, COMs e HANCs. Note que os HANCs que inicialmente se ligam ao segundo par de células cardíacas expressando lb em estágios posteriores também estabelecem contato com as células cardíacas lb-negativas mais anteriores. G) Na fase 14, As COMs (open arrowhead) estendem os seus filópodes para os HANCs invaginantes lb-positivos (arrowhead) e os cardioblastos que expressam lb (arrow), que ainda não estão associados aos HANCs. As comunicações nesta fase são mais finas e muito mais longas do que após a fusão do coração. H) no início da fase 15, as COMs (ponta da flecha aberta) estão definitivamente ligadas às células cardíacas (seta) e HANCs (ponta da flecha), e este contacto parece preceder a fixação de HANCs às células cardíacas que expressam o lb. CO, fluxo cardíaco; ES, esófago; PhM, músculo faríngeo. (Ampliação: A E B, ×400; C, ×250; D E E, ×300; G E H, ×350.)

curiosamente, a coloração dupla Myo / Lbe também revelou que os Hancos não-dérmicos estão ligados a ambas as células cardíacas (Fig. 3E) e as com (Fig. 3D). Porque os HANCs expressam lb e se associam seletivamente com o par Mais anterior de células cardíacas lb-positivas (figos. 3e e 4 D–F), especula-se que o estabelecimento deste contacto pode envolver interacções celulares homófilas. Testar as moléculas de adesão celular envolvidas na sinalização intercelular entre as células homotípicas (25, 26) ajudará a definir mecanismos subjacentes ao estabelecimento de conectividade entre os HANCs que expressam lb e as células cardíacas.Fig. 4. função da expressão lb cardíaca no padrão da região de saída cardíaca. (A e C) núcleo látero-dorsal vistas de 24B-GAL4>UAS-GFP (A) e Estanho-GAL4>UAS-GFP (C) embriões mostrando a GFP-revelou o perfil de expressão conduzida por estes efetor linhas. As setas apontam para a região do fluxo cardíaco. Observe a expressão GFP relativamente baixa impulsionada nesta região por Tin-GAL4. (B) Dorsolateral view of a late stage 14 24B-GAL4>UAS-eve embryo double-stained for Eve and Tin to show that the heart primordium is normally formed in the context of mesodermine Eve misexpression. (D–I) micrografos Confocais com vista lateral da parte dorsal da região da cabeça embrionária. D, F, G E I) embriões da fase 15. (E E H) embriões da fase 14. (D–I)WT(D–F), (G) diante 24B-Gal4>UASLbe, (H) 24B-GAL4>UAS-Eva, e (I) Estanho-GAL4>UASEve embriões manchado de miosina de cadeia pesada e Lbe (D, E, G, e H)ou β3-tubulina e Lbe (F e I). (D–F)InWT, o ramo principal COM (pontas de flecha abertas) liga-se ao segundo par Mais anterior de células cardíacas expressando lb. Um ramo com separado (ponta da seta amarela em E) que mostra um nível mais fraco de expressão de miosina contacta HANCs (pontas de flechas cheias). G) em embriões com expressão cardíaca ubíqua do lbe, a COM (ponta da flecha aberta) liga-se à ponta do coração e não ao segundo par de cardioblastos. COM apresenta uma forma anormal, e seus dois ramos são difíceis de detectar. O contacto anormal entre a comunicação e a ponta do coração leva ao aumento da flexão ventral da região de saída cardíaca. (H E I) nos embriões em que a expressão cardíaca do lb se esgotou ( * ), a COM (pontas de flechas abertas) estendeu-se a posteriori e foi fixada aos ganchos (pontas de flechas cheias). (Ampliação: A-C, ×200; D-I, ×350.)

para visualizar a disposição espacial da ponta da aorta, da COMS, e dos HANCs de expressão de lb, usámos a análise 3D assistida por computador e a reconstrução de scans confocais. Esta abordagem confirmou plenamente as nossas observações revelando que, além de HANCs, a região do fluxo cardíaco está firmemente ligada a um par de COMs (Fig. 3F). Estes músculos sobrepõem a ponta do coração de ambos os lados e contribuem para a sua flexão ventral.para entender como o contato entre coração, COMs e HANCs é estabelecido durante o desenvolvimento, monitoramos estas estruturas no início e no final do estágio 14 embriões (Fig. 3 G E H). Os nossos dados indicam que tanto as células cardíacas lb-positivas como as hancs que expressam lb atraem comunicações extensas.

O contacto entre COMs e HANCs parece preceder ligeiramente a ligação da COM à extremidade da aorta e é visto no início da fase 14 (Fig. 3G). Na época, os filópodes de COM estendem-se na direção das células cardíacas lb-positivas (Fig. 3G) e ficar definitivamente ligado a estas células na fase final 14 no início da fusão cardíaca (Fig. 3H). Como as COMs entram em contato com as células cardíacas e HANCs antes que os HANCs se apegem ao coração, especula-se que as COMs, além de dobrar a ponta do coração, facilitam o seu contato com HANCs. O estabelecimento de contacto entre os músculos somáticos e os seus locais de ligação epidérmica (células dos tendões) foi extensivamente estudado (27), revelando o papel fundamental da Risca do factor de transcrição do zinco (28) e uma proteína de ligação ao ARN (29). Nós usamos ambos os marcadores para testar se os HANCs e células cardíacas aos quais as COMs anexam exibem propriedades das células do tipo tendão. A rotulagem dupla realizada em embriões WT com anti-Lbe/anti-risca e em embriões how-lacZ com anticorpos anti-Lbe/anti-LacZ revelou que os HANCs e as células cardíacas em contacto COM o receptor não expressam marcadores de células de tendões (dados não apresentados). Este achado indica que as células lb-positivas atraem COMs usando um mecanismo diferente do usado pelas células dos tendões. Os candidatos mais interessantes para guiar as COMs são a fenda de proteínas secretadas possuindo os motivos de ligação de múltiplas proteínas e seus receptores Robo e Robo2 (30). Slit e Robo emergiram recentemente como componentes fundamentais que controlam os processos de atração e repulsão durante a morfogênese dos músculos somáticos (31), sugerindo que eles também podem estar implicados na atração de COM.

As células cardíacas com maior expressão de lb Anterior desempenham um papel Central no padrão da região de saída cardíaca. A observação que ambos COMs e HANCs optaram por se anexar às células cardíacas lb-positivas mais anteriores nos levou a testar se a desregulamentação da expressão lb dentro do coração poderia influenciar o padrão da região de saída cardíaca. Para realizar este teste, usamos o sistema de expressão alvo Gal4/UA (16). Duas linhas efetoras diferentes de GAL4, 24B-GAL4 e Tin-GAL4, foram usadas (Fig. 4 A E C). A linha 24B-GAL4 permite a expressão focalizada em todas as células cardíacas e musculares(Fig. 4A) com um nível de expressão uniforme e elevado nas células cardíacas mais anteriores(seta na Fig. 4A). A linha Tin-GAL4 (amavelmente fornecida por R. Bodmer) induz a expressão de UA transgene seletivamente em quatro cardioblastos em cada hemisegmento (estes incluem as células lb-positivas), mas o nível de indução nas células cardíacas mais anteriores é menor (seta na Fig. 4C) do que a linha 24B-GAL4. Para expandir a expressão cardíaca de lb, ambas as linhas efetoras GAL4 foram cruzadas com a linha UAS-lbe. A expressão cardíaca de lb ectópica impulsionada pela linha Tin-GAL4 era mais fraca do que a expressão lb endógena no coração, e não foram observadas alterações óbvias induzidas pelo ganho de função no padrão da região de saída cardíaca (dados não apresentados). Em contraste, os embriões 24B-GAL4>UAS-lbe mostraram uma expansão marcada da expressão lb dentro do coração (Fig. 4G), levando ao contato anormal das COMs com a ponta do coração. Mais precisamente, descobrimos que as COMs se ligam diretamente às células cardíacas mais anteriores que formam o fluxo cardíaco (asterisco na Fig. 4G) e não ao segundo par de células cardíacas como no WT(Fig. 4D). A conexão alterada das COMs resulta muito provavelmente dos sinais atraentes ectópicos gerados pela expressão cardíaca aumentada de lb. Como consequência, a flexão ventral da parte mais anterior do coração foi mais pronunciada(compare Fig. 4 D E G). Nós também notamos uma morfologia alterada de COMs (ponta de flecha aberta no Figo. 4 D E G), que pode resultar da expressão muscular ectópica de 24B-GAL4 da lb. O contacto entre HANCs e células cardíacas não foi afectado pelas condições experimentais de misexpressão. Para testar se a expressão cardíaca de lb é necessária para a atração de COMs, aproveitamos a influência regulatória negativa anteriormente descrita de even-pulated (eve) que é capaz de reprimir especificamente lb em células cardíacas (5). Novamente, as linhas efetoras 24B-GAL4 e Tin-GAL4 foram usadas para conduzir a expressão de EVA dentro do coração. Descobrimos que ambos os motoristas cruzaram com a linha EVA-UA (Tin-GAL4 com menor penetração) levando à repressão da atividade lb dentro do coração (Fig. 4 H E I). Apesar dos defeitos de misespecificação, primórdios cardíacos são formados normalmente no ganho UA-eve de embriões de função (ref. 5 e Fig. 4B), permitindo-nos monitorar COMs e HANCs em um contexto em que a expressão cardíaca de lb está esgotada. Os nossos dados mostram que em embriões com lb esgotado (ver a ausência de expressão lb cardíaca na Fig. 4 H E I) as comunicações não se ligam à ponta do coração. Observamos que as COMs se estenderam a posteriori e se apegaram a HANCs invaginantes (Fig. 4 H E I), que não são mais capazes de ancorar corretamente a ponta do coração. O principal ramo de COM que normalmente se liga à região de saída cardíaca (compare Fig. 4 E E F com H E I) estava ausente ou fundida com o ramo HANC-anexando. Assim, acreditamos que a forma anormal da COM e uma perda completa de seu contato com a ponta do coração são causadas pela depleção cardíaca de lb. Este pressuposto é apoiado pelo facto de os mesmos fenotipos terem sido observados em embriões com expressão de EVA ectópica (impulsionada por estanho-GAL4) e cardíaca mais muscular (impulsionada por 24B-GAL4) (compare Fig. 4 H E I). O contacto e posicionamento alterados da COMs apareceram em embriões em fase final 14, quando a cadeia pesada da miosina ainda não é detectável em cardioblastos (Fig. 4 E E H). A análise dos embriões da fase 15 revelou, além disso, que a perda da expressão de lb cardíaca é acompanhada pela sub-regulação da β3-tubulina (compare Fig. 4 F E I) na região de saída cardíaca, indicando que a expressão de lb no coração tem um impacto importante na morfogénese cardíaca final. Estes dados complementam relatórios recentes descrevendo papéis morfogenéticos de um membro da família de receptores COUP-TF, sete-up, expressos no par posterior de cardioblastos em cada segmento e necessários para a formação de Óstia nos segmentos abdominais A5–A7 (32, 33). Neste contexto, a demonstração do papel do lb no padrão da região de saída cardíaca aumenta a possibilidade de que nos segmentos abdominais o lb desempenha um papel semelhante no estabelecimento de contato entre as células cardíacas e os músculos alares de ancoragem cardíaca. Esta hipótese permanece por investigar.além disso, os fenótipos apresentados (Fig. 4) sugerem que a expressão lb experimentalmente esgotada dentro do coração influencia a emissão ou recepção de sinais atrativos por células cardíacas e, em consequência, leva à interrupção do contato com COMs. É provável que o mesmo atractivo muscular ou semelhante seja produzido ou recebido por HANCs lb-positivos, sugerindo assim que lb regula a expressão dos genes envolvidos no contacto célula–célula. Curiosamente, no homólogo de LB do mouse, o gene Lbx1 foi encontrado para ser necessário para a migração direcionada de um subconjunto de precursores musculares (21, 22), indicando que os mecanismos de movimento celular conservados podem existir que são controlados por genes lb.

Tomados em conjunto, através de análise de embriões em que cardíaca lb expressão foi expandida ou experimentalmente esgotado, temos demonstrado que o lb é necessária para a ligação correta do HANCs e COMs e, em conseqüência, para a devida padronização do cardíaco de escoamento da região. Este achado fornece insights sobre o significado funcional da diversificação anterior–posterior dos precursores cardíacos dentro de cada segmento do coração de Drosophila.Hancs pode representar um protótipo de Drosophila de células de crista Neural? A morfogénese do coração dos vertebrados envolve dois tipos de células diferentes, a primórdia do coração mesodérmico e uma subpopulação de células da crista neural que migram da região da cabeça. Neste artigo, temos mostrado que em Drosophila um grupo de células não-dérmicas originárias da epiderme da cabeça (que temos chamado de HANCs) contribui para a morfogênese final do coração. Como nas células da crista neural dos vertebrados, os HANCs passam por movimentos direcionados, entram em contato com as células cardíacas, e participam do padrão da região de fluxo cardíaco. Temos demonstrado que os genes homeobox lb conhecidos por estarem envolvidos na diversificação de precursores cardíacos (5, 11) são expressos em HANCs e são necessários para a sua especificação. Similarmente, o ortolog de lb, o gene Lbx1, foi recentemente encontrado para ser necessário para a especificação de um subconjunto de células da crista neural cardíaca em mouse (23), indicando que os genes lb/Lbx1 desempenham um papel conservado na especificação de componentes não-dérmicos do coração. Nesta visão, os HANCs podem realmente ser comparados com as células da crista neural dos vertebrados. No entanto, os nossos dados indicam também que o HANCs apresentar pelo menos duas características que são específicas para Drosophila apenas: (i) eles se movem como uma parte dobrada cabeça ectoderm e não como delaminated células da crista neural; e (ii) eles formam um complexo funcional com COMs, que não têm homólogos estruturas em vertebrados. Assim, análises adicionais são necessárias para elucidar o papel exato de HANCs e suas potenciais funções de crista neural.