Abstract
carbendazime, como fungicida, foi comumente usado para controlar doenças fúngicas na agricultura, silvicultura e medicamentos veterinários. Neste estudo, a toxicidade aguda e reprodutiva do carbendazime foi avaliada utilizando Caenorhabditis elegans (C. elegans) como modelo, a fim de avaliar preliminarmente os riscos potenciais deste fungicida na produção e aplicação agrícolas. Os resultados mostraram que o crescimento de C. elegans foi inibido por 0,01 µg/l de carbendazime. O tratamento de 0,1 µg/l carbendazime causou uma diminuição significativa no comportamento de locomoção e danos significativos ao sistema reprodutivo e antioxidante, fazendo com que o tempo de vida dos nemátodos seja drasticamente reduzido. Estes resultados proporcionam uma melhor compreensão do risco ambiental do carbendazime e suscitam novas preocupações em matéria de segurança.
1. Introdução pesticidas, uma espécie de reagentes químicos ou biológicos, são amplamente utilizados na agricultura para regular o crescimento das plantas e controlar doenças e pragas de insetos, o que pode promover o crescimento das culturas e melhorar o rendimento das culturas . No entanto, a utilização generalizada de pesticidas conduzirá a diferentes graus de resíduos em culturas ou alimentos, afectando assim a saúde humana . Os problemas dos resíduos de pesticidas não só atraíram grande atenção para os consumidores, como também se tornaram um dos factores-chave que afectam a segurança alimentar .carbendazime, como fungicida de largo espectro, tem sido usado para controlar doenças fúngicas na agricultura, silvicultura e medicamentos veterinários . No entanto, o carbendazime é classificado na categoria perigosa de produtos químicos pela Organização Mundial de Saúde e foi classificado na lista prioritária de produtos químicos perturbadores do sistema endócrino pela Comissão Europeia . Nos últimos anos, é óbvio que o uso generalizado de carbendazime com excesso de gama e overdose e o fato de que o carbendazime é difícil de ser degradado, ambos levam ao problema dos resíduos de carbendazime na agricultura . Embora o efeito tóxico do carbendazime tenha sido relatado desde a década de 1980, a toxicidade do carbendazime torna-se um tópico quente devido à crescente preocupação com os desreguladores endócrinos ambientais . O carbendazime foi proibido em vários países devido aos seus impactos negativos no ambiente e na saúde, tais como distúrbios de desenvolvimento e reprodução, toxicidade e mutagenicidade . Os efeitos adversos do carbendazime nos parâmetros bioquímicos, histopatológicos e hematológicos do fígado, rim e glândulas endócrinas, bem como nos seus níveis hormonais, foram ilustrados em ratos . Além disso, necessita de mais estudos sobre a baixa concentração devida aos resíduos de carbendazime.Caenorhabditis elegans (C. elegans), como um importante modelo de pesquisa, é amplamente usado para fazer alguma avaliação. De acordo com Amrit et al. , C. elegans tem muitas vantagens, tais como tamanho pequeno, tempo de geração rápida, fácil de cultura em laboratório, e curta vida adulta. C. elegans foi escolhido neste estudo como organismo modelo para avaliar a toxicidade de baixa concentração de carbendazim, que pode ser considerado como um valor de referência para a aplicação de carbendazim na agricultura.2. Materiais e métodos
2.1. Produtos químicos e estirpes
carbendazime (Pureza ≥ 99%; Aladdin® Biochemical Technology Co., LTD, Xangai, China) foi dissolvida em N, N-dimetilformamida (DMF; Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD, Xangai, China) para produzir 1 g / l carbendazime solução original. As concentrações de DMF foram de 0,1% nas soluções de exposição final.(0.01, 0.1, 1, 10, 100 µg / L). 0, 1% DMF sem carbendazime era o grupo de controle. C. elegans (wild-type N2) foi originalmente obtido do Caenorhabditis Genetics Center (University of Minnesota, MN, USA). Os nemátodos foram cultivados em placas de meio de crescimento de nemátodos (NGM) que foram semeadas com Escherichia coli OP50 a 20°C, como descrito . L1-larval C. elegans were collected by washing the gravid nematodes with a bleaching mixture (1 m NaOH, 10% NaHOCl).
2, 2. A letalidade
Carbendazim soluções originais (1 g/L) foram diluídos com S líquido médio (1.12 g K2HPO4, 5.92 g de KH2PO4, e 5,85 g de NaCl foram diluídos em 1 L de água) para obter o final carbendazim concentrações de 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, e 1 mg/L, que contém 0,1% de DMF. S líquido médio com 0,1% DMF foi o grupo de controle. 30 nemátodos (L4) foram testados em placas de 96 alvéolos para cada concentração. A sobrevivência dos nemátodos foi contada sob um microscópio após a cultura durante 24 horas na incubadora. O processo do ensaio baseia-se no método de Xiang et al. . Foram necessárias três experiências paralelas.
2, 3. Comportamento de locomoção
pelo menos 10 C. elegans (L4) foram escolhidos aleatoriamente a partir de cada concentração para determinar o comportamento da Locomotiva, que foi registrado tanto pela frequência de corte da cabeça e os tempos de curvatura do corpo . O número de freqüência de ponta-cabeça foi contado por mudanças na direção de flexão no corpo médio de C. elegans em 1 min. A medição da curva do corpo foi definida como o tempo de mudança de direcção da parte dos nemátodos cultivados em NGM sem E. coli OP50 nos 30 s.
2, 4. Foram analisados os ensaios de crescimento e desenvolvimento
C. elegans expostos ao carbendazime durante 24 horas. O comprimento do corpo dos nemátodos expostos ao carbendazime foi avaliado pelo software Image J. A descendência de cada C. elegans from L4 larvae to day 1 was recorded at the L3 stage after individually transferring to a new plate every day until reproduction ceased . Foram realizados pelo menos três testes paralelos.
2, 5. A análise da vida útil
todos os C. elegans testados para a vida útil foram cultivados na mesma condição a 20 ° C. Os C. elegans sincronizados foram cultivados em placas NGM com diferentes concentrações de carbendazime até o dia 4. Os nemátodos testados seriam então transferidos para novas placas NGM a cada 2 dias. Sobrevivência e morte C. elegans were recorded daily (beginning on the first day of adulthood) until all nematodes for each concentration had died . Foram realizados pelo menos três testes paralelos.
2, 6. A determinação da lesão oxidativa
ROS intracelular foi medida com diacetato de 2′,7′-diclorodifluorosceína (H2DCFH-DA), que é a sonda de detecção de oxigénio reactiva mais comum e sensível de longe. O tipo selvagem N2 C. elegans foi lavado em tampão M9 e, em seguida, rompido ultrassonicamente. O sobrenadante foi analisado o nível ROS seguindo a instrução do kit ROS. A concentração final de trabalho de H2DCHE-DA FOI de 10 μΜ . Os comprimentos de onda de excitação e de absorção de emissões foram de 485 nm e 535 nm, respectivamente. Foram realizados pelo menos três testes paralelos.
superóxido Total intracelular dismutase (T-SOD) foi determinado de acordo com as instruções do kit T-SOD comprado ao Instituto de Bioengenharia de Nanjing Jiancheng. Depois de lavados com M9 três vezes, os nemátodos examinados foram rompidos ultrasonicamente e reagiram com um kit T-SOD. O comprimento de onda da absorvância foi de 550 nm. Além disso, o sobrenadante foi utilizado para detectar o nível de proteínas para cada concentração, no qual o comprimento de onda da absorvância era de 595 nm. Foram realizados pelo menos três testes paralelos.
2, 7. Análise de dados
todos os dados foram dados como erro médio ± padrão da média (SEM) usando uma ANOVA de Sentido Único. Grafos foram apresentados usando origem 8.5 e GraphPad Primer 7, e análise estatística foi realizada usando o software SPSS 19.0. O nível de significância estatística foi realizado usando e .
3. Resultados
3.1. Determinação do comportamento de locomoção de C. elegans after Carbendazim Acute Exposures
LC50C. elegans were exposed to carbendazim for 24 hours to assess its acute toxic effects. Data are represented as shown in Table 1, and the obtained linear fitting equation was y = 2.180x − 0.223 through data analysis. The obtained LC50 is 0.867 mg/L.
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Next, we assayed the determination of the locomotive behavior of C. elegans after carbendazim acute exposures by analyzing the data about head-thrash frequency and body-Flector times of nematodes(Figures 1(A) and 1 (b)). Ambos apresentaram reduções significativas nas concentrações de carbendazime que variaram entre 0, 01 µg/L e 100 µg/L (). Adicionalmente, os batimentos de cabeça de nemátodos expostos a 100 µg/L diminuíram para 68,27%. Para o ensaio de curvas corporais, quando as concentrações de carbendazime foram de 10 µg/L e 100 µg/L, teve um efeito inibitório significativo nas curvas corporais de C. elegans em 36,77% e 35,48%, respectivamente, em comparação com o ensaio de controlo.
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3, 2. Determinação do crescimento e desenvolvimento de C. elegans depois de Carbendazim sobre as Exposições Agudas
em Comparação com o grupo controle (Figuras 1(c) e 1(d), comprimento do corpo e a área de superfície corporal foram significativamente () reduzida de exposição de grupos de 0,01 µg/L para 100 µg/L. Ambos foram diminuiu 19.16% e 22.15% no tratamento de 0,01 µg/L, em comparação com o grupo controle, respectivamente. A concentração de 10 µg/L apresentou os impactos mais negativos, e que o comprimento do corpo e a área de superfície corporal de C. elegans foram diminuiu 35.21% e 65.22% em comparação com o grupo controle, respectivamente.
3, 3. Determinação das castas Tamanhos de C. elegans, depois de Carbendazim sobre as Exposições Agudas
de Acordo com a Figura 2, ninhada tamanhos de nematóides teve uma diminuição significativa () no tratamento de grupos de 0,1 µg/L para 100 µg/L. ninhada tamanhos de C. elegans diminuiu mais significativamente, o que diminuiu a 43.71% com o tratamento de 10 µg/L, em comparação com o grupo controle.
3, 4. A determinação do tempo de vida de C. elegans após a exposição aguda do carbendazime
C. A duração de vida de elegans foi significativamente inibida por 0,01 µg/l a 100 µg/l de carbendazime de acordo com a curva de vida apresentada na Figura 3. Os resultados apresentaram que o tempo de vida de C. elegans diminuiu de 24 para 20 dias com o tratamento de 0, 01 µg/l carbendazime. O tempo de vida dos nemátodos tratados com 0, 01 µg/l carbendazime foi reduzido em 20, 00%. Quando a concentração de exposição ao carbendazime foi de 100 µg/L, O tempo de vida de C. elegans foi reduzido em 45,83%.
3, 5. Os efeitos da exposição aguda ao carbendazime no sistema antioxidante de C. elegans
os níveis de controlo da ROS e de C. elegans tratados à exposição ao carbendazime de diferentes concentrações são apresentados na Figura 4 a). Foi indicado que o nível de ROS intracelular foi significativamente aumentado () em intervalos de 0, 01 µg/L a 100 µg/L carbendazime. Em comparação com o controlo, o nível de MDE aumentou, no máximo, 70, 60% com o tratamento de 10 µg/L. De acordo com os resultados dos níveis intracelulares de SOD, registou um aumento de 0 no tratamento.01 µg / L a 100 µg / l carbendazime [Figura 4 b)]. O nível de SOD foi aumentado em 10, 70% com 0, 1 µg/l de carbendazime em comparação com o grupo de controlo.
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4. Discussão
carbendazime, como os fungicidas, é amplamente utilizado na agricultura para inibir o crescimento do fungo. O carbendazime foi proibido de utilizar na Austrália, na maior parte da União Europeia e nos EUA devido à sua toxicidade grave e persistência . Para este estudo, foi a primeira vez que se usou C. elegans as the model organisms to evaluate the effects of carbendazim on locomotive behavior, growth and development, reproduction, lifespan, and antioxidant systems. Além disso, os resultados mostraram que teve uma influência negativa sobre C. elegans.
de acordo com a 24 h-CL50, a concentração de toxicidade aguda de C. elegans exposta a diferentes concentrações de carbendazime é de 0,867 mg/L. A CL50 de 96-h de carbendazime em resposta ao peixe-zebra foi ilustrada como 1, 75 mg / L. Os ovos da carpa Prussiana Carassius gibelio mostraram os efeitos tóxicos na concentração de 0,036 mg /L. Estudos apresentaram que o crescimento e desenvolvimento de Navicula sp. é inibido pelo carbendazime com um valor de 24 h-EC50 de 2, 18 mg/L. embora a taxa de crescimento das algas seja recuperada após exposição a 72 h, o teor de clorofila-a permanece significativamente diminuído quando o tratamento do carbendazime foi superior a 0, 5 mg/L. Neste presente, C. elegans expostos a uma baixa concentração de carbendazime foram selecionados para avaliar seus efeitos dependendo da concentração real da exposição diária humana. Concentrações baixas de carbendazime não significam que seja seguro. O carbendazime mostra impactos biológicos negativos em doses muito mais baixas em alguns estudos.
comportamento locomotiva foi avaliado para avaliar a neurotoxicidade de C. elegans (larva L4) após exposição 24-h ao carbendazime. Os resultados mostraram que o carbendazime poderia ter efeitos negativos no comportamento das locomotivas através da detecção de batidas na cabeça e flexão do corpo de C. elegans, que ambos eram mais sensíveis ao grupo de maior exposição. O comportamento locomotivo dos embriões de peixe zebra expostos ao carbendazime é sensível . Estudos anteriores demonstraram que os peixes têm um comportamento anormal quando as concentrações subletais do carbendazime são de 0, 22–0, 43 mg/L.as malformações no desenvolvimento podem também ser uma das razões para uma locomoção anormal . O crescimento e desenvolvimento de C. elegans foram assentados em nosso estudo. Os resultados mostraram que o comprimento do corpo e a área corporal de C. elegans foram significativamente reduzidos no tratamento superior a 0, 01 µg/l carbendazime. O crescimento normal dos vertebrados está relacionado com a homeostase metabólica da hormona tiroideia . Williams et al. indicaram que o carbendazime pode causar perda de esperma após implantação, malformação fetal e crescimento e desenvolvimento lentos.
A toxicidade reprodutiva do carbendazim foi demonstrado que carbendazim, pode inibir a microtubule polimerização de fungos e células de mamíferos, causando a interrupção de microtubule assembleia agindo com β-tubulina, o que resulta em prejudicar a segregação dos cromossomos no processo de divisão celular . A formação de microtúbulos por ligações não – casovalentes de α-e β-tubulina é responsável pela segregação cromossómica no processo de mitose e meiose . O tamanho da ninhada de C. elegans diminui significativamente na concentração de 0, 1 µg/L de carbendazime. Verificou-se que o carbendazime afecta os sistemas de reprodução das codornizes e hamsters japoneses . Concluiu-se que o tempo de vida de C. elegans diminuiu significativamente com a concentração de carbendazime ≥0,01 µg/L, com base no nosso estudo. Estudos têm mostrado que o carbendazime levou à infertilidade e toxicidade no desenvolvimento e manifesta toxicidade embrionária, apoptose de células germinais e teratogênese em diferentes espécies de mamíferos .a apoptose é uma complexa morte celular programada, que é um fenômeno altamente regulado caracterizado por uma série de processos celulares . Muitos estudos têm apresentado que a produção de ROS induzida pelo estresse oxidativo está relacionada com a morte de células apoptóticas . Nosso estudo descobriu que o carbendazime poderia induzir um aumento significativo no nível de valores ROS e um pequeno aumento no nível de valores SOD. O estresse oxidativo causado pela poluição ambiental induz o aumento da expressão de ROS e, posteriormente, danifica o sistema de defesa antioxidante . A SOD é responsável pela desintoxicação dos radicais livres tóxicos e das suas actividades, que é utilizada para avaliar o nível de stress oxidativo e o estado antioxidante celular . A METALLOENZIMA SOD acelera a transformação dos radicais de superóxido citotóxico endógeno em H2O2, e o aumento dos níveis de expressão de SOD pode contribuir para melhorar as actividades enzimáticas, a fim de eliminar os radicais de superóxido induzidos pelo carbendazime e prevenir a ocorrência de disfunção celular durante a exposição do carbendazime . Concentrações de exposição mais elevadas de carbendazime podem causar stress oxidativo grave, que subsequentemente destrói o equilíbrio da homeostase celular e promove a apoptose . No entanto, o carbendazime em baixas concentrações ainda pode danificar significativamente o sistema reprodutivo de acordo com os nossos resultados.
5. Conclusion
tanto quanto sabemos, o presente estudo avaliou a segurança do carbendazime exposto a C. elegans pela primeira vez. It demonstrated that carbendazim could have a harmful effect on the locomotive behavior, development and growth, reproduction, lifespan, and antioxidant system of C. elegans. Espero que ele precisa prestar mais atenção à aplicação do carbendazime com base nos resultados. Além disso, a segurança da utilização do carbendazime deve ser avaliada mais aprofundadamente, em especial a toxicidade da bioacumulação e os potenciais efeitos genotóxicos.
disponibilidade de dados
todos os dados gerados ou analisados durante este estudo estão incluídos neste artigo.
conflitos de interesses
os autores declaram que não têm conflitos de interesses.
reconhecimentos
esta investigação foi apoiada pela National Natural Science Foundation of China (31501569).
