introdução

carcinoma hepatocelular (HCC), que representa o maior subtipo histológico de cancros hepáticos primários, é o quinto cancro mais frequente em todo o mundo e a terceira principal causa de mortalidade cancerosa (1,2). As taxas mais elevadas de cancro do fígado encontram-se nos países em desenvolvimento, especialmente na Ásia Oriental/Sudeste e na África média/Ocidental,enquanto as taxas são baixas no centro-sul, na Ásia Ocidental, No norte e no leste da Europa (3). A alteração genética e os factores de alto risco epigenetich,tais como infecção crónica com VHB ou VHC, cirrose hepática, doença hepática alcoólica e aflatoxinas, explicam a elevada morbilidade da HCC (4-6).No entanto, o mecanismo molecular acompanhado por hepatocarcinogénese e progressão ainda é muito pouco claro.Assim, é fundamental para nós esclarecer a etiologia e investigar a alteração vitalmente molecular subjacente iniciação e progressão hepatocelularcarcinoma, e, em última análise, melhorar nossos conceitos atuais para diagnosticar, triagem e tratamento desta doença.

Durante o processo de hepatocarcinogenesis, theabrogation do ciclo celular pontos de verificação é uma importante marca thatmay promover câncer de formação (2).Como um dos reguladores do ciclo celular de ponto de verificação, celldivision ciclo de 20 (CDC20) parece agir como regulador proteininteracting com a anafase-promover complexo/cyclosome (APC/C)do ciclo celular, que é necessário para anafase iniciação andlate mitose saída de (7,8). Dois factores regulamentares, O CDC20 e o Cdh1, ligam-se directamente à APC e activam a sua actividade de ubiquitinação das ciclinas durante a mitose e a fase G1 (9,10).Foi relatado que a proteína 80(RAP80) associada aos receptores, que recruta a BRCA1 em locais de danos ao ADN na Via de sinalização ubiquitin induzida por danos ao ADN, pode ser degradada pelo complexo de promoção da anafase (APC/c-Cdc20) ou (APC/c-Cdh1) através da poliubiquitinação durante a mitose até à fase G1 (11). A depleção do RAP80 mostrou um controlo eficaz do ponto de controlo de fase G2-M e promoveu a progressão do ciclo mitoticcell.a expressão CDC20 pode ser notavelmente suprimida pela p53proteína, que inibe a transformação maligna através da regulação do ciclo celular, senescência celular e genes relacionados com apoptose(12). Foi notificada uma elevada expressão de Cdc20 em vários tumores malignos, incluindo adenocarcinoma pancreaticctal (13), carcinoma de células oralsquâmicas, cancro gástrico (14), cancro do colo do útero (15) e várias células cancerígenas (14,16).No entanto, o padrão de expressão do CDC20 e a sua significação clínica no carcinoma hepatocelular humano não foram enclarificados.

neste estudo, analisando o conjunto de dados de microarray(n ° de adesão). GSE14520) from Gene Expression Omnibus (GEO)database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), we found that Cdc20 was the major node in HCC molecular interaction networks. Os Weexamined the expression level of CDC20 in primary HCC and adjacent non-tumoral tissues, and evaluated its clinicopatologic significance in 132 archived HCC samples. O efeito da redução do Cdc20por siRNA no crescimento e no ciclo celular das células cancerígenas do fígado foi também investigado. As nossas conclusões sugerem que o CDC20 pode desempenhar um papel significativo no desenvolvimento do HCC.

materiais e métodos

análise Bioinformática

microarray dataset GSE14520 (17) foi baixado da GEO. Neste estudo foi utilizado um total de 183 CCO e 179 tecidos para-carcinoma correspondentes, que foram esterilizados com Affymetrix U133A GeneChips de coorte 2 doentes chineses. Os dados de análise de expressão genética foram re-resumidos utilizando o método RMA (18) e os ficheiros CDF centrados no gene(19) (em vez dos ficheiros CDF originalAffymetrix), que filtraram sondas não-específicas nos gegenechips e fundiram múltiplos conjuntos de sonda representando o gene sameEntrez num único conjunto de sonda. Foi realizada uma análise de significância do microarray(SAM) (20) paraidentificar genes diferentes entre o HCC e os tecidos do carcinoma da face correspondente. Delta foi definido para 2,25, e o limiar ofFDR foi definido para 0,001. Foram estudados Genes sobreexpressos em HCC que foram expressos em mais de 50 tecidos HCC, mas menos de 10 tecidos para-carcinoma correspondentes. Os genes foram posteriormente analisados com o GenCLiP software (21) (http://ci.smu.edu.cn) para anotar funções genéticas e estruturar redes de interacção molecular.as amostras clínicas foram utilizadas apenas para fins de investigação. A aprovação foi obtida do Comitê de Ética do Hospital Geral de ChinesePLA (LREC 2012/40). Todas as amostras foram recolhidas sob a condição de um consentimento prévio por escrito dos pacientes.

doentes e amostras de tecidos

dezasseis pares de HCC frescos e não-tumortissos adjacentes utilizados para a análise da PCR em tempo real e da Western blot foram seleccionados durante a cirurgia do Hospital Geral da PLA Chinês(Pequim, China) de novembro de 2012 a fevereiro de 2013. Os tecidos foram congelados em nitrogénio líquido até à sua utilização. A parafina, o HCC arquivado e os tecidos não tumorais adjacentes utilizados para aimunohistoquímica (IHC) foram obtidos a partir de 132 doentes com HCC, em que a ressecção do fígado do sounderwent foi parcial no mesmo hospital entre janeiro de 2006 e dezembro de 2007.
= = ligações externas = =

cultura de células

uma linha normal de células hepáticas (LO2) e três linhas celulares HCC (HepG2, SMMC7721, Huh7) foram compradas da coleção de tipologias Americanas (ATCC, Manassas, VA) ou do banco de células da Academia Chinesa de ciência e tecnologia e foram mantidas no Instituto de biotecnologia, Academia de ciências médicas militares. Todas as células weremaintained em Dulbecco modificado Eagle medium (DMEM, Invitrogen,CA) suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS, Gibco, Carlsbad,CA) e 2 mM de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina, 100 µg/mlstreptomycin a 37°C com 5% de CO2.a extracção de ARN, a síntese de cDNA e a análise PCR a tempo real foram extraídas de linhas celulares e amostras de tecido utilizando reagente de TRIzol (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Um total de 2 µg de RNA foi revertetranscrito usando o Kit de síntese TransScript e cDNA da transgênica Biotech (Pequim, China). Real-time PCR was performed toexamine CDC20 mRNA level in cell lines and tissue samples by usinga Bio-Rad iQ5 Multicolor Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad,Hercules, CA). β-actin was used as an internal control fornormalization. PCR primers were designed using the Primer Premier 5software and the sequences were: CDC20 forward,5′-TCGCATCTGGAATGTGTGCT-3′; and reverse,5′-CCCGGGATGTGTGACCTTTG-3′; β-actin forward,5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′; and reverse, 5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′. Os dados de expressão foram normalizados para a média geométrica do gene de limpeza β-actina e calculados com ΔΔCt (22) e os resultados foram expressos com 2−ΔΔCt.

Western blot analysis

Western blot analysis was performed under thestandard protocol. A electroforese em gel SDS-poliacrilamida (10%) foi utilizada para separar a proteína que foi então electrotransferida do gel para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF). Após reconstituição com 5% de leite magro seco durante 1 h, a membrana foi incorporada com anticorpo policlonal CDC20 anti-humano do coelho (1: 1000, tecnologia Bioworld, St. Louis Park, MN) por 1 h no roomtemperature. O anticorpo monoclonal Da α-tubulina anti-humana do Rato (1: 5 000; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) foi utilizado como controlo interno. Após lavagem com solução salina tamponada Tris-tamponada com tbst entre-20 (tbst) três vezes, a membrana foi incubada com anticorpos secundários conjugados com peroxidase-rábano (diluição 1:5000). A detecção quimioluminescente foi realizada com o Substratekit (Millipore Corporation, Billerica, MA) do Immobiluminescent Western Chemiluminescent HRP.a imunohistoquímica (IHC) e a imunohistoquímica para a expressão CDC20 na HCC e as amostras não tumorais adjacentes foram realizadas utilizando métodos padrão.Brevemente, as secções dos tecidos foram incubadas com anti-Cdc20dilutadas de coelho 1:200 (tecnologia Bioworld) durante a noite a 4°C. A serumalbumina bovina (1%; BSA) sem anticorpos primários foi utilizada como controlo negativo. O anticorpo IgG anti-coelho (ZSGB-Bio, Pequim, China)secundário poli-rábano peroxidase (HRP) foi incubado à temperatura ambiente durante 20 minutos.

Todas as secções imunotentadas foram revistas e sublinhadas de forma independente por dois patologistas, sem conhecimento da informação clinicopatológica, com base no método da pontuação H, que considera a intensidade da coloração em conjunto com a percentagem de células a coloração positiva (23,24).Para o método da pontuação H, 10 campos foram escolhidos aleatoriamente em ×400magnificação. A intensidade de coloração nas células foi marcada como 0,1, 2 e 3, correspondendo à coloração negativa, fraca, intermédia e forte, respectivamente. Em cada campo foi contado o número total de células e células manchadas a cada intensidade. A pontuação H foi calculada de acordo com a fórmula: (% das células coradas na categoria de intensidade 1×1) + (% das células coradas na categoria de intensidade 2×2) + (% das células coradas na categoria de intensidade 3×3). O h-aumentou de 0 a 300, tendo 300 representado 100% das células com corrente forte (3+) (24). Alta expressão de Cdc20 foi definida como manchas h de células ≥200.supressão do CDC20 por pequeno interferingRNA (siRNA) RNA de cadeia dupla, pequeno interferente (siRNA) wassynthesized and purified by GenePharma (Shanghai, China). Asubsequências correspondentes à região de codificação do cdc20humano foram: sense, 5 ‘- GGAGCUCAUCUCUCAGGCCA UUU-3′; antisense, 5′-AUGGCUGAGAGAUGUCUCCUUU-3’. Um não-alvo codificado siRNA foi usado para o controle negativo. Estas siRNAs foram dissolvidas em água de pirocarbonato de indietilo (DEPC) para atingir uma concentração de 20µM. Cancro do fígado as células HepG2 foram tratadas com siRNA de controlo ornegativo CDC20 siRNA em 20 nM utilizando o reagente de transfecção Interferina invitro siRNA (transfecção Polyplus, NewYork, NY).foram utilizados PCR Quantitativos em tempo real e analises western blot para detectar o efeito de interferência do siCDC20. As células que não foram tratadas ou tratadas com controlo negativo sirnaoligonucleótidos foram os grupos de controlo.ensaio de proliferação celular

dois frascos de plástico de 25 cm2 foram eachinoculados com 2×105 células cancerígenas do fígado (HepG2), que foram depois transferidos com 20 nM de controlo negativo siRNA e CDC20siRNA, respectivamente, para incubação de 48-h. Em seguida, as células foram digitalizadas e semeadas em placas de 6 alvéolos contendo 2 ml de meio por alvéolo.Posteriormente, as células de um poço foram digeridas e contadas pelo contador de células automatizado (Invitrogen) a cada 24 horas até o quinto dia.após tratamento com 2 µg/ml de timidina (Sigma-Aldrich, St.Louis,MO) durante 24 horas, colheram-se células em células com o reagente de transfecção sirna interferina in vitro, durante 48 horas, após tratamento com 2 µg / ml de timidina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) durante 24 horas. 0, 3, 6, 9, 12- h após a remoção da timidina do meio e fixada com 70% de álcool.Antes das análises, as células foram lavadas com PBS, tratadas com 1 mg/mlRNase a 37°C durante 30 minutos e depois manchadas com iodeto de propídio(PI). Análises foram realizadas por BD FACSCalibur (Becton-Dickinson,Franklin Lakes, NJ) e os resultados foram analisados por WinMDI Versão 2.9 software.

análises estatísticas

Todas as análises estatísticas foram feitas usando o pacote de software estatístico IBMSPSS 20.0. A análise de Sentido Único da variância (ANOVA) foi utilizada para comparar a expressão do cdc20 mrnanormalizada a β-actina em linhas celulares. O mesmo método foi também operado na comparação da diferenciação histológica em tumores normalizada com amostras hepáticas normais. As comparações de dados em dois grupos foram realizadas pelo teste t do aluno. O teste χ2 foi utilizado para analisar a relação entre a expressão CDC20 e as características cíclicas. Correlações bivariadas entre variáveis foram calculadas pelos coeficientes de correlação de Spearman.O nível de significância estatística foi definido em P<0,05 para todos os testes.

Resultados

CDC20 é o grande nó no HCC molecularinteraction redes

SAM análise identificou 4,358 genes overexpressed inHCC, em que 137 genes foram expressos em mais de 50 CHC tecidos,mas em menos de 10 de para-carcinoma de tecidos. GenCLiP análise showedthat entre os 137 genes, 72 genes relacionados ao ciclo celular(P=1.238 e-15, pelo teste χ2), 19 de genes relacionados tospindle de montagem (P=2.172 de e-55, pelo teste χ2), e 26 geneswere relacionadas com o cromossoma segregação (P=5.472 e-55, byx2 teste). Entre as redes moleculares construídas com 137 genes, o CDC20 foi o principal nó que não foi anteriormente relatado estar relacionado com o HCC. Nove genes (NEK2, E2F1,BUB1, BUB1B, AURKB, CCNB1, CCNB2, UBE2C e CDKN2A) são conhecidos tointeract com CDC20, em que 7 genes relacionados com spindleassembly de ponto de verificação (SAC) (Fig.1). O objectivo do CCD é o CDC20 (25). Assim, inferimos que em HCC,a sobreexpressão do CDC20 leva à ausência de SAC, e células rapidlybecome aneuploid.

CDC20 é sobre-expresso em HCC

PCR quantitativa em tempo real foi usado para examinar o nível de CDC20 em três linhas celulares HCC (HepG2, SMMC-7721 e Huh7), e uma linha normal de células hepáticas (LO2). O nível de mRNA CDC20 foi mais elevado em todas as três linhas celulares HCC do que na linha normal (Fig. 2).

A fim de determinar se a regulamentação do ccdc20 nas linhas celulares de HCC é semelhante em doentes com HCC, realizámos uma PCR quantitativa em tempo real em 16 pares de HCC e tecidos hepáticos normais adjuntos. Como mostrado na Fig.3A, verificou-se que o CDC20 foi sobreexpressado diferencialmente em 14 de todas as amostras de HCC primárias humanas examinadas em comparação com amostras não cancerosas dos mesmos doentes. Além disso, a razão tumor/não-tumor(T/NT) da expressão mRNA CDC20 foi pelo menos >2 vezes em todas estas 14 amostras upreguladas, e a maior proporção foi até cerca de 40 vezes. O nível de proteínas do CDC20 foi confirmado em todas as 16 amostras de tecido emparelhadas pela análise western blot. O software Image J1. 47v foi usado para quantizar o nível cinza de cada banda e calcular a razão CDC20 T/NT de cada paciente normalizando com a-tubulina. Os resultados revelaram que todas as amostras de HCC examinadas apresentavam um nível de expressão mais elevado de proteína CDC20, excepto a amostra 1 e a amostra 4, o que era consistente com o nível de mRNA (Fig. 3B). Estes resultados indicaram que o ccdc20 foi frequentemente regulado em tecidos ou células do HCC.

Imunohistoquímica coloração de CDC20protein

a Imunohistoquímica (IHC) foi realizada para analyzethe a expressão da proteína e localização de CDC20 em 132paraffin-incorporado arquivados CHC amostras de tecidos, incluindo 14 casesof bem diferenciados, de 78 casos de moderada diferenciados e 40cases de pobres diferenciados tumores. A proteína CDC20 foi upregulada (pontuação h ≥200) em 90 (68, 18%) de 132 tecidos de HCC. Como mostrado no inFig. 4A, altos níveis de CDC20 foram presentes em lesões primárias de HCC e a coloração positiva mainlocializada em citoplasma e núcleos. Em contrapartida, o CDC20 foi manchado de forma negativa ou fraca nos tecidos não tumorais correspondentes. Comparando quantitativamente as pontuações de coloração CDC20 entre 132cc arquivado e tecidos não tumorais adjacentes (principalmente incluindoepatocirose e hepatite), as pontuações de coloração CDC20 foram significativamente aumentadas em amostras de HCC em comparação com amostras peritumoraisamplos (Fig. 4B). Além disso, as pontuações da coloração do CDC20 aumentaram significativamente juntamente com a progressão da diferenciação histológica do tumor a partir de tecidos bem diferenciados (Fig.5).foi ainda analisada a correlação entre o aumento da expressão da proteína CDC20 e os parâmetros clinicopatológicos de 132 doentes com HCC. Como resumido na Tabela I, CDC20 expressão wassignificantly associado com o sexo (P=0,013), tumordifferentiation (P=0,000), TNM fase (P=0,012), P53 e Ki-67expression (P=0,023 e P=0,007, respectivamente). No entanto, observou-se uma associação nostatisticamente significativa entre a elevada expressão de Cdc20 e outras características clinicopatológicas, incluindo a idade tumoral, a infecção pelo VHB, o nível sérico de AFP,a cirrose hepática, a invasão vascular e metástase hepática intra/extra. Spearmancorrelation análise revelou que a alta expressão de CDC20 wasclosely relacionadas com o sexo (R=0.215, P=0,013), mais pobres tumordifferentiation (R=0,421, O P<0,001), o avançado TNM de estadiamento(R=0.218, P=0,012), maior nível de expressão do p53 (R=0.212,P=0,014) e Ki-67 (R=0.235, P=0,007) (Tabela II). No seu conjunto, estes resultados indicam que o CDC20 foi altamente expresso em tecidos de HCC e a sua expressão está estreitamente correlacionada com a diferenciação e a regressão do HCC.

Control sirna (fig. 6A) (id p<0, 0001). The western blotanalysis also showed an obvious suppression of CDC20 protein level at 48 h after transfection with siCDC20(Fig. 6B). A expressão alterada da proteína 1A (p21) do inibidor da cinase dependente da ciclina foi também analisada pela análise western blot, e os resultados mostraram que o nível de P21proteína foi notavelmente aumentado devido à supressão do CDC20 (Fig. 6B).

efeito da supressão CDC20 sobre a proliferação celular e o ensaio de proliferação celular

revelou que o crescimento celular das células transfectadas por siRNA cdc20 era notavelmente inibido em relação às células transfectadas por siRNA de controlo negativo(Fig. 6C). Espera-se que a inibição da proliferação celular pelo siCDC20 seja acompanhada pela mais rara metafase do ciclo celular. Por teste de citometria de fluxo, observou-se um número crescente de células na fase G2/M em células sicdc20transfectadas em comparação com células transfectadas com siRNA de controlo negativo (Fig. 6D). Estes dados indicaram que a supressão do CDC20 inibiu o crescimento celular através da redução da paragem de fase G2/M.

Discussion

Through bioinformatics analysis of a microarraydataset from GEO database, we identified CDC20 which was the majornode in HCC molecular interaction networks, it was related withspindle assembly checkpoint (SAC) in cell cycle. Durante a formação inicial, os defeitos ou perturbações no ponto de montagem do eixo foram considerados responsáveis pelo aumento da taxa de uploidização (26). Mondalet al relatou que o CDC20 é sobre-expresso em tumores de cabeça e pescoço e várias linhas celulares de carcinoma espinocelular oral(OSCC). O elevado nível de expressão do CDC20 nas células OSCC é associado a uma promoção precoce da anáfase, conduzindo a normalidades mitoticas (27). Os estudos revelaram igualmente que se detecta uma expressão elevada de CDC20 no carcinoma de células oralsquamosas e nos tecidos do cancro colorectal e que a sua sobreexpressão pode prever um mau prognóstico para os doentes (28,29).

CDC20 também é necessário para as células anafásicas tardias toexit da mitose (30). A meta do cdc20 resulta no bloqueio da saída da mitose, que pode ser uma estratégia terapêutica mais eficaz para matar as células cancerígenas de forma mais eficaz do que as drogas que perturbam o fuso (31). Wang et al relataram que o cdc20, que pode funcionar como uma oncoproteína para promover a progressão e o desenvolvimento de cancros humanos, representa um objectivo terapêutico promissor (32). Embora o papel do CDC20 na tumorigénese e prognóstico de vários humanceiros tenha sido profundamente investigado e confirmado, estudos limitados investigaram a função potencial do CDC20 na iniciaçãoe progressão do carcinoma hepatocelular.neste estudo, avaliámos o nível de expressão do ccdc20 em 16 tecidos de HCC frescos emparelhados congelados e correspondentes amostras não tumorais. Os resultados indicaram que o nível médio de mRNA e propeteína CDC20 nos tecidos HCC era muito mais elevado do que os tecidos não tumorais em comparação. A imunohistoquímica foi utilizada para investigar a localização subcelular do CDC20 e a sua relação com os parâmetros patológicos clínicos do HCC patients.By usando o teste χ2, descobrimos que o nível mais elevado de proteinexpressão CDC20 estava associado com a expressão de gênero, diferenciação tumoral,estágio TNM, P53 e Ki-67. Para investigar a função potencialbiológica e o mecanismo molecular do CDC20 em HCC, wedesignou um RNA de dupla cadeia e pequeno interferente (siRNA) com o objetivo de interferir com o seu nível de expressão na célula HepG2. Por ensaio de proliferação celular e teste FACS, descobrimos que células transfectadas com oligonucleótidos siCDC20 mostraram velocidade decrescimento e aumento da proporção de células no estágio G2/M.

a redução específica do CDC20 pelo siRNA revelou um efeito reforçado contra a proliferação de células cancerígenas hepáticas invitro, o que indicava que a sobreexpressão do CDC20 poderia acelerar a proliferação celular e promover a iniciação tumoral e a progressão do HCC. As células cancerígenas do fígado com expressão cdc20 suplantada foram induzidas a acumular a fase inG2/M, que pode ser responsável pela inibição do crescimento celular. O inibidor da cinase dependente das ciclinas 1A (p21), que é conhecido por participar no ponto de controlo G2/M (33), provou-se estar actualizado quando a expressão CDC20 foi especificamente suprimida em cancercells hepáticos. P21 pode inibir a atividade dos CDKs levando à acumulação de proteína do supressor tumoral RB não-fosforilado, que inibe a ativação transcritorial de E2F e subsequente entrada das células na fase S do ciclo celular(34).em conclusão, este é o primeiro estudo destinado a analisar a expressão CDC20 nos tecidos e linhas celulares de HCC, desde um novo enfoque que o CDC20 pode ser um indicador clinicamente relevante e a promover o objectivo terapêutico de HCC. No entanto, são necessários estudos adicionais centrados nos mecanismos moleculares do CDC20 no início e na progressão do HCC e na investigação sobre o significado prognóstico do cdc20.

agradecimentos

os autores agradecem aos seus colegas do Institute of Biotechnology da Academia de Medicina militar pelo seu apoio técnico.

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