Resultados

Nós avaliados pela primeira vez se CD63 e o H,K-ATPase residem no mesmo compartimento subcelular nas células parietais gástricas. Trabalhos anteriores mostraram que as células parietais do rato expressam altos níveis de CD63 (22). A microscopia de imunofluorescência em secções congeladas do estômago de rato indica que o CD63 está presente na maioria das células do estômago de rato, incluindo as células parietais(Fig. 1A). O CD63 colocaliza parcialmente com o HKa em células parietais. Além disso, analisamos uma preparação TVE altamente purificada do estômago de porco (um presente gentil de C. T. Okamoto). H, K-ATPase contribui cerca de 50% do teor proteico em preparações similares (23). A análise Western blot indica que o CD63 está abundantemente presente nesta preparação purificada de Ives(Fig. 1B).

para investigar uma possível interacção in situ entre o CD63 e a H,K-ATPase, realizámos experiências de retirada utilizando lectina de tomate biotinilada. Estudos anteriores demonstraram que esta lectina se liga específica e exclusivamente ao HKß em preparações gástricas (24-27). Misturámos uma preparação TVE com uma lectina anti-HKß mAb e tomate biotinilado para confirmar que a lectina se associa especificamente ao hkß glicosilado (Fig. 1C). Utilizámos então a lectina de tomate biotinilado para isolar proteínas que interagem com o HKß na preparação TVE. A análise Western blot indica que o CD63 é precipitado pela lectina de tomate (Fig. 1D), demonstrando que o CD63 e o H,K-ATPase associam in situ e sugerindo que esta associação pode ser fisiologicamente relevante. O pré-tratamento da preparação TVE com 4% de SDS, seguido de uma diluição de 20 vezes em tampão de lise, reduziu significativamente a quantidade de CD63 que foi precipitada. A quantidade de HKß que foi precipitada não foi alterada por este tratamento (Dados Não apresentados). Estes dados sugerem que a presença do CD63 na retirada é atribuível à sua associação com o HKß e não a uma associação directa entre o CD63 e a lectina de tomate.

para investigar o significado funcional da interacção entre o CD63 e o HKß, transferimos ainda mais células COS-7 com um cDNA codificando o coelho hkß, quer isoladamente, quer em conjunto com um cDNA que codifica uma construção CD63 marcada com bandeira (CD63-FL). Temos demonstrado que o HKß não precisa se montar com o HKa para alcançar a superfície celular em células COS transfectadas (20). Nós usamos uma construção CD63 que carrega uma marca de epítopo de bandeira em seu terminal n Porque o terminal C de CD63 contém um motivo baseado em tirosina que é necessário para o tráfico intracelular desta tetraspanina (13).as células COS Co-tratadas com o HKß e o CD63-FL foram submetidas a imunoprecipitação utilizando um painel anti-bandeira. A análise Western blot do material imunoprecipitado indica que o hkß coprecipita com CD63 (Fig. 2, HKß + CD63-FL). As proteínas CD63-FL e HKß coimmunoprecipitam numa variedade de detergentes, incluindo 2% do Caps, 1% Brij 96 e 1% Triton X-100. A associação entre o CD63 e o HKß constitui um dos poucos complexos de tetraspanina descritos que sobrevive à solubilização em Tritão X-100 e é, portanto, provável que represente uma interação direta (28). A subunidade β tem duas formas: ßm (maduro), que é modificado com carboidratos complexos, e ßc (núcleo), que é modificado com carboidratos de alta manose (29). Ambas as formas coprecipitam com CD63, embora a proporção de ßc para ßm no precipitado varie em função das condições de solubilização.Fig. 2.

The HKß coprecipitates with CD63. COS células foram transfected com o HKß sozinho, CD63-FL sozinho, ou o HKß e CD63-FL (HKß + CD63-FL). As células foram lisadas em 2% da parte do pescoço, 1% Brij 96 (Br), Ou 1% Triton X-100 (Tr) e imunoprecipitadas com PABS anti-bandeira. A segunda via foi imunoprecipitada a partir de uma mistura de lisatos celulares de células transfectadas separadamente com CD63-FL e o HKß. As proteínas precipitadas foram misturadas com mAb anti-HKß ou com mAb Anti-lâmpada-1.

O HKß não foi detectado na BANDEIRA immunoprecipitations realizada em células transfected com o HKß sozinho, demonstrando que a BANDEIRA pAb não interage com o β-subunidade (Fig. 2, HKß). O HKß não coimmunoprecipita com a aba de bandeira de uma mistura (50:50, vol/vol) de lisatos preparados a partir de células transfectadas individualmente com CD63-FL e a subunidade β, confirmando que a interação ocorre in vivo (Fig. 2, second lane). As amostras incubadas com aba do pavilhão não precipitam a lâmpada de proteína lisossómica-1, indicando que a interacção entre o CD63-FL e o HKß é específica e não um artefacto de solubilização incompleta do compartimento CD63 (Fig. 2).em seguida, examinamos se a interação entre o HKß e o CD63 afeta a localização subcelular da subunidade β. O HKß está presente na superfície celular em células COS transectadas (Fig. 3 A-C). Existe uma redistribuição pronunciada da subunidade β Para vesículas intracelulares contendo CD63 quando as células COS são co-transferidas com o HKß e CD63-FL (Fig. 3 D-F). Para descartar a possibilidade de que esta localização alterada possa ser um efeito não específico da sobreexpressão CD63, investigamos o efeito da expressão CD63 na distribuição de AQP4. AQP4 é um canal de água que está presente nas membranas plasmáticas basolaterais das células parietais. Não é submetido a endocitose e exocitose regulamentadas com a H,K-ATPase (30, 31). Este canal não coimmunoprecipita com CD63-FL num lisato Triton X-100 de células COS Co-infectadas (Fig. 4A). Quando as células cotransfectadas são visualizadas por microscopia de confocal de imunofluorescência, o AQP4 não está presente no compartimento contendo CD63 (Fig. 4B), indicando que a redistribuição induzida pelo CD63 para vesículas intracelulares é específica para proteínas que interagem com esta tetraspanina.Fig. 4. a colocalização para vesículas intracelulares é específica para proteínas que interagem com CD63. A) as células COS foram transfectadas apenas com AQP4 ou co-transfectadas com AQP4 e CD63-FL (AQP4 + CD63-FL). As células foram lisadas em Triton X-100 a 1% e imunoprecipitadas com mAb anti-bandeira. O material imunoprecipitado e os lisados das células foram sondados com pAb anti-AQP4. B) as células COS foram transfectadas com AQP4 (verde) ou AQP4 e CD63-FL (vermelho). O AQP4 foi detectado com o pAb anti-AQP4, e o CD63 foi detectado com o mAb anti-bandeira. (Barra de escala é de 10 µm.)

Para investigar os mecanismos de CD63 mediada redistribuição do HKß, aproveitamos o trabalho recente que tem caracterizado o tráfico intracelular de CD63. Rous et al. (13) demonstrou que o motivo baseado na tirosina presente no extremo C do CD63 interage com as subunidades do adaptador μ2 e μ3. A proteína μ2 é um membro do complexo ap-2 heterotetramérico. Este complexo está presente na membrana plasmática e liga proteínas de carga com o revestimento da clatrina, mediando a sua endocitose (14). A proteína μ3 é um membro do complexo heterotetramérico AP-3. Este complexo participa de Mira lisossómica e é encontrado tanto na rede trans-Golgi como em um compartimento vesicular que parcialmente colocaliza com endossomas (12). Quando o motivo de tirosina baseado no YEVM do CD63 é modificado para AEVM, o CD63 é incapaz de interagir com μ2 ou μ3 e é principalmente expresso na superfície celular (13). Quando o HKß é coexpressado com a construção do CD63-AEVM marcado com a bandeira, tanto o CD63-AEVM quanto a subunidade β são distribuídos na superfície celular (Fig. 3 G-I). Assim, a distribuição intracelular do HKß é afetada por sinais de tráfico embutidos na cauda citoplasmática CD63.

Quando a sequência YEVM na cauda do CD63 é mutada para YEVI, o motivo modificado continua a interagir com μ3, mas já não se associa com μ2 (13). CD63-YEVI é localizado principalmente para o compartimento endossômico-lisossômico tardio, muito provavelmente porque a proteína tetraspanina alterada se move diretamente para este compartimento após sua passagem biossintética inicial através do Golgi (13). A pequena população de CD63-YEVI que atinge a membrana plasmática exibe uma internalização deficiente porque não pode mais interagir com μ2 (13). Quando o HKß e uma BANDEIRA marcados CD63-YEVI construir são coexpressed em células COS, muito do CD63-YEVI é traduzido para o final de endosomal–lysosomal compartimento; no entanto, o β-subunidade permanece na superfície celular e não é redistribuída para um compartimento intracelular (Fig. 3 J-L). A análise de coimmunoprecipitação confirma que o HKß pode associar-se tanto ao CD63-YEVI como ao CD63-AEVM (dados não apresentados). Estes dados sugerem que, para que o HKß seja distribuído para um compartimento intracelular CD63 positivo, estas proteínas devem interagir na superfície celular e ser endocitadas como um complexo.

para determinar se o HKß detectado nas vesículas intracelulares corresponde a proteína que foi endocitada a partir da superfície da célula, observou-se a internalização da subunidade β Na presença e ausência de expressão CD63 exógena. As células COS foram cotransfectadas com o HKß e CD63-FL. As células foram então refrigeradas a 4 ° C para parar a endocitose e a superfície rotulada com o hkß mAb. As células marcadas foram incubadas a 37 ° C durante 40 minutos para permitir o recomeço da endocitose. Após a incubação, as células foram arrefecidas a 4°C e a superfície rotulada com IgG anti-rato bicomponente. As células foram fixadas e incubadas com um aba anti-bandeira e foram então rotuladas com ambas as IgG anti-coelho anti-IGG conjugadas com isotiocianato de fluoresceína e IgG anti-rato anti-ratinho conjugadas com rodamina. Assim, o HKß que permaneceu na superfície foi visualizado no canal Cy5, o hkß internalizado foi visualizado no canal isotiocianato de fluoresceína, e o CD63-FL foi visualizado no canal de rodamina. Esta análise demonstrou que a subunidade beta internalizada colocaliza com CD63, sugerindo que o pool do HKß que é colocalizado com CD63 é derivado através da endocitose da membrana celular (Fig. 5 E-H). Células que não superexpressam CD63 exibem muito menos internalizada subunidade β após uma incubação de 40 minutos (Fig. 5 A-D).

para quantificar a internalização do HKß e verificar ainda mais que o hkß e o CD63 se associam na superfície da célula, realizamos experimentos de biotinilação da superfície celular. Na primeira experiência, as células COS foram transfectadas apenas com a subunidade β e biotiniladas com éster biotin-SS-n-hidroxissuccinimida a 4°C. As amostras duplicadas foram então incubadas a 37°C durante vários períodos de tempo para permitir a retoma da endocitose. As células foram devolvidas a 4 ° C, e uma placa de cada ponto temporal foi despojada da restante biotina da superfície celular por exposição ao agente redutor de membrana-impermeante MesNa. As células foram lisadas e incubadas com contas de estreptavidina. As proteínas associadas às esferas de estreptavidina foram separadas por SDS/PAGE, e as membranas foram sondadas com o hkß mAb (Fig. 6A). A fracção da subunidade β Na superfície celular não se altera sensivelmente à medida que a internalização a 37°C. Após os primeiros 10 minutos, uma pequena fração do hkß da superfície é sequestrada dentro da célula, e a proporção entre a superfície e o HKß internalizado permanece alta. Estes dados sugerem que a subunidade β Não associada ao CD63 interioriza-se muito lentamente ou é internalizada, mas é rapidamente reciclada de volta à superfície, assim como o receptor transferrina.Fig. 6. a internalização do HKß é reforçada pela sua associação com o CD63. A) as células COS transfectadas apenas com o HKß foram biotiniladas com éster de biotina-N-hidroxisuccinimida e incubadas a 37°C para permitir a internalização. As placas foram então arrefecidas a 4 ° C, e um prato de cada ponto Temporal (em min) foi submetido a uma tira de MesNa. O material biotinilado foi colhido com esferas de agarose conjugadas com estreptavidina. Três experimentos independentes foram realizados em triplicado. B) as células COS Co-transferidas com o HKß e o CD63-FL foram biotiniladas com ou sem a tira de MesNa, tal como acima descrito. Todas as células foram lisadas em 2% de caps e imunoprecipitadas com PABS anti-bandeira. O imunoprecipitato foi eluído e incubado com esferas de agarose conjugadas com estreptavidina. Quatro experimentos independentes foram realizados. A amostra de cada ponto temporal foi analisada por SDS/PAGE e immunoblotting com MAB anti-HKß. A intensidade do sinal de cada banda foi quantificada por densitometria.

procurámos caracterizar o comportamento do HKß que associa com o CD63. As células COS foram cotransfectadas com o HKß e CD63-FL. As células foram biotiniladas e despojadas tal como acima descrito. Para isolar a população do HKß que está associado ao CD63, o lisado celular foi incubado com aba bandeira e contas de agarose conjugadas com proteína A. O material imunoprecipitado foi eluído com uma pequena quantidade de tampão contendo 3% de SDS, diluído 30 vezes com 1% de Triton X-100 e incubado com esferas de streptavidina. As proteínas associadas às esferas de estreptavidina foram separadas por SDS/PAGE e sondadas com o hkß mAb (Fig. 6B). Para as células que não foram submetidas a uma decapagem protocolo, o sinal detectado neste Western blot representa o conjunto total de superfície rotulados de β-subunidade associados com CD63, incluindo complexos que ainda estavam na membrana plasmática e complexos que tinha sido internalizado em vesículas. Para as células que foram submetidas a um protocolo de remoção, o sinal representa a população da subunidade β associada ao CD63 que estava presente na superfície celular durante a biotinilação e foi posteriormente internalizada e protegida da faixa de MesNa.

no ponto Temporal de 0-min, O HKß biotinilado é rapidamente detectado em imunoprecipitados anti-bandeira de células não-carregadas, demonstrando que o HKß e o CD63 são capazes de se associarem à superfície celular. Todo o HKß biotinilado recuperado no ponto Temporal de 0-min é sensível à tira de MesNa. A quantidade de CD63-associados, o β-subunidade protegido da MesNa reagente aumenta à medida que as células são permitidos para incubar a 37°C. Na verdade, a quantidade de HKß que está presente na superfície e associados CD63 em 0 min é aproximadamente a mesma que a quantidade de HKß que está associado com CD63 e protegido de stripping em 45 min. Estes achados sugerem que a subunidade β associada ao CD63 é internalizada e não retorna à superfície celular.