Resumo
A pressão crescente da vida social moderna intensifica o impacto do estresse sobre o desenvolvimento de doenças cardiovasculares, que incluem trombose venosa profunda (TVP). A denervação empática Renal tem sido aplicada como uma das abordagens clínicas para o tratamento da hipertensão resistente a fármacos. Além disso, a estreita relação entre o stress oxidativo e as doenças cardiovasculares tem sido bem documentada. O presente estudo destina-se a explorar o mecanismo pelo qual o sistema nervoso simpático renal e o stress oxidativo afectam o sistema de coagulação sanguínea no desenvolvimento de TVP. O modelo de choque de pés crónico em ratos foi aplicado para imitar um estado de stress fisiológico semelhante ao dos seres humanos. Os nossos resultados mostraram que o procedimento de choque nos pés pode promover TVP, o que pode ser através da activação da agregação de plaquetas. O agravamento da TVP e a activação das plaquetas foram aliviados pelo tratamento com denervação simpática renal ou antioxidante (Tempol). Simultaneamente, o tratamento de denervação pode também reduzir os níveis dos factores de oxidação circulantes nos ratos. Estes resultados demonstram que tanto o sistema nervoso simpático renal como o estresse oxidativo contribuem para o desenvolvimento de TVP em resposta ao estresse crônico, o que pode fornecer uma nova estratégia para o tratamento de pacientes com TVP clínica.
1. A trombose venosa profunda (TVP) é uma doença cardiovascular comum associada a sequelas, embolia pulmonar, que é a terceira causa de morte mais comum de doenças cardiovasculares após ataque cardíaco e acidente vascular cerebral. Um fluxo sanguíneo lento, danos na parede da veia e um estado hipercoagulável são os três principais fatores de risco para o desenvolvimento de TVP. Consequentemente, os anticoagulantes e trombolíticos são os dois principais tratamentos para doentes com TVP clínica. A tríade de factores de risco predispostos à formação de trombos, postulados por Virchow, inclui alterações na relação entre os componentes sanguíneos, na integridade da parede do vaso sanguíneo e na taxa de fluxo sanguíneo. O sistema de coagulação do sangue desempenha um papel fundamental na proteção dos mamíferos contra sangramento letal. Em todas as formas de trombose, coagulação e inflamação são as duas principais vias que actuam em conjunto para coordenar as respostas do corpo à lesão .nas últimas décadas, factores psicológicos, tais como o stress e a depressão, foram reconhecidos como factores importantes que afectam a saúde humana . Longos períodos de ansiedade induzirão o desenvolvimento de doenças cardiovasculares. Além disso, ao ocorrer simultaneamente, a depressão e a ansiedade agravarão ainda mais o desenvolvimento de doenças cardiovasculares. Além disso, demonstrou-se que o stress e outros factores psicológicos estão estreitamente relacionados com a ocorrência de acidente vascular cerebral e enfarte do miocárdio . Numerosos estudos também demonstraram que o stress pode causar danos estruturais duradouros nos tecidos e órgãos . O procedimento de choque elétrico crônico do pé tem sido caracterizado como um modelo de estresse psicológico incontrolável e imprevisível , que tem sido demonstrado ser capaz de induzir o aumento da pressão arterial sistólica . No entanto, não há ainda nenhum relatório relacionado com os efeitos de choque crônico sobre o desenvolvimento de TVP.o papel do nervo renal simpático no desenvolvimento da hipertensão foi demonstrado em observações experimentais e clínicas . Existem dois tipos de nervo renal simpático: nervos renais aferentes e nervo renal eferente. As fibras simpáticas aferentes originam-se dos rins, e ao modular o fluxo Central simpático modificam directamente a hipertensão neurogénica. Ao mesmo tempo, o nervo eferente aumenta a retenção de sódio e água, estimula a libertação de renina, e altera o fluxo sanguíneo renal . Desta forma, tanto a pressão arterial a curto como a longo prazo pode ser influenciada pelo nervo empático renal . Os estudos clínicos relataram os efeitos benéficos da denervação simpática renal em doentes com hipertensão refractária . Para além do efeito de redução da denervação na pressão arterial, foram também notificados benefícios adicionais em doenças cardiovasculares, diabetes , disfunção renal, hipertrofia cardíaca , insuficiência cardíaca e arritmias . A hipertensão, um factor de risco importante para muitas doenças, pode aumentar a disfunção endotelial e promover trombose e também está intimamente relacionada com a incidência de doenças vasculares cardiocerebrais . Portanto, a denervação empática renal pode fornecer uma nova estratégia na prevenção e tratamento de doenças cardiovasculares sob condição de alto estresse.recentemente, experiências mostram que o stress oxidativo pode ser responsável pela alteração da função endotelial . O aumento das espécies reactivas de oxigénio produzidas pelo endotélio vascular e pelas células sanguíneas circulantes irá afectar as funções da barreira vasomotora e endotelial e aumentar a formação de trombos . O stress oxidativo foi também considerado um determinante da activação plaquetária , que foi o factor de risco para a aterotrombose. No entanto, desconhece-se se o stress crónico pode afectar o sistema de coagulação através do aumento do stress oxidativo.actualmente, não existem relatórios que liguem directamente o stress psicológico ao sistema de coagulação e às doenças vasculares cardiocerebrais. Considerando que a ativação do sistema de coagulação tem uma influência importante na hemostase fisiológica e trombose patológica , nós aplicamos o modelo de estresse de choque nos pés em ratos para explorar se crônico poderia afetar o desenvolvimento de TVP e os possíveis mecanismos envolvidos.2. Materiais e métodos
2.1. Neste estudo foram utilizadas preparações animais de ratos Sprague-Dawley machos de dez semanas de idade, obtidos no centro de animais de laboratório de Xangai. Os animais foram mantidos num ambiente controlado com temperatura de 25°C com um ciclo escuro de 12 : 12 horas de luz. Ratos expostos ao protocolo de estresse foram colocados individualmente em uma caixa de estresse de choque de pés, onde eles receberam uma sessão de 4 horas de choque elétrico de pé através de um Chão de rede eletrificado, produzindo um choque de 5 segundos de 0,15 mA a cada 30 segundos. O nervo simpático renal do rato foi cirurgicamente cortado enquanto os animais estavam sob uma anestesia induzida por hidrato de cloral a 10%. Após um período de recuperação de uma semana, o protocolo de choque foi iniciado. O Tempol (10 mg/kg/dia) foi administrado por injecção intraperitoneal após o início do protocolo de stress . A trombose venosa foi induzida em condições anestesiadas com 10% de hidrato de cloral, como descrito anteriormente por Leung . Brevemente, o abdômen foi aberto, e a veia cava inferior (IVC), depois de ser cuidadosamente separada dos tecidos circundantes, foi ligada firmemente abaixo da veia renal esquerda usando um fio de algodão. Em seguida, o abdômen foi fechado com uma camada dupla de suturas, fechando o peritoneu com os músculos primeiro e, em seguida, a pele separadamente. Após doze horas, os animais foram anestesiados novamente, o abdômen foi reaberto, e o plasma e o trombo foram coletados para análise posterior . O presente estudo foi realizado em conformidade com a Convenção Europeia para a Protecção dos Animais Vertebrados utilizados para fins Experimentais e Outros Fins Científicos (Conselho da Europa, número 123, em Estrasburgo, 1985). Todos os procedimentos cirúrgicos foram aprovados pela Universidade de Soochow e realizados de acordo com as Diretrizes para o cuidado e uso de animais estabelecidas pela Universidade de Soochow.
2, 2. Os níveis plasmáticos de corticosteróides foram medidos utilizando um kit de teste de imunoabsorção enzimática disponível no mercado (ELISA) (TSZ Elisa, EUA).
2, 3. Medições do peso de trombos
2, 3. Medições do peso de trombos
da cavidade abdominal reaberta, o segmento ligado da veia cava foi removido e aberto longitudinalmente para remover o trombo formado, que foi enxaguado e pesado em papel de filtro.
2, 4. A análise dos parâmetros de coagulação sanguínea
tempo de protrombina (PT), tempo parcial de tromboplastina activada (APPT) e tempo de trombina (TT) foram medidos utilizando um analisador automático de coagulação sanguínea (Sysmex Corporation CA-50, Japão). Da cavidade abdominal reaberta, o sangue (4, 5 mL) foi recolhido da veia cava inferior utilizando uma seringa descartável, contendo 0, 5 mL de uma solução de citrato de sódio a 3, 8%, e transferido para tubos de centrifugação autoclavados. Metade do sangue foi centrifugado a 3000 rpm durante 10 minutos e o soro foi colhido. Uma alíquota sérica de 0, 1 mL foi combinada para 0.1 mL de reagente PT. Após pré-aquecimento durante 20 minutos, o PT foi medido usando um analisador automático de coagulação sanguínea, como mencionado acima. O applet e o TT foram medidos utilizando o mesmo método que o PT.a agregação plaquetária foi medida utilizando um analisador de agregação plaquetária (Chrono-Log 560 Ca, Alemanha). Após a reabertura da cavidade, foram recolhidos 4, 5 mL de sangue da veia cava inferior utilizando uma seringa descartável contida com 0, 5 mL de citrato de sódio (3, 8%) e depois transferidos para o tubo de centrifugação. A segunda metade do sangue foi centrifugada a 1000 rpm durante 10 minutos para obter o plasma rico em plaquetas. O sangue restante no tubo foi centrifugado a 3000 rpm durante 10 minutos para preparar o plasma pobre em plaquetas. Em seguida, a coagulação das amostras de plasma foi estimulada utilizando proteína de colagénio e difosfato de adenosina dissódico (ADP) (1 mM, 10 mL) como agonistas plaquetários.
2, 5. A determinação da concentração plasmática de noradrenalina (NA)
os níveis plasmáticos de noradrenalina (NA) foram medidos utilizando um teste de imunoorbenteamento enzimático disponível no mercado (ELISA) kit (TSZ Elisa, EUA).
2, 6. Medição de Níveis de peroxidação Lipídica e Plasma Superóxido Dismutase (SOD) e Glutationa Peroxidase (GSH-Px) Atividade
Plasma SOD e GSH-Px atividade e níveis de peroxidação lipídica (thiobarbituric acid reactivas, TBARS) foram mensurados utilizando-se comercialmente disponível enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kits (ZST Elisa, EUA).
2, 7. Análises estatísticas
todos os dados foram apresentados como a média ± SEM. A significância estatística das comparações entre mais de dois grupos foi testada usando uma ANOVA de duas vias seguida pelo teste Newman-Keuls ou usando um teste de estudante de duas caudas não emparelhado. os valores < 0, 05 foram considerados estatisticamente significativos.
3. Resultados
3.1. Efeito de Choque, Denervation, e Tempol de Tratamento por Plasma Costicosterona Concentrações
Plasma costicosterona níveis (o marcador de estresse) eram significativamente maior no pé, o choque de grupo quando comparado com o grupo controle (Figura 1) e foram marcadamente suprimida em ambos os denervation plus choque e o Tempol plus choque grupos em comparação, com o pé de choque sozinho grupo (Figura 1). Este resultado indicou que o choque de pé crônico aumentou significativamente a corticosterona plasmática quando o corpo estava sob estresse, e tanto de denervação e tratamento Tempol poderia aliviar o estado de estresse.
3.2. O efeito do Choque, denervação e tratamento de Tempol no peso de trombos induzidos pela ligadura IVC
Trombi foram recolhidos 12 horas após a ligação IVC e ponderados. No grupo de choque com os pés, o peso de trombos aumentou significativamente em comparação com o grupo de controlo (figura 2). No entanto, o peso de trombos dos grupos de denervação mais choque e Tempol mais choque manteve-se inalterado em comparação com o grupo de controlo Trombi, mas diminuiu significativamente em comparação com o grupo de choque dos pés Trombi (Figura 2). Estes resultados sugerem que o choque crónico pode facilitar a formação de TVP, enquanto que tanto a denervação como o tratamento com Tempol podem inibir o aumento induzido pelo stress da formação de TVP.
(a)
(b)
(a)
(b)
3, 3. Após a colheita de sangue a partir da CIV, foram medidos os parâmetros sanguíneos (PT, APPT, TT e agregação plaquetária). Houve uma diferença significativa nos parâmetros de PT, TT e agregação plaquetária entre os grupos de controle e de choque nos pés. O PT do grupo de choque dos pés foi inferior ao do grupo de controlo; no entanto, os parâmetros de agregação TT e plaquetária foram mais elevados no grupo de choque dos pés em comparação com o grupo de controlo. Em paralelo, observou-se uma diminuição significativa nos parâmetros TT e agregação plaquetária dos grupos de denervação mais choque e Tempol mais choque em comparação com o grupo de choque do pé (Tabela 1 e Figura 3). Estes resultados revelam que o choque crónico pode aumentar o sistema de coagulação através da activação da agregação plaquetária.
Control
Shock
Denervation + shock
Tempol + shock
PT (s)
APPT (s)
TT (s)
PT, prothrombin time; APPT, activated partial thromboplastin time; TT, tempo de trombina; versus grupo de controlo; versus grupo de choque.
Tabela 1
Efeito de choque, denervation, e Tempol tratamento no PT, de COMPROMISSO, e TT.
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
Figure 3
Platelet aggregation rate. A taxa de agregação plaquetária estimulada pelo ADP (a, b) e a taxa de agregação plaquetária estimulada pelo colagénio (C, d) foram medidas em cada grupo após stress de duas semanas, como descrito na secção de materiais e métodos através do analisador de agregação plaquetária. A) E c) representam o traço de agregação plaquetária fornecido pelo analisador de agregação plaquetária. Os dados de cada grupo () foram apresentados como média ± SEM. * em comparação com o grupo de controle. † em comparação com o grupo de stress.
3, 4. Efeito do Choque, Da denervação e do tratamento com Tempol nas concentrações plasmáticas de noradrenalina (NA)
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| PT, prothrombin time; APPT, activated partial thromboplastin time; TT, tempo de trombina; versus grupo de controlo; versus grupo de choque. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
choque no pé aumentou significativamente os níveis plasmáticos de noradrenalina (NA) em comparação com o grupo controlo (Figura 4). Os níveis plasmáticos de NA no grupo “denervation plus shock” e “Tempol plus shock group” foram significativamente suprimidos em comparação com o grupo “foot shock” (Figura 4). Estes resultados confirmam o sucesso do procedimento cirúrgico de denervação renal.
3, 5. Efeito do Choque, Da denervação e do tratamento com Tempol sobre a actividade plasmática de SOD e GSH-Px e sobre os níveis de TBARS
a actividade plasmática de SOD no grupo de stress foi significativamente reduzida em comparação com o grupo de controlo (Figura 5 a)). A actividade do plasma SOD nos grupos de denervação mais choque e Tempol mais choque foi marcadamente elevada em comparação com o grupo de choque do pé (Figura 5 a)).
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
a actividade plasmática de GSH-Px No grupo de choque dos pés foi também marcadamente mais elevada do que a do grupo de controlo (Figura 5 b)). A actividade plasmática do GSH-Px nos grupos de denervação mais choque e Tempol mais choque foi marcadamente elevada em comparação com o grupo de choque do pé (Figura 5 b)).o choque dos pés levou a um aumento acentuado dos níveis plasmáticos de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) em comparação com o grupo de controlo (Figura 5 c)). Os níveis plasmáticos de TBARS nos grupos de denervação mais choque e Tempol mais choque foram acentuadamente suprimidos em comparação com o grupo de choque dos pés (Figura 5(C)).4. Discussão
neste estudo, identificamos que a formação de TVP é facilitada sob condições de estresse e que as alterações no sistema de coagulação do sangue são induzidas pelo estresse. A acumulação de dados mostrou que o stress psicológico crónico activou dois sistemas.: um é o sistema do córtex suprarrenal hipotálamo-pituitária (HPA), que foi mediado principalmente pela liberação de catecolamina, cortisol, vasopressina, endorfinas e aldosterona ; o outro é através da ativação do sistema medular apático-adrenal simpático . Como demonstrado nos dados, os níveis de corticosteróides no grupo de choque crónico aumentaram significativamente, indicando que o HPA foi activado. Qual é o papel do sistema nervoso simpático em resposta ao stress? Uma vez que foi demonstrado que a ativação do sistema simpático renal está altamente relacionada com o desenvolvimento da hipertensão, e a denervação renal é um novo tratamento em doentes com hipertensão refractária , o sistema simpático renal deve desempenhar um papel importante nas doenças cardiovasculares. Além disso, observações recentes mostram que a condição de alto estresse é altamente relacionada a doenças cardiovasculares especialmente enfarte cardíaco e cerebral; portanto, especula-se se o estresse crônico irá ativar o sistema de coagulação através da ativação do sistema nervoso simpático renal. No presente estudo, primeiramente descobrimos que o estresse crônico poderia agregar a formação de TVP, sugerindo que o estresse aumentaria o risco de doenças cardiovasculares. Além disso, medimos parâmetros que definem a atividade do sistema de coagulação sanguínea, incluindo PT, APPT, TT e agregação plaquetária. Os nossos dados mostraram que houve uma alteração significativa na agregação plaquetária induzida tanto pelo ADP como pelo colagénio, sugerindo que o efeito agravante do stress na formação de TVP foi mediado pela activação das plaquetas. Os nossos resultados revelam, em primeiro lugar, o mecanismo que liga a elevada condição de stress e as doenças cardiovasculares. Embora os nossos dados actuais tenham demonstrado claramente o papel do sistema nervoso simpático renal no desenvolvimento crónico de TVP induzido pelo choque, é difícil identificar se o nervo aferente ou eferente desempenha um papel importante devido à limitação do procedimento cirúrgico. Especula-se que ambos estão envolvidos; a razão é que nervo aferente pode afetar o controle neurogênico da pressão arterial, o que pode contribuir para o desenvolvimento de DVT; o nervo eferente pode regular a secreção renal de noradrenalina, que também pode contribuir para o desenvolvimento de TVP.a presença de endotélio danificado e factores de coagulação activada ou plaquetas facilita o desenvolvimento e progressão da TVP . A agregação plaquetária (ou seja, quando as plaquetas se aderem umas às outras) ocorrendo nos locais de lesão vascular tem sido reconhecida como crítica para o desenvolvimento de trombose . No presente estudo, concentrámo-nos principalmente na função plaquetária em TVP. Os fenômenos de adesão, liberação ou agregação plaquetária também são conhecidos como ativação plaquetária . Plaquetas ativadas desempenham um papel importante no processo de trombose. Os nossos dados mostram que a agregação plaquetária aumentou após o tratamento de estresse, juntamente com o aumento na formação de TVP. A contagem de plaquetas foi utilizada para normalizar a medida da atividade plaquetária; no entanto, não foram realizadas estatísticas sobre o número de plaquetas em cada grupo.as nossas análises da actividade plasmática de GSH-Px e SOD, bem como do nível plasmático de TBARS, mostraram que o corpo está num estado de stress oxidativo induzido pelo tratamento crónico de choque nos pés, que foi inibido pela denervação renal. Vários relatórios demonstraram que a actividade da nad (P)H oxidase pode ser directamente aumentada pelos receptores α1 e β2 através das catecolaminas (CA) libertadas pelo nervo simpático renal. Além disso, os antagonistas dos receptores β1 demonstraram reduzir o stress oxidativo vascular causado pela activação da NAD(P)H da oxidase . Portanto, podemos dizer que a inervação simpática renal aumenta diretamente os níveis de stress oxidativo. Foi notificado que a agregação plaquetária, um factor de risco adicional para o trombo, está associada a stress oxidativo . O stress oxidativo pode aumentar directamente a agregação plaquetária através de radicais livres de oxigénio localizados na superfície plaquetária . Provas sólidas demonstraram que o stress oxidativo pode activar directamente as plaquetas através de uma variedade de formas. Como o produto do estresse oxidativo O2 – pode reagir com plaquetas ou endotélio, então nenhum derivado do ONOO -, que é de particular importância para a trombose vascular, também tem tais efeitos. Vários estudos demonstraram que O2− pode reduzir o limiar de activação plaquetária para trombina, colagénio ou ADP e O2− pode mesmo ser capaz de induzir a agregação espontânea . As plaquetas activadas podem mesmo produzir ROS; o papel desta ROS endógena é semelhante à ROS exógena na activação plaquetária. Geralmente, existem vários cenários que levam à agregação plaquetária induzida pelo stress. No primeiro, o nervo empático renal é ativado pelo estresse, o que leva a um aumento do estresse oxidativo em todo o corpo que é seguido por um aumento na agregação plaquetária. No outro cenário, o estresse desencadeia diretamente a produção de estresse oxidativo corporal, o que aumenta diretamente a agregação plaquetária. A denervação do nervo empático Renal pode afetar diretamente a ativação plaquetária, no entanto, o mecanismo do qual permanece por explorar.
nossos dados mostraram que o tratamento de estresse crônico não tem efeito significativo sobre a aplicação ou PT, sugerindo que a TVP facilitada por estresse pode não estar associada com o sistema extrínseco ou intrínseco de coagulação. No entanto, o tratamento por stress crónico pode aumentar marcadamente a TT, O que indica que o tempo de conversão do fibrinogénio em fibrina foi prolongado devido a uma hiperfibrinólise. Por isso, especula-se que a hiperfibrinolítica fibrinolítica foi devida a uma coagulação sanguínea aumentada sob a condição de stress crónico. Simultaneamente, o tratamento com denervação renal e antioxidante pode diminuir a agregação plaquetária, que por sua vez suprimiu a coagulação sanguínea. Com base em nossos dados, pudemos observar que o TT tendeu para uma taxa normal nestas duas condições quando comparado com o grupo de choque.
deve-se notar que, na nossa observação actual, descobrimos que o tratamento com Tempol pode reduzir o aumento crónico induzido pelo stress dos níveis de corticosteróides, sugerindo o envolvimento do stress oxidativo na libertação hormonal induzida pela activação do HPA, indicando que o tratamento com antioxidante pode proporcionar alguns efeitos benéficos na lesão orgânica induzida pela activação do HAP. No entanto, não encontramos qualquer diferença entre denervação e tratamentos antioxidantes em quaisquer parâmetros, indicando que nervo simpático e estresse oxidativo podem contribuir de forma independente para o desenvolvimento de TVP induzida por choque crônico.em conclusão, o stress crónico pode aumentar a agregação plaquetária directamente através da activação do nervo simpático renal e do aumento do stress oxidativo. Em seguida, a TVP vem a ser facilitada pelo aumento da agregação plaquetária. Vários estudos demonstraram que a aterosclerose e outras doenças cardiovasculares estão estreitamente associadas ao stress oxidativo e que os doentes apresentam frequentemente níveis baixos de antioxidantes sanguíneos e níveis aumentados de marcadores de stress oxidativo . Assim, tendo em conta as doenças vasculares cardiocerebrais e a TVP, podemos prevenir e tratar estas doenças, direccionando a terapêutica para os níveis hormonal e antioxidante. Além disso, é uma nova forma de terapia através do nervo empático renal.
conflito de interesses
os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.
contribuição dos autores
Guo-Xing Zhang concebeu e projetou os experimentos. Tao Dong, Yu-Wen Cheng, Pei-Wen Sun, e Chen-Jie Zhu realizaram os experimentos. Fei Yang auxiliou na agregação plaquetária. Guo-Xing Zhang contribuiu com reagentes/materiais e dados analisados. Guo-Xing Zhang, Tao Dong, e Yu-Wen Cheng escreveram o artigo.
agradecimentos
os autores estão gratos ao Professor Li Zhu e outros membros do Laboratório Zhu por conselhos e assistência experimentais. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81270316, 814170563) e pelo Programa de pesquisa da Universidade de Soochow (Q413400111).
