resultados

caracterização de células dendríticas Plasmacitóides do intestino delgado.aplicamos procedimentos padrão para isolar células imunes localizadas no epitélio (intra-epitelial, ou seja) e no LP do intestino. Em ambas as preparações celulares encontramos uma população distinta de células CD11c+B220 + Ly6C + que representavam até 1% de todas as células. Em contraste com pDC, mielóide (m)DC (CD11c+MHCII+CD3−B220−Ly6C−) estavam presentes apenas em números muito baixos na preparação IE (Fig. 1 a). Ambos os pDC da preparação LP e IE mostraram baixos níveis de expressão MHC de Superfície classe II(Fig. 1 a). Outras análises revelaram que as células CD11c+B220+Ly6C+ de ambas as preparações expressam uniformemente os marcadores pdca1 e 120G8 (Fig. 1 B). Citospinas de pDC Classificado (CD11c+B220 + Ly6C+) e DC mielóide (mDC) da preparação IE revelaram uma morfologia redonda e lisa, semelhante às células plasmáticas do pDC, enquanto que o mDC mostrou as características dendrites (Fig. 1 C). Para caracterizar ainda mais a localização do pDC no intestino aplicamos anti-B220, anti-120G8 e anti-CD3 mAb na imunohistologia. Os micrografos foram aleatoriamente retirados de seções e, como representado na figura. 1 D, o posicionamento de 120G8+B220+CD3− células foi determinado em relação às células epiteliais através da análise de imagens (análise; Olympus, Hamburgo, Alemanha). Avaliando o posicionamento de ≈150 pDC, observamos que 4,9% dessas células estavam claramente localizadas dentro da camada de células epiteliais, enquanto outros 6,7% estavam situados a uma distância de 5-10 µm da extremidade apical das células epiteliais (Fig. 1 D). Estes dados demonstram que uma certa quantidade de pDC localizar dentro ou próximo ao epitélio intestinal, enquanto que >80% das células analisadas foram posicionados em distâncias >15 µm, que processa-los como LP células (Fig. 1 D). Uma vez que números semelhantes de pDC estavam presentes na preparação IE e LP seguindo os procedimentos de isolamento padrão, não está atualmente claro se pDC da LP contaminar a preparação IE ou se pDC localizando ao epitélio são mais eficientemente isolados. Como quase não encontramos nenhum mDC dentro da preparação IE, favorecemos a última possibilidade. No entanto, resta determinar se ambas as populações servem funções diferentes ou pertencem a uma população celular comum. Porque pDC da preparação IE, em contraste com pDC da preparação LP, pode ser isolado por procedimentos bastante suaves, exclusivamente pDC da preparação IE foram usados para ensaios funcionais neste estudo.

iv xmlns:xhtml=”http://www.w3.org/1999/xhtml Fig. 1. fenótipo do plasmacitóide DC no intestino delgado do Ratinho. (A) Células do IE e LP preparação do intestino delgado foram marcadas com anticorpos específicos para CD3, CD11c, B220, MHCII, e Ly6C. CD3− células foram analisadas para a expressão de B220 e Ly6C (à Esquerda). A expressão de MHCII e CD11c é mostrada para Ly6C+ B220+ (caixa azul, centro) e ly6c− cells (caixa vermelha, direita). B) a expressão marcador pDC. pDC (CD11c+, B220+ e Ly6C+) da preparação IE e LP foram manchados para PDCA-1 ou 120G8 (linhas sólidas) ou controles de isótipo (área sombreada) como indicado. (C) Cytospins de fluxo de classificados IE mDC e pDC foram coradas com H&E (pDC: CD3−CD11c+B220+Ly6C+; mDC: CD3−CD11c+B220−Ly6C−). (Barras de escala: 10 µm.) São apresentados dados representativos de uma das duas experiências. D) as secções Criostáticas das pequenas vilosidades intestinais foram manchadas para núcleos (DAPI, branco), B220 (azul), CD3 (verde) e 120G8 (vermelho). A barra amarela no micrografo superior esquerdo indica como foi determinado o posicionamento do pDC (120G8+B220+) em relação à camada epitelial. Distribuição À Distância de 150 pDC analisados em relação ao epitélio. Exemplos do posicionamento de cada pDC com distâncias como indicado. (Barras de escala: 10 µm.) E) análise por citometria de fluxo da pDC da preparação IE e LP. As células foram manchadas com anticorpos como indicado (linhas sólidas) ou controles isotipos (área sombreada) e tratados em pDC (CD11c+, B220+ e Ly6C+). São apresentados dados representativos de quatro experiências independentes com células agrupadas de dois a seis ratinhos cada.

Ccr9 expressão na pDC Intestinal.

para identificar os mecanismos moleculares que permitem a migração de pDC para o intestino, analisamos a expressão de moléculas de referência. Embora esteja bem estabelecido que a ee da integrina (CD103) media a adesão linfocitária às células epiteliais do intestino, não conseguimos identificar a expressão desta integrina no pDC intestinal. Da mesma forma, CCR7 (Fig. 1 E), essencialmente envolvido no encaminhamento de linfócitos para órgãos linfóides periféricos não é expresso por pDC do intestino. Em contraste, observou-se níveis elevados de CD18 (β2-integrina) e níveis intermédios de α4β7, enquanto ≈50% dos ligandos de pDC express P-selectina (Fig. 1 E). De interesse, a grande maioria dos pDC intestinais expressaram elevadas quantidades do receptor de quimiocina CCR9 (Fig. 1 E), enquanto que o mDC da punção lombar expressou N, ou níveis baixos de CCR9 .

Ccr9 expressão de pDC isolada a partir de diferentes órgãos linfóides.

considerando a expressão uniforme de CCR9 em pDC intestinal, analisamos a expressão de CCR9 em pDC isolado de órgãos linfóides secundários, incluindo baço, drenagem de pele em LN, LN mesentérica, e manchas de Peyer (PP; Fig. 2 A) e usado CD4+CD8+ timócitos, conhecidos por expressar altos níveis de CCR9, como um controle positivo (11); Fig. 2 B). Curiosamente, apenas uma fração do pDC presente em qualquer um destes órgãos expressa CCR9 (Fig. 2 a), enquanto cerca de 95% da pDC isolada do BM transportava este receptor (Fig. 2 C). A maioria dos pDC BM também expressam CCR5 e CXCR3 enquanto CCR2 está presente em apenas cerca de 25% das células. O CXCR4, conhecido por reter células para a MB, é apenas muito pouco expresso (Fig. 2 C). Em conjunto, estes dados demonstram que a pDC está equipada com vários receptores quimiocinos antes de ser libertada da BM. Esta característica, presumivelmente, permite o encaminhamento não só para locais de inflamação, mas também para o intestino não inflamado.Fig. 2.

expressão do CCR9 em pDC. A) as células foram isoladas a partir de diferentes órgãos linfóides, tal como indicado. pDC foram tratados como CD11c+B220 + Ly6C+ e analisados para a expressão de CCR9 (linha sólida). B) os timócitos CD4+CD8+ serviram de controlo positivo. C) expressão de receptores de quimiocina (linhas sólidas) em pDC isolados da BM (área sombreada: controlo isótipo). SPL, spleen; ALN, axillary LN; MLN, mesenteric LN; PP, Peyer patches; Thymus). Dados representativos de quatro experiências independentes com células agrupadas de dois a seis ratinhos cada (A E B) ou de Três Ratinhos (C).

Chemotaxis Analysis of Flt3L-Expanded pDC.

com base na forte expressão de CCR9 Em BM E pDC intestinal, comparamos a capacidade de migração de pDC e mDC para o ccl25/TECK chemokine, que é o único ligante conhecido para este receptor (12). A frequência de pDC varia entre diferentes estirpes do rato e é bem conhecido que, por exemplo, ratos C57BL / 6 (B6) abrigam muito menos pDC do que ratos 129SV (13). No entanto, independentemente do fundo genético, o número de pDC que podem ser isolados dos tecidos do rato é insuficiente para realizar ensaios padrão de quimiotaxia in vitro. Para superar esta limitação, expandimos a população DC in vivo implantando uma linha celular tumoral (B16-FL) com secreção de Flt3-L em ratos B6 por 14 dias (14).

durante este período de tempo, a percentagem de células CD11c+ presentes no baço aumentou de 3% para 30-35% (dados não apresentados). Oitenta por cento dos pDC expandidos in vivo expressaram CCR9, com níveis muito semelhantes aos presentes em pDC BM (figos. 2 C e Fig. 4 C) enquanto que o mDC expandido in vivo expressou apenas pequenas quantidades deste receptor (Fig. 6B ). O pDC do baço foi enriquecido pela triagem CD11c+ MACS, resultando em 95% de pureza para as células CD11c+ que continham cerca de 15% de Ly6C+B220+ pDC. Os testes de migração transwell in vitro revelaram uma forte resposta quimiotáctica do pDC ao CCL25, bem como ao CXCL9, um ligante para o CXCR3 e ao CXCL12, que é um ligante para o CXCR4. Apenas uma resposta fraca foi observada em direção a CCL19, que serve como um ligante para CCR7. mDC mostrou pouca resposta quimiotática para CCL25 e CXCL9 e resposta moderada para CXCL12 e CCL19(Fig. 3 A).Fig. 3.

resposta quimiotática de pDC em direção ao ligando CCR9 CCL25. A) A DC foi expandida in vivo através do tratamento de ratinhos B6 com células tumorais secretoras de Flt3L durante 14 dias. Foi analisada a actividade quimiotáctica do pDC esplénico e do mDC para diferentes concentrações de CCL25, CXCL9, CXCL12 e CCL19 (colunas abertas, mDC; colunas pretas, pDC; média + DP; N = 4 experiências independentes com células agrupadas de dois ou três ratos cada). B) ausência de pDC intestinal em ratinhos com deficiência de CCR9. São apresentados a percentagem (esquerda) e o número (direita) de pDC isolado do inguinal LN (ILN), mesentérico LN (MLN), baço (SPL), PP, e o IE e a preparação LP do intestino delgado de ratinhos com deficiência em B6 e CCR9. Os círculos representam dados de ratos individuais (n = 3); as barras mostram valores médios. Obtiveram-se resultados semelhantes em quatro experiências adicionais utilizando ratinhos com base genética mista (BALB/c 129SV; n = 20 ratinhos por genótipo).

número reduzido de pDC no intestino delgado de ratinhos com deficiência em CCR9.

com base nestas observações, caracterizámos a distribuição de pDC em ratos com deficiência em CCR9. Encontramos porcentagens semelhantes de pDC no pulmão e fígado (si Fig. 7) bem como nos gânglios linfáticos inguinais e mesentéricos, enquanto o número de pDC esplênico foi ligeiramente aumentado em ccr9−/− ratinhos. Em contraste, observou-se uma diminuição >90% da diminuição intestinal e uma redução de 50% da PP pDC (Fig. 3 B).

pDC migram preferencialmente para o intestino delgado.

com base nos achados descritos até agora, parecia provável que pDC requeira CCR9 para a localização do intestino delgado. Para provar essa hipótese, nós adotivamente transferimos células de B6 e CCR9−/− doadores que carregaram um tumor secretante Flt3-L por 14 dias. Sob a influência do pDC Flt3L expandiu− se em uma extensão semelhante em B6 e CCR9−/ – ratinhos (Fig. 4 A E Si Fig. 8) e eram indistinguíveis no que diz respeito à expressão de CCR2, CCR5 e CXCR3, enquanto o CCR9 só foi detectado em pDC derivado de doadores com deficiência em B6 mas não em CCR9 (Fig. 4 C). Sem purificação adicional, os esplenócitos destes dadores foram rotulados com diacetato de N-succinimidilo(CFSE) de 5 (6)-carboxitetrametilrhodamina n-succinimidilo(TAMRA), respectivamente, com diacetato de 5 (6)-carboxilforesceína. Uma mistura de células deficientes em WT e CCR9, ajustada para conter números iguais de pDC, foi I. V. transferida em receptores B6. Após 18 h de transferência, que primeiro analisou a composição de adoptively transferidos WT células presentes no IE, bem como LP preparação e notei que 54% e 25% de todas as células recuperadas a partir do IE e LP fração, respectivamente, foram pDC (Fig. 4 B). Estes achados demonstram que entre as diversas populações de células transferiram pDC para casa de forma mais eficiente para o intestino. Estas transferências competitivas também revelaram que os pDC deficientes em CCR9 estão em grande parte prejudicados na sua capacidade para abrigar o intestino, como refletido pelo baixo rácio de migração do pDC deficiente em CCR9 vs. WT encontrado na preparação IE e LP (Fig. 4 D). Em contraste, CCR9-deficiente e B6 pDC migraram com eficiência similar aos gânglios linfáticos periféricos e mesentéricos (Fig. 4 D). A natureza da rotulagem celular não teve impacto nestes experimentos porque a troca de corantes entre B6 e CCR9−/− células produziu resultados idênticos (dados não mostrados). Embora estes dados demonstrem claramente que a pDC exige CCR9 para uma localização eficiente do intestino, deve-se mencionar que as propriedades de tráfico de pDC de ratos tratados com ligando-Flt3 podem ser diferentes das presentes em situações fisiológicas.Fig. 4.

CCR9-localização dependente de pDC para o intestino delgado. A DC (A-D E F) foi expandida in vivo através do tratamento de ratos com deficiência de B6 e CCR9 com células tumorais secretoras de Flt3L. A) os Esplenócitos de dadores de B6 foram analisados quanto à presença de pDC (B220+Ly6C+). B) os esplenócitos expandidos de WT3L não purificados foram rotulados com CFSE e i. v. injectados nos receptores. A ocorrência de pDC dador na preparação IE (superior) e LP (inferior) do receptor foi analisada 18 h mais tarde (porta nas células CFSE+). A E B) os dados apresentados são representativos de cinco animais de duas experiências independentes. C) os esplenócitos CD11+B220+Ly6C+ pDC em esplenócitos expandidos de Flt3L de ratos B6 (superior) e com deficiência de CCR9 (inferior) foram manchados para a expressão de diferentes receptores de quimiocina, tal como indicado. D) Os Esplenócitos isolados de ratinhos com deficiência em B6 tratados com Flt3L ou CCR9 foram rotulados com CFSE e TAMRA, respectivamente. As células foram ajustadas para um número igual de pDC e injectadas numa proporção de 1:1 nos receptores B6. Após 18 h, os receptores foram mortos, e a razão do doador B6 e ccr9-deficiente pDC foi analisada na preparação IE e LP do receptor do intestino e do nódulo linfático inguinal (ILN) e mesentérico (MLN) (média + SD; n = 5-9 receptores). E) os ratinhos com deficiência em WT ( + / + ) e CCR9 (- / − ) receberam 10 µg de TC ou solução salina por via oral. Após 1 h, os animais foram mortos, e o número de pDC presente no intestino delgado, ou seja, a preparação foi determinada. Os círculos representam ratos individuais; as barras são valores médios. Resultados semelhantes foram obtidos em duas experiências adicionais. F) Os esplenócitos marcados com CFSE, isolados de esplenócitos tratados com Flt3L B6 e de esplenócitos marcados com TAMRA, isolados de ratinhos com deficiência de Ccr9 tratados com Flt3L, foram transferidos para ratinhos com deficiência de CCR9 numa proporção de 1:1. Após 18 h, os receptores foram gavaged oralmente com 10 µg de TC. Uma hora depois, ratos foram mortos, e o número marcado de WT (+/+) e CCR9−/− (−/−) pDC isolado a partir da preparação IE e LP foi analisado. Os círculos representam ratos individuais; as barras são valores médios.

pDC são recrutados para o intestino inflamado.

porque se sabe que pDC desempenha um papel importante na imunidade anti-viral (4, 10) especulamos que pDC pode ser recrutado para o intestino durante processos inflamatórios para fortalecer a defesa de primeira linha. Sabe-se que a toxina da cólera (CT) induz inflamação intestinal quando administrada por via oral e foi relatado que, no período de 2 horas após a aplicação oral, o número de mDC recrutado transitoriamente para o intestino aumenta 4 vezes (15). Observamos que, além do mDC, o número de pDC também aumentou 3 vezes ao alimentar ratos B6 com 10 µg de CT (Fig. 4 E). De interesse, a configuração experimental idêntica nunca resultou em qualquer aumento de pDC nem no IE nem na preparação LP de ratos com deficiência em CCR9 após 1, 2 ou 3 h de tratamento com CT (Fig. 4 e e dados não apresentados). O requisito específico para a CCR9 em pDC para o seu recrutamento para o intestino durante os processos inflamatórios foi confirmado pela transferência adoptiva de pDC deficiente em WT e CCR9 para receptores deficientes em CCR9, seguida pela aplicação da TC como descrito acima. Enquanto os pDC adotivamente transferidos de WT estavam amplamente presentes na preparação IE e LP, os pDC deficientes em CCR9 foram quase completamente excluídos destes compartimentos (Fig. 4 F). Juntos, estes resultados mostram que durante os eventos inflamatórios pDC pode ser recrutado para a mucosa intestinal e que este mecanismo depende de uma grande extensão em CCR9.

Um papel para a pDC Intestinal para a rápida mobilização da DC mielóide LP.

tem sido demonstrado recentemente que a aplicação oral do ligando tlr7 / 8 resiquimod (R848) resulta na rápida mobilização do LP DC e que o TNFa, possivelmente lançado pelo pDC, está envolvido neste processo (16). Especulou-se que o pDC intestinal poderia ser a fonte de TNFa que potencialmente desencadeia a mobilização do mDC vizinho. Para testar esta hipótese, estimulamos in vitro B6 pDC da preparação IE e LP para 16 h com R848. Na verdade, o pDC segregou quantidades consideráveis de TNFa, mas não conseguiu produzir quaisquer quantidades detectáveis de IL-2, IL-4, IL-5 ou IFNy (Fig. 5 A). Em seguida, analisamos a mobilização do MDC LP in vivo após aplicação oral do R848. Enquanto que o B6 e o CCR9−/− ratinhos não tratados não diferiam quanto à presença de mDC intestinal(Fig. 5 b), within 2 h oral R848 induced the mobilization of ≈60% of mDC in WT but only 10.8% in CCR9 – / – mice. Importante é que, uma vez que ratos I. V. com deficiência em CCR9 receberam pDC esplênico de dadores de FLT3L tratados com WT 16 h antes da aplicação oral de R848, esta deficiência na mobilização do mDC intestinal pode ser completamente resgatada (Fig. 5 C). Estes experimentos mostram que uma localização CCR9 dependente de pDC para o intestino está envolvida na rápida mobilização de mDC intestinal após a aplicação oral de um ligante TLR7/8. Como foi demonstrado por outros no modelo rat que a aplicação de LPS também induz a mobilização de LP mDC (17), aplicamos 50 µg de LPS I. p.A animais com deficiência em WT e CCR9. De interesse, nestas condições experimentais, não observamos qualquer diferença entre animais deficientes em WT e CCR9 no que diz respeito à mobilização de LP mDC (SI Fig. 9).Fig. 5. a mobilização rápida do mDC da punção lombar depende do pDC intestinal. A) perfil do conjunto de placas de citoquina a partir do sobrenadante da preparação Triada IE (esquerda) e LP (direita) após estimulação in vitro de 16 h na ausência (−R848) ou presença (+R848) de R848. Controlo, meio de cultura celular. B) percentagem de LP mDC (CD45+CD11c+MHCIIhigh) de ratinhos não tratados (média +DP, n = 6 por grupo). C) WT (coluna aberta) ou CCR9−/− mice (coluna negra) foram gavados oralmente com 10 µg de R848. Após 2 h, o número de mDC (CD45+CD11c+MHCIIhigh) presente na LP do intestino delgado foi determinado e expresso em percentagem do controlo WT não tratado. Cinza de coluna, CCR9−/− ratos do que eu.v. recebeu MACS-purificada B6 pDC 16 h antes R848 tratamento (média + DP; n = 6 a 11 de ratos por grupo; ns, não significativo; ∗∗, P < 0.01; ∗∗∗, P < 0.001).