Para otimizar o número de MS2-tronco loops usada para marcar o teste de RNA, Xist(A) foi fundida com duas, quatro, seis, dez ou 24 MS2-tronco loops, e de suas interações com um conjunto de controle proteínas foram testados em uma pequena escala incPRINT experiência. Um aumento na intensidade de luminescência directamente correlacionado com um aumento do número de loops de caule MS2 até dez loops de caule, sem aumento marcado na ligação ao controlo EGFP (Fig. suplementar. 1b). Portanto, em todos os experimentos subsequentes de impressão, os RNAs foram marcados com dez loops de haste MS2.

para determinar se as interacções ARN–proteínas detectadas pela impressão in vitro ocorreram de facto nas células ou surgiram apenas In vitro após lisis16,17,18, o sinal de luminescência de dois ensaios independentes foi medido e comparado. Na primeira experiência, o RNA Xist(a)-MS2 e as proteínas de teste marcadas com bandeira foram co-transfectadas na mesma população celular, tal como acima descrito. Na segunda experiência, o RNA Xist(a)-MS2 e as proteínas de teste marcadas com bandeira foram transfectados separadamente em duas populações celulares diferentes e agrupados apenas após a fase de lise celular, permitindo a formação de complexos proteicos de RNA exclusivamente in vitro (Fig. suplementar. 1c). Descobrimos que as interações foram detectadas preferencialmente quando o RNA Xist (a)-MS2 e as proteínas marcadas com a bandeira foram co-transfectadas (a condição padrão de impressão Inc; Fig. 2b). Estes resultados sugerem que, sempre que um sinal de interacção foi detectado por impressão incisiva, este deriva dos complexos proteicos ARN formados nas células, enquanto a Associação dos complexos proteicos RNA–lise pós–célula aparecia como um fundo negligenciável sob condições específicas do incisivo (Fig. 2b). Em conjunto, estes experimentos estabelecem que a impressão incisiva mede as interações celulares RNA–proteína usando uma leitura de luminescência.

deteção de alto rendimento de interações RNA-proteínas

para testar a escalabilidade da impressão para a identificação sistemática de interações RNA–proteínas, interrogámos a nossa biblioteca personalizada de ~3000 proteínas humanas marcadas com bandeira (incluindo ∼1500 RBPs10,11,, 1300 factors12 e ∼170 proteínas associadas à cromatina), com Xist(a)–MS2. Para reforçar a confiança nas interacções ARN-proteínas identificadas pelo incrint, todas as interacções foram avaliadas em duplicado biológico, gerando dois valores de luminescência (intensidade da interacção ARN–proteína) e dois valores ELISA (nível de expressão da proteína de teste) para cada casal de proteínas de ARN testado. Após filtrar as proteínas expressas em níveis insuficientes (ver a secção “métodos”), foram analisados dados de interacção para 2405 proteínas. a reprodutibilidade da impressão foi avaliada calculando as pontuações de correlação dos duplicados biológicos para a luminescência(Fig. 2c; R2 = 0.87) e os sinais ELISA (Fig. 2d; R2 = 0, 99). Notavelmente, não foi detectada qualquer correlação entre os valores de luminescência e ELISA, indicando que as intensidades de interacção não eram um mero reflexo dos níveis de expressão proteica (Fig. 2e). Em resumo, nossos dados demonstram que a impressão é um método de alto rendimento escalável que mede reprodutivelmente as interações RNA-proteína nas células.

a impressão digital identifica o proteoma de RNAs pouco expressas

a seguir, procurámos testar se a impressão digital pode identificar de forma robusta proteínas que interagem com transcrições expressas em níveis endógenos Baixos. A identificação de proteínas associadas ao baixo número de cópias RNAs é geralmente desafiadora quando se utilizam abordagens de captura-MS de afinidade de RNA devido à baixa eficiência das purificações de RNA e à grande quantidade de material necessário para a espectrometria de massa. Como Firre é um lncRNA funcionalmente importante que modula a arquitetura nuclear de maior ordem através dos cromossomos 19 e é de uma abundância endógena bastante baixa (∼20 moléculas por célula com base em dados RNA-Seq em diferentes tecidos do rato), nós avaliamos seu RBP-interactoma com impressão. A transcrição de Firre de comprimento total marcada pelo MS2 foi expressa em ∼40 vezes superior ao FIRRE endógeno nas células HEK293T utilizadas para o incrint (Fig. suplementar. 2a). Como relatado para a transcript19 endógena, Firre-MS2 foi preferencialmente localizado para o núcleo (figura suplementar. 2b). Interrogando a nossa biblioteca de ~ 3000 proteínas, o incrint identificou um conjunto de proteínas específicas como interactores Firre (Fig. 3a, pontos vermelhos; dados suplementares 1), enquanto que a maioria das proteínas não interagiu com o Firre (Fig. 3a, pontos cinzentos; dados suplementares 1). Importante, a impressão identificou proteínas conhecidas e novas que interagem pela primeira vez. CTCF e HNRNPU, anteriormente relatados por dois estudos independentes para ligar Firre e ser importante para a sua function19,20, também foram identificados por incPRINT (Fig. 3a). Para validar a ligação de novos interactores Firre, analisamos o ENCODE eCLIP data21. Os dados do eCLIP, disponíveis para sete RBPs identificáveis pela primeira vez em interacção, confirmaram a sua ligação ao Firre na linha de células K562, validando ainda mais o método incrint(Supplementary Fig. 2C; dados suplementares 2). Coerente com o papel de Firre nuclear organization19, um conjunto de Firre interactianos identificados por incPRINT foram cromatina associada a proteínas, incluindo CHD1, POU5F1, JARID2, EPC1, SATB1, MECP2, AEBP2, e CTCF (Dados Suplementares 1). Análises do domínio proteico mostraram que as proteínas em interacção com o Firre foram significativamente enriquecidas para o motivo de reconhecimento de ARN (RRM) (Fig. 3b; dados suplementares 3).

Para determinar se o RNA sobreexpressão foi necessário para incPRINT de identificar com sucesso as proteínas de ligação ao RNA com baixos níveis endógenos, um conjunto de proteínas, que foi testado com diferentes concentrações de Firre-MS2, variando de sobreexpressão como descrito acima para os níveis comparáveis aos endógenos FIRRE em células HEK293T (Complementar Fig. 2d, e). Embora a sobreexpressão do ARN tenha resultado em maiores pontuações de interacção, permitindo uma melhor separação das Pontuações de fundo, o sinal de luciferase foi robustamente detectável acima do sinal de fundo quando foram utilizadas diluições do Firre-MS2 (Fig. suplementar. 2d). O importante é que este sinal não estava associado aos níveis de expressão da proteína testada (Figo suplementar. 2e). Em conjunto, estes dados demonstram a utilidade da impressão inculcada na identificação de proteínas associadas a transcrições expressas em níveis endógenos Baixos.

a impressão identifica parceiros de interação RNA-região específicos

porque muitas lncRNAs funcionam como andaimes modulares, permitindo a ligação de RBPs específicos a domains1,5 Rna discretos, procurámos testar se a impressão permite a identificação de interações específicas RNA-domínio. Uma molécula de prova-de-princípio ideal é o lncRNA Xist, dado o seu papel vital na inactivação do cromossoma X-mamífero (XCI)22,23, e a sua estrutura modular e função. A ∼17 kb longo Xist transcrição contém vários conservada sequência regiões (chamado repete A A F) que realizam funções distintas durante o XCI processo, incluindo a inicialização de silenciamento de genes (a repetir), a manutenção do X-estado inativo (a – F e B-repetições) e a adequada localização cromossômica e focal acumulação de Xist (C – e E-repete)13,24,25,26,27,28,29,30,31,32 (Fig. 4a). Além disso, vários estudos independentes identificaram e validaram previamente um conjunto de interacções funcionais proteicas com o Xist7 completo.,14,15,26,28,33,34,35. Nós buscamos aplicar a impressão em três regiões conservadas do mouse Xist, isto é, Xist(a), Xist(F), E Xist(C) (Fig. 4a). Quando expresso em células HEK293T usadas para impressão incisiva, cada fragmento Xist-MS2 mostrou um nível de expressão diferente em comparação com o xist endógeno, variando de um aumento de ∼60 vezes para Xist (a) a um nível de expressão quase endógena para Xist(C) (Fig. suplementar. 3a). Todos os fragmentos individuais de Xist-MS2 foram preferencialmente localizados ao núcleo, da mesma forma que a sua homóloga endógena de comprimento total (figura suplementar. 3b). Cada região Xist (i.e., Xist( a), Xist(F), E Xist(c)) foram interrogados com a nossa biblioteca de ~3000 proteínas. Comparar os sinais em cada região Xist expressos em diferentes níveis (Fig. suplementar. 3c), as pontuações de interação para cada região Xist foram normalizadas usando os dados de ligação ao ARN MS2 (dados suplementares 4). Para a normalização, um conjunto de 200 proteínas com classificação superior de luciferase no conjunto de dados de RNA MS2 foi definido como ligantes comuns de todos os RNAs marcados com MS2. Os aglutinantes comuns foram então identificados em cada conjunto de dados e a sua pontuação mediana de interacção foi calculada para cada ARN testado e utilizada para normalizar as intensidades de luminescência bruta em cada conjunto de dados (ver a secção “métodos”). Notavelmente, dados MS2 não foram usados como um controle de especificidade de ligação, como muitos RBPs reconhecem motivos RNA de baixa complexidade, presentes também dentro da tag MS2, e uma vez que a ligação às proteínas MS2 não exclui uma potencial interação funcional com um RNA de teste. Da mesma forma que Firre, descobrimos que a maioria das proteínas não se ligava a nenhum dos fragmentos xist testados (Fig. 4B-d, pontos cinzentos; dados suplementares 4) , enquanto que conjuntos específicos de proteínas foram identificados para interagir com cada região Xist individual (Fig. 4B-d, pontos vermelhos; dados suplementares 4). Importante é que, entre as proteínas Xist-interactantes identificadas pela impressão, encontramos parceiros de interação bem conhecidos do Xist identificados em estudos anteriores para ligar a transcript7, 14, 15 (indicado na Fig. 4B-d, quadro Complementar 1). Comparando os conjuntos de incPRINT-identificadas proteínas e a sua interacção com as pontuações de cada interrogado Xist região (Dados Suplementares 4), descobrimos que cada Xist fragmento interage com um conjunto de proteínas específicas para a região correspondente, com uma pequena fração do RBPs obrigatório para todos os três Xist regiões (Fig. 4e). Assim, a aplicação de impressão incisiva a três regiões conservadas de Xist permitiu a identificação e atribuição a regiões específicas de RNA de RBPs previamente determinadas a vincular o comprimento total de xist transcript7, 14, 15(Fig. 4e; proteínas conhecidas com interacção Xist são indicadas à direita). Por exemplo, a impressão incisiva identificou SPEN como um interactor específico de Xist(a) (Fig. 4e), confirmando achadosanteriores7, 8. Da mesma forma, RBM15, RBM15B e YTHDC1 foram identificados por incPRINT para interagir especificamente com Xist(A) e Xist(F), mas não Xist(C), confirmando-se o seu enlace para o 5′ fim do Xist7,9 (Fig. 4e). Além disso,identificamos uma interação específica do Xist(C) com o HNRNPU (também conhecido como SAF-A) anteriormente demonstrado estar envolvido em xist localization7,14, 33 (Fig. Quadro 1). Para validar as interações xist-protein específicas de RNA-região, o encode eCLIP data21 disponível para 14 proteínas identificadas por incisões, várias das quais são RPBs novos que interagem Xist, confirmou a sua ligação ao XIST na linha K562 (Supplementary Fig. 3d; dados suplementares 2), corroborando ainda mais a especificidade do nosso método. Uma diferença funcional entre os interactomas proteicos das três regiões Xist foi confirmada por análises de enriquecimento de Gene (GO). Consistente com as funções diferenciais relatadas para as regiões xist individuais, as proteínas associadas a Xist(A) E Xist(F) foram enriquecidas para RBPs envolvidas no processamento de RNA, enquanto a região c – repeat preferencialmente interagiu com proteínas de ligação ao DNA envolvidas na regulação transcritional (Fig. suplementar. 3e, f). De acordo com a análise, a proteína de domínio a análise demonstrou que Xist(A)-interação de proteínas foram enriquecidos por SPOC (Spen paralog e ortholog C-terminal) e MRR proteína domínios, Xist(F)-interação de proteínas foram enriquecidos para o MRR domínio e Xist(C)-interação de proteínas não mostrou particular de enriquecimento (Fig. 4F; dados suplementares 3), destacando ainda mais a especificidade dos conjuntos de proteínas incrint identificados para cada região Xist. In summary, incPRINT successfully retrieved known Xist-protein interactions and uncovered novel RBPs. Ao identificar conjuntos específicos de proteínas interagindo com regiões individuais conservadas de um lncRNA modular, temos demonstrado que o incrint permite a atribuição específica da região de interações RNA-proteína.

incPRINT identifica funcional RNA–proteína medicamentosas

Devido a Xist tem uma bem caracterizada celular em função de silenciamento de genes durante XCI, procurou-se testar se alguns dos Xist-proteína medicamentosas descobertos usando o incPRINT são funcionalmente relevantes. O foco foi na proteína ZZZ3, que interage com as três regiões testadas Xist, e RBM6, que exibe uma ligação mais específica para as regiões Xist(a) e Xist(F) (Fig. 4e). Em primeiro lugar, confirmámos a interacção do Xist com o RBM6 e o ZZZ3 em condições endógenas, testando a co-precipitação do Xist com ambas as proteínas nas células estaminais embrionárias do Ratinho. As proteínas foram marcadas HA-tag na linha celular polimórfica TX1072 ES que permite a expressão xist induzida pela doxiciclina, desencadeando XCI na ausência de diferenciação31,37,38,39. Imunoprecipitação RNA (RIP) após indução da Doxiciclina de ligação cruzada das células Xist e UV, seguida de análises qRT-PCR, identificou um enriquecimento significativo da transcrição Xist com proteínas RBM6 e ZZZ3, confirmando a sua interacção in vivo (Fig. 5a, b). Notavelmente, a incPRINT também identificou a RBM6 como interagindo com a Firre. O RIP qRT-PCR detectou uma interacção específica do Firre com o RBM6, mas não com o ZZZ3, confirmando assim a ligação do Firre-RBM6 em condições endógenas e validando ainda mais os nossos resultados incisivos(Fig. 5a, b).

em seguida, para testar se RBM6 e ZZZ3 ter um impacto sobre XCI, usamos de célula única de RNA hibridização fluorescente in situ (RNA PEIXE) para avaliar a expressão endógena Lamp2, um X-linked gene que normalmente é silenciado durante XCI initiation40. Upon doxiciclina-induced Xist expression, depletion of Rbm6, Zzz3, and positive control Spen(Supplementary Fig. 4a, b) levou à redução do silenciamento de Lamp2, enquanto a sua expressão mono-alélica induzida por XCI permaneceu inalterada após o esgotamento do Thap7, que não interagiu com o Xist e foi usado como um controle negativo (Fig. 5c, d; suplementar Fig. Quadro 2). Na ausência de xist (- condições de doxiciclina), a expressão de Lamp2 permaneceu inalterada após a depleção das proteínas acima (Figo suplementar. Quadro 2). O importante é que os defeitos no silenciamento do cromossoma X não foram desencadeados pela expressão alterada de Xist/Tsix após a depleção das proteínas individuais (Figo suplementar. 4e). Em resumo, a identificação de interactores funcionalmente importantes entre os RBPs identificados pelo incrint demonstra o potencial de descoberta do incrint.