Resumo

Voltage-gated L-tipo de Cav1.2 canais de cálcio casal despolarização da membrana para o aumento transiente em citoplasmática livre de Ca2+ concentração, que inicia uma série de funções celulares essenciais, incluindo cardíaca e vascular, contração muscular, a expressão do gene, plasticidade neuronal, e ar. A inactivação ou interrupção espontânea da Corrente de cálcio através da Cav1.2 é um passo crítico na regulação destes processos. O significado fisiopatológico deste processo manifesta-se na hipertensão, insuficiência cardíaca, arritmia e uma série de outras doenças em que a aceleração do decaimento da Corrente de cálcio deve apresentar uma função de benefício. A questão central deste artigo é a inactivação do canal de cálcio Cav1.2 mediado por vários determinantes.

1. Introdução

a corrente Ca2+ interior fechada de voltagem () é um mecanismo comum de aumento transitório da concentração Ca2+ livre de citoplasma desencadeada pela despolarização celular. Esta forma de sinalização Ca2 + activa os processos celulares essenciais, incluindo contracção cardíaca , regulação do tónus muscular liso , expressão genética, plasticidade sináptica e exocitose . A terminação completa e rápida do afluxo de Ca2+ é mediada por um mecanismo intrincado de inactivação espontânea do canal de cálcio, que é crucial para evitar o sobrecarga de Ca2+ da célula durante os potenciais de acção e para restaurar a concentração de Ca2+ livre de citoplasmismo sub-µM em repouso . Este artigo incidirá na Base molecular e em múltiplos determinantes da inactivação do canal de cálcio Cav1.2.2. Cav1. 2: Desafios e soluções

2.1. A complexidade Molecular

o canal de cálcio Cav1.2 é um complexo oligomérico composto pelas subunidades A1c, α2δ e β . O poro do canal iónico é formado pelo peptídeo A1C (Figura 1) que é codificado pelo gene CACNA1C. As subunidades auxiliares β e α2δ são essenciais para a expressão funcional e membrana plasmática (PM) direccionar o canal . Existem em isoformas genómicas múltiplas geradas por quatro genes CACNB (CACNB1-4) e três genes CACNA2D (CACNA2D1–3). Todas as três subunidades estão sujeitas a splicing alternativo. Adicionando à complexidade da organização molecular Cav1.2, subunidades β tendem a oligomerizar . Todos juntos, variabilidade genômica, splicing alternativo, e hetero-oligomerização geram uma pletora de variantes de splice Cav1.2 que são expressas em células de forma dependente de espécies, tecidos e desenvolvimento, enquanto a mudança de seu equilíbrio fino pode ter consequências patofisiológicas significativas .

Figura 1

Transmembrana topologia da α 1C subunidade. Para ilustrar os locais de diversidade molecular, a sequência polipéptida é esquematicamente segmentada de acordo com o mapa genômico CACNA1C e os exons invariantes (preto) e alternativos (azul) correspondentes são delineados por barras pretas e numerados (1-50). Acredita–se que quatro regiões de homologia (I-IV), cada uma composta por 6 segmentos transmembranares (numerados), sejam dobradas em torno do poro central. domínio de interação α (AID) de um site constitutivo β-binding é mostrado em verde. Os motivos LA e IQ (vermelho) constituem o domínio de ligação da calmodulina (CBD).

2.2. Os desafios na seleção da célula hospedeira

diversidade de ocorrência natural da Cav1. 2 complica a interpretação dos dados obtidos a partir de células nativas, muito menos os dados de um único canal. Isto está subjacente à importância da pesquisa de Cav1.2 em sistemas de expressão recombinante onde a composição molecular do canal e a estrutura de seus constituintes são predefinidos. No entanto, esta abordagem experimental encontrou o maior problema da selecção de uma célula hospedeira apropriada.a maioria dos estudos com canais de cálcio foram realizados utilizando células HEK293. Estas células proporcionam uma elevada eficiência de expressão dos canais Ca2 + recombinantes mas, infelizmente, contêm canais endógenos de cálcio que exibem correntes Ca2+ até 3 pA/pF . Assim, as células HEK293 permitem o estudo adequado dos canais de Ca2+ recombinantes apenas quando a amplitude da corrente é grande o suficiente para ignorar a contribuição dos canais endógenos. A avaliação correcta dos determinantes funcionais dos canais Ca2+ requer, no entanto, a utilização de células hospedeiras completamente isentas de subunidades endógenas de canais Ca2+. As células COS1 ou COS7 satisfazem bem esta exigência porque não geram uma corrente de cálcio apreciável, não contêm subunidades endógenas dos canais Ca2+ ou seus precursores e não apresentam qualquer indução das subunidades endógenas Cav1.2 em resposta à expressão das subunidades recombinantes . Os parâmetros cinéticos e a dependência da tensão de activação e inactivação das correntes de canal da Cav1.2, medidas nas células COS1, são consistentes com os dados obtidos noutros sistemas de expressão . Uma vantagem importante das células COS é a sua taxa de divisão relativamente lenta que permite um melhor controle sobre a eficiência de expressão e montagem das subunidades de canal Cav1.2 de diferentes tamanhos.

2, 3. Problemas Fluorescentes, de Rotulagem e de Medição

Fusão de GFP-como fluoróforos para o N – e/ou C-termini da recombinante a1C ou para o N-terminal de β não marcadamente alterar as propriedades eletrofisiológicas do expresso canais, permite a aplicação de lâmpadas fluorescentes e de TRASTES (fluorescente de transferência de energia por ressonância) microscopia para o estudo da distribuição subcelular e montagem de Cav1.2, bem como os intrincados aspectos da arquitetura molecular e dinâmica do canal. O canal mantém as principais características electrofisiológicas inalteradas quando a sequência C-terminal A1C codificada por exões distais 46-50 (Figura 1, resíduos 1833-2138 em a1C,77) é substituída pela ECFP. No entanto, o a1C fundido pelo seu n – or/E C-termini ao EYFP é altamente sensível ao fotobleaching que o inativa irreversivelmente. Conhecida como inactivação de luz assistida por fluoróforos (FALI), esta propriedade interessante limita a aplicabilidade do fotobleaching aceitador para as medições de FRET na Cav1.2 devido à incerteza no estado funcional do canal . No entanto, a análise ratiométrica da FRET corrigida entre os fluoróforos, fundida às caudas das subunidades A1C e/ou β, reflete os rearranjos estruturais reversíveis dependentes do Estado do canal induzidos pelas mudanças de tensão transmembranar sob grampo .

2, 4. Cav1.2 recombinante: o que ele precisa para a expressão funcional e como ele aparece?

as propriedades típicas de uma Cav1.2 recombinante de tipo selvagem são ilustradas na Figura 2(a) utilizando um exemplo da A1C humana omnipresente,77 isoforma (GenBank no. z34815). Quando o A1C marcado pelo EYFP foi expresso apenas em células COS1, a proteína do canal marcado fluorescente foi difusamente distribuída sobre o citoplasma e não gerou corrente mensurável de cálcio (Figura 2(a), painel a). A análise quantitativa da distribuição de a1C entre PM e o citoplasma (Figura 2(b)) confirmou a ausência de um alvo significativo de PM por parte da a1C independentemente da presença de α2δ (barras a e b). Expressão de Cavß na ausência de um alvo de partículas estimulado de α2δ de a1C, mas o canal permaneceu silencioso (Figura 2(a), painel c) a menos que o α2δ fosse Co-expresso (painel d). Assim, as subunidades β e α2δ são suficientes para o canal funcional; nestas condições experimentais, as subunidades β estimulam a focalização de partículas do complexo do canal e, na presença de α2δ, facilitam a regulação da tensão do canal Cav1.2.

Figura 2

Função do Cav1.2 auxiliar de subunidades. A) imagens Epifluorescentes das células COS1 que expressam a distribuição de EYFPN-α 1C obtidas com o filtro YFP (barras de escalação, 4 µm) e Vestígios da corrente máxima de cálcio registada em resposta a 600 ms passos para +30 mV da exploração potencial mV (esquerda). (B) distribuição Relativa de EYFPN-α 1C na membrana plasmática (MP) sobre o citoplasma na ausência (a) ou presença de α 2δ (b), β 2d (c), ou α 2δ + β 2d (d). A razão de intensidade de fluorescência em partículas sobre a área debaixo de partículas foi calculada com base na subtração de fundo em cada célula. A proporção é inferior a 1.0 indica falta de um alvo de PM significativo por α1c.*.

a forma e a aparência da Corrente de cálcio de pico mostrada na Figura 2(a) (Painel d) é bastante típica da Cav1.2 modulada por β2 . Suas principais características incluem a taxa de decaimento relativamente lenta e uma grande fração do restante sustentado do pulso despolarizante . É evidente que, durante os potenciais de acção de longa duração, tais propriedades podem levar a uma sobrecarga patogénica de cálcio da célula se não for compensada por mecanismos de compensação robustos. Era o papel final de Cav1.2 ao definir a duração do potencial de ação em células cardíacas que desencadeou a pesquisa e desenvolvimento de bloqueadores de canais de cálcio, uma classe de medicamentos que por agora tem um mercado de bilhões de dólares. É este papel da Cav1.2 que estimula o interesse atual na identificação de determinantes moleculares da inactivação da Cav1.2 na esperança de encontrar drogas mais específicas e mais eficazes.

2, 5. Por último, mas não menos importante, uma complicação: Clustering Cav1.2

um único myocyte ventricular contém ~300,000 canais Cav1. 2, mas apenas ~3% dos canais estão abertos no pico . Ao contrário da crença popular, os canais Cav1.2 não são distribuídos uniformemente sobre a membrana plasmática. Nas células nativas dos músculos neuronais e cardíacos formam grandes aglomerados. A imagem de uma única molécula dos canais funcionais recombinantes EYFPN-A1C/ß2a/α2δ expressos em células HEK293 revelou aglomerados compostos por ~40 canais que eram móveis na membrana plasmática . Tanto a espectroscopia de correlação de fluorescência como a recuperação de fluorescência após experiências de fotobleaching produziram uma constante de difusão lateral de µm2/S. O significado funcional da mobilidade dos aglomerados da Cav1. 2 não é claro. Acredita-se que em células musculares cardíacas tal mobilidade pode ser restringida por interações com outras proteínas, por exemplo, receptores de ryanodina . O tamanho dos clusters Cav1.2 e sua densidade específica na membrana plasmática dependem do tipo de subunidade β expressa . A distância entre o término das subunidades A1C vizinhas varia de 67 Å com ß1b neuronal/cardíaco a 79 Å com β3 vascular. Observou-se a maior densidade de aglomerados de Cav1.2 na membrana plasmática e o menor tamanho do aglomerado com ß1b presente. Insight into molecular mechanisms defining the architecture and properties of Cav1. 2 clusters is important for better understanding of pathophysiology of the coupling between the Cav1.2 activity and the induced responses in Ca2+ signal transduction.

3. Inactivação dependente da tensão e Ca2+do canal de cálcio Cav1.2

no caso dos canais de cálcio Cav1.2, dois mecanismos diferentes controlam a inactivação da corrente Ca2+. Um mecanismo é impulsionado por íons Ca2+ no lado citoplásmico da membrana plasmática, enquanto o outro depende da tensão transmembranar. Experimentalmente, a substituição de Ca2+ para Ba2+ como o transportador de carga elimina a inactivação dependente de Ca2+(CDI) de modo que os canais de cálcio condutores de Ba2+inactivam de forma dependente da tensão por mecanismos rápidos (FI) e lentos (SI). Estes três mecanismos de inactivação, FI, SI e CDI, e os seus principais determinantes são ilustrados na Figura 3.

Figura 3

Molecular determinantes de Cav1.2 inativação. Comparação da Cav1 de tipo selvagem.2 A) com o mesmo canal privado de determinantes CDI (B) e SI (c). Os cinco painéis horizontais apresentam a) disposição dos determinantes críticos da inactivação. ADSI é composto por aminoácidos hidrofóbicos conservados na posição A -2 de segmentos S6 em repetates II, III e IV (círculos amarelos: Ala, Val, e Ile, resp.), bem como resíduo de Ser em -1 posição de IS6 (círculo ciano). O domínio CaM-binding (CBD) Da α 1C C-tail é mostrado por um retângulo vermelho arredondado. A subunidade β (verde) liga-se ao domínio de interação α No linker entre repetições I e II, e, de uma maneira Ca2+-dependente, à região IQ da subunidade α 1C c-tail (, não mostrado). A estrutura distal de β 2 (β 2CED, bola azul) liga-se à CBD . B) prova da coimmunoprecipitação das subunidades indicadas. c) os traços normalizados de (preto) e (vermelho) e (d) dependência de voltagem de (vermelho) e constante de tempo de FI (preto) são apresentados para ilustrar CDI em (A) e falta de CDI em (B) E (C). e) ligação entre o CDI e a modulação diferencial β-subunidade (DßM) da Cav1.2. (A) modulação diferencial da inactivação Por β 1a (Traço Negro) e β 2a (traço verde) na WT Cav1.2. A perturbação da CDB (α1c,86) elimina o CDI e o SI visados pelo CDI e pelo DßM (B). Mutação de ADSI (α 1C,IS-IV) CDI removido e SI totalmente inibido de modo que o canal continue conduzindo durante a duração do estímulo de despolarização (C).

3.1. De Ca2+Dependentes de Inativação e Calmodulin-Domínio de Ligação de a1C

Existem vários tipos de determinantes do CDI, mas não foi só em 1997 que o Ca2+-detecção site do CDI tinha sido reduzido para um trecho de 80-amino-ácido C-terminal da seqüência de a1C codificado pelo exon 40-42 (Figura 2) foi marcado por bloco vermelho na Figura 3(A) (painel a). Uma variação natural da unidade nesta região em A1C, 86 [Figura 3 (b)] inibiu completamente o CDI, uma vez que é evidente pela falta de desaceleração da corrente com Ba2+ como suporte de carga (painel c, traço preto) em comparação com (traço vermelho). Outra característica do CDI inibido foi a falta da dependência do tamanho atual da tensão (Figura 3 (b), painel d, símbolos abertos) que permanece em contraste com a dependência em forma de U da constante de tempo de inativação rápida () do potencial de membrana no tipo selvagem Cav1.2 (ver Figura 3(a), painel d). Duas sequências distintas, L E K, foram identificadas dentro deste estiramento de 80 aminoácidos, cujas mutações tipo A1C, 86 no tipo selvagem A1C se conformam com as mesmas características , sugerindo a existência de dois sensores CDI adjacentes. Um deles foi descrito na região K como o motivo de ligação IQ da calmodulina (CaM) e, mais tarde, a ligação do motivo IQ ao CDI como o local de ligação funcional Ca2+ – CaM foi confirmado em três estudos independentes pelo uso de mutantes da CaM sem afinidade com Ca2+. Correspondentemente, o motivo LA foi ligado ao CDI como local de ligação apo-CaM dotado pelo Estado de repouso do canal. Uma molécula de CaM única ligada a este domínio de ligação de CaM (CBD) dependente de Ca2+do A1C é o principal sensor de Ca2+ do canal .

Emenda variação de a1C em CDB região de a1C,86 não só inibe completamente o CDI, mas também remove SI (Figura 3(B), painel c) e priva o canal do diferencial de sensibilidade para β-subunidade de modulação (Figura 3(B), painel e) apesar do fato de que β permanece associado com a1C,86 (Figura 3(B), painel b). Isto indica que todas as três propriedades do canal—CDI, SI e β-modulação subunit—estão ligadas entre si .

3, 2. Inactivação lenta

foi apresentada uma série de evidências de que os aminoácidos confinados à parte distal dos segmentos S6 em A1C desempenham um papel importante no SI . O estudo sistemático da região descrito o “anual determinante de inativação lenta” (ADSI) como uma estrutura composta de quatro aminoácidos altamente conservados de quatro segmentos transmembrana S6, constituindo citoplasmática final do poro (Figura 3(A), painel a). Sua mutação simultânea (S405I em IS6, A752T em IIS6, V1165T em IIIS6, e I1475T em IVS6) gera o canal A1C,IS-IV. A análise da cinética atual do canal A1C, is-IV, mostrou uma aceleração tremenda do componente de rápida inactivação ( ≤ 10 ms) que compreende cerca de 50% da amplitude total (ou). Inativação lenta dependente da voltagem de a1C, IS-IV é totalmente inibida, e o canal permanece conduzindo durante a despolarização. A substituição de Ca2+ para Ba2+ como porta-cargas (painel c) não alterou significativamente este padrão de inactivação, enquanto a análise da dependência de voltagem para o componente inactivante de através do A1C,Canal IS-IV (painel d) confirmou a falta de CDI. A substituição de ß1a para ß2a (painel e) não alterou a inactivação da corrente do canal A1C,a corrente do Canal IS-IV sugere falta de modulação diferencial β-subunidade, enquanto a análise de co-imunoprecipitação (Painel b) forneceu provas directas de associação entre a1C,IS-IV e β. os resultados apresentados na Figura 3 sugerem que existe uma conversa cruzada entre ADSI, CBD e β, suportada por interacções directas entre eles e/ou dobragem conformacional específica dos constituintes do feixe polipeptídeo subjacente ao poro. De facto, tanto a interacção de β Com CBD como a importância da conformação funcional foram directamente demonstradas em células vivas que expressaram Cav1.2 recombinantes.

3, 3. Papel of the A1C C-tail Folding

Quantitative voltage-dependent FRET microscopy combined with patch clamp in the live cell showed that the A1C subunit C-terminal tail is subject to reversible voltage-gated conformational rearrangements . A ancoragem da cauda-C a1C ao folheto interno da membrana plasmática através do domínio de homologia da pleckstrina (PH) fundido ao C-terminus de a1C (a1C-) aboliu este rearranjo conformacional e inibiu tanto o SI como o CDI (Figura 4(a)) de uma forma muito semelhante à observada com a1C,IS-IV (Figura 3(c)). Esta modificação que limitava a mobilidade do terminal carboxílico A1c teve implicações importantes na transdução do sinal Ca2+. A ativação transcriptional dependente de CREB associada com a atividade da Cav1.2 foi completamente suprimida, apesar de robusta gerada pelo canal “C-ancorado” em resposta à despolarização. A libertação da cauda-C a1C através da activação da hidrólise do PIP2 após a activação da fosfolipase C restaura totalmente todas estas funções deficientes, incluindo SI, CDI, e o acoplamento efectivo da transcrição dependente de CREB . Assim, é a dobragem funcional específica da cauda C-terminal A1C que é crucial para a inactivação. É crucial para a transdução do sinal porque foi projetado para aprisionar a Ca2+ em CaM permeante ligada ao CBD e efetivamente mover esta Ca2+ enjaulada para alvos sinalizadores a jusante associados com transcrição CREB-dependente ou contração muscular cardíaca . Acima de tudo, esta função ocorre em estreita coordenação com estímulos extracelulares ativando o canal. Em termos de transdução de sinal, SI é um bloqueio no interior do canal que é liberado pela permeante Ca2+ para acelerar seu fechamento e iniciar o movimento da cauda C-terminal .

Figura 4

Diferencial papel do carboxilo e amino-terminal caudas de α 1C em Cav1.2 inativação. São mostrados (um) epifluorescent imagens que ilustram a membrana plasmática de segmentação de EYFP rotulado α 1C (dimensionamento de barras, 4 µm) e (b) sobreposta vestígios de máximo (preto) e (vermelho) dimensionado para a mesma amplitude para α 1C-/β 1a/α 2δ , (A) PHN-α 1C/α 2δ (B) , e ΔN-α 1C/α 2δ (C) .

3.4. O papel do A1c N-Terminus

Todas as funções mencionadas acima dependem também da integridade do A1C N-terminus. As propriedades de inactivação do canal recombinante A1C/β/α2δ não são muito alteradas por alterações estruturais da parte proximal da cauda-N A1C, por exemplo, pela fusão de uma proteína fluorescente , pelo domínio de PH , ou por um splicing alternativo de exons 1/1A gerando a isoforma longa de a1C . A primeira análise funcional do efeito da eliminação parcial do A1C n-terminus mostrou que ele está envolvido na inactivação, enquanto β impede a inibição do canal pela cauda-N. Utilizando microscopia FRET combinada com grampo, descobrimos que a inactivação provoca uma forte reorientação mútua da Termini A1C e ß1a NH2 -, mas a sua Distância em relação à membrana plasmática não é sensivelmente alterada . Esta relativa falta de mobilidade é conferida por β de uma forma que facilita a resposta do canal à corrente de tensão. Na ausência de β, foram realizadas experiências de dissociação da cauda N-terminal da subunidade a1C da regulação do canal. Ancoragem da cauda-N a1C no folheto interno da membrana plasmática através do domínio de PH ligado criou condições quando o PHN-A1C e o α2δ foram suficientes para gerar uma corrente interna robusta (Figura 4(B)). Este canal, no entanto, é privado de CDI e qualquer inactivação dependente da voltagem. Na verdade, nem Ba2+ nem Ca2+ apresentam decaimento apreciável (ver traços sobrepostos). A libertação da cauda-N a1C após a hidrólise do PIP2 através da activação da fosfolipase c inibiu completamente o canal com deficiência em β . Propriedades similares, exceto uma ativação muito mais lenta da corrente, foram observadas na remoção da cauda N-terminal inteira (mas 4 aminoácidos) de a1C (Figura 4(C)). Com qualquer tipo de desengate da cauda N-terminal a1C—seja por eliminação ou por fixação de partículas,—um atraso na activação da Corrente de células inteiras parece estar associado ao prolongamento da primeira latência. Gravações de um único canal revelaram que a exclusão do n-tail essencialmente estabilizou o estado aberto do canal ΔN-A1C/α2δ, que mostrou aberturas mais longas durante a despolarização de longa duração .

assim, o CDI é mediado por determinantes CBD da cauda-C a1C, pela ADSI na região dos poros citoplásmicos, e pela dobragem da C – E N-termini A1c. A calmodulina integra estes determinantes, fornecendo um interruptor dependente de Ca2 + que termina a inactivação lenta, liberta a cauda-C a1C, e faz a transferência da Ca2+/calmodulina associada que actua como um estímulo activador da transdução do sinal Ca2+.

3, 5. Expressão e inactivação da Cav1.2 Na ausência da β e da α2δ

são as subunidades β e α2δ essenciais para a expressão funcional do canal Cav1.2? A análise dos efeitos da CaM exógena (CaMex) na expressão e propriedades de Cav1.2 na ausência de β ou α2δ demonstrou claramente que nem β nem α2δ são essenciais. A sobreexpressão do CaMex modifica apenas ligeiramente a regulação da tensão do canal A1C/ß2d/α2δ, deslocando a dependência da tensão da activação e inactivação para potenciais mais negativos, facilitando (mas não acelerando) a inactivação e aumentando a densidade de aproximadamente 2 vezes . O CDI é mantido, uma vez que é evidente a partir do efeito da substituição de Ca2+ para Ba2+ como transportador de carga que aumentou significativamente o tempo de inactivação da corrente [Figura 5 (a)]. Uma nova compreensão dos papéis de β e α2δ vem com a constatação de que CaMex torna expressão e atividade do canal a1C na ausência de β (Figura 5(B)) ou α2δ (Figura 5(C)), mas não ambas as subunidades auxiliares. Embora a CaMex não esteja estruturalmente relacionada com β e α2δ, ela apoia o tráfico, o CDI e o canal gating. A análise quantitativa mostrou que o CaMex não estimulou a redistribuição do a1C em PM sobre o citoplasma, mas aumentou significativamente a focalização da membrana plasmática dos canais a1C/α2δ. Por outro lado, o CaMex não aumentou a distribuição relativa dos canais A1c/ß2d e A1C/ß2d/α2δ na membrana plasmática sobre o citoplasma. Assim, dependendo da subunidade auxiliar presente, a atividade do canal suportado por CaMex de A1C/ß2d e A1C/α2δ está sob controle de diferentes mecanismos. Apesar disso, os canais CaMex-facilitados, mon-auxiliares-subunidades exibem propriedades bastante semelhantes, incluindo cinética de inactivação significativamente mais lenta da Corrente de cálcio e um forte deslocamento da dependência de voltagem da ativação e inactivação para potenciais mais negativos. À semelhança dos canais convencionais A1C/ß2d/α2δ, estes canais mantêm CDI e elevada sensibilidade aos bloqueadores dos canais de cálcio dihidropiridinos . No entanto, apenas o canal A1C / β / CaMex mostra a facilitação da Corrente de cálcio por um forte pré-processamento de despolarização (dados não mostrados).

Figura 5

Atividade de Cav1.2 expressa na ausência de β ou α 2δ subunidades. São mostrados (um) epifluorescent imagens que ilustram o predominante PM localização de EYFPN-α 1C (dimensionamento de barras, 4 µm) em COS1 células e (b) sobreposta vestígios de máximo (preto) e (vermelho) dimensionado para a mesma amplitude para α 1C/β 2d/α 2δ/CaMex (A), β-livre α 1C/α 2δ/CaMex (B) e α 2δ-livre α 1C/β 2d/CaMex canal (C).

Uma Vez Que CaM associado com CBD está envolvido no CDI, é claro que o efeito do CaMex é mediado por diferentes locais de ligação à CaM. Um dos potenciais candidatos de tal site está presente na parte distal da cauda N-terminal a1C . Resta saber se este sítio desempenha de facto um papel integrador no pacote regulamentar de vários determinantes moleculares que apoiam a inactivação da Cav1.2. Outra possibilidade limita o papel do CaMex à ativação da Cav1 silenciosa.2 dentro dos grandes aglomerados, onde a disponibilidade local limitada de CaM pode ser a razão da baixa atividade fraccional descrita na secção 2.5. Quaisquer que sejam os mecanismos associados à regulação da Cav1.2 pela CaM, eles parecem ter pouca implicação prática para uso na medicina neste momento exatamente porque a CaM é um peptídeo ubíquo e multifuncional que regula muitas outras funções celulares, enquanto a sua presença na Cav1.2 é vital para a CDI. 4. β-modulação da subunidade da Cav1.2

Notável variabilidade molecular das subunidades β, refletida em alteração da inativação propriedades do diferencial modulada Cav1.2 , exemplificado na Figura 3(A) (painel e) apresenta uma nova oportunidade para o desenvolvimento de abordagens inovadoras para o tratamento de doenças associadas com o Ca2+ maltrato. Várias observações recentes fornecem uma base para uma visão tão optimista. Primeiro, as subunidades β exibem uma tendência para formar homo-e hetero-oligômeros que foi diretamente demonstrada por uma variedade de técnicas bioquímicas em ambas as células nativas e no sistema de expressão recombinante. Enquanto um aumento da homooligomerização β aumenta significativamente a densidade de, heterooligomerização de variantes B2 com outras subunidades β também pode mudar a dependência de voltagem e cinética de inactivação de Cav1. 2 . A oligomerização β é mediada por vários determinantes moleculares e, portanto, precisa de intervenções múltiplas para ser gerenciada, por exemplo, em caso de sobreexpressão patogênica de β2. No entanto, parece ser mais viável atingir o próprio β2; o determinante molecular da inactivação lenta e incompleta específica de β2 (ver Figura 2 A), painel d), foi identificado como o determinante C-terminal de 40 aminoácidos (ß2CED) presente em todas as 7 variantes B2 de ocorrência natural conhecidas. O desengate da sua interacção independente da Ca2+ e da CaM com a CBD(Figura 3 (a), painel a) recupera as propriedades de inactivação características da cav1b/β3 modulada 1.2 , que exibem uma inactivação rápida e completa, como foi demonstrado em experiências de supressão. Na minha opinião, este desengate selectivo de ß2CED da ligação ao seu receptor na CBD é uma nova estratégia atraente para gerir a sobrecarga de Ca2+ porque outras subunidades β não devem ser afectadas. Além disso, será preservada uma conversa cruzada entre a Cav1.2 e a proteína cinase II, dependente da cam+/alvo mais próxima.

5. Conclusões

Este artigo tem demonstrado que sabemos como acelerar a inativação de Cav1.2 a menos de 10 ms (Figura 3(C)), para privá-la de inativação completamente (Figuras 4(B) e 4(C)), ou para eliminar a dependência de sua expressão de β ou α2δ sem consequências significativas para a inativação. Delineamos os papéis finais da termini a1C e da CaM para a inactivação, mas nenhum destes estudos nos aproximou mais do objectivo final de gerir a má gestão do cálcio associada à Cav1.2 excepto dos bloqueadores dos canais de cálcio antigos e, infelizmente, não muito selectivos. O único novo alvo viável é a modulação patogênica β2 de Cav1. 2, onde a interação efetor-receptor é estabelecida.

em termos de biologia molecular, Cav1. 2 está certamente entre os sistemas regulatórios mais complicados conhecidos. Notável diversidade molecular de cada uma das Cav1.2 os constituintes dão origem a múltiplas variantes genéticas/espelhadas do canal que estão sujeitas a segregação em grandes e diversos clusters e a uma mudança funcional contínua através da homo – e hetero-oligomerização de β e outros componentes sinalizadores, para não falar de espécies, tecidos e variabilidade de desenvolvimento. Estamos surpresos com a redundância das propriedades de várias isoformas da Cav1.2 e ficamos ainda mais surpreendidos quando algumas delas, mostrando apenas propriedades eletrofisiológicas “convencionais”, acabam sendo associadas a uma doença . Ao procurar uma explicação, nossa visão não deve ser intuitivamente focada apenas nas características da dependência da Corrente de cálcio-tensão, amplitude e duração. A resposta final, tal como a organização espacial e temporal dos eventos de sinalização de CREBO associados a isoforma específica da Cav1.2 , e a sua concorrência com outros mecanismos de sinalização (por exemplo, dependentes do campo), ou com outras isoformas da Cav1.2 presentes, podem fornecer novas ideias e abrir novas fronteiras para a investigação dos papéis das variantes individuais da cav1.2 em células e tecidos normais e doentes.

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