resulta numa expressão

ALDH1 no pâncreas embrionário e adulto.com base em estudos anteriores documentando altos níveis de atividade enzimática de ALDH1 nas progenitoras neurais, hematopoiéticas e epiteliais mamárias (17-19), caracterizamos padrões temporais e espaciais da expressão proteica de ALDH1 no pâncreas embrionário e adulto do rato (Fig. 1). Utilizando a e-cadherina como marcador de células epiteliais pancreáticas, descobrimos que a proteína ALDH1 é detectável pela primeira vez no epitélio pancreático em desenvolvimento no E12.5 (Fig. 1A). Neste ponto, a expressão é restrita às pontas dos túbulos ramificantes, recentemente proposto para representar um domínio progenitor multipotencial (20). Um padrão de expressão semelhante foi anteriormente relatado para transcrições Aldh1a1 (21). A expressão nas pontas tubulares (e não nos troncos centrais) persiste através do E14.5 (Fig. 1 B E B’), sendo subsequentemente regulado para baixo na diferenciação das células acinares. No pâncreas adulto, a expressão do ALDH1 epitelial é mais frequentemente observada nas células epiteliais centroacinar e ductal terminal(Fig. 1 C-E). Células mesenquimais (e-cadherin-negativo) que expressam o ALDH1 também foram detectadas em torno de Ilhéus endócrinos e acini exócrino (Fig. S1).

iv xmlns:xhtml=”http://www.w3.org/1999/xhtml Fig. 1. expressão do ALDH1 no pâncreas embrionário e adulto do rato. (A-C) rotulagem Imunofluorescente para a proteína ALDH1 (verde) em combinação com a e-cadherina (vermelha) para marcar as estruturas epiteliais na alínea a) do ponto E12.5, na alínea b) do ponto E14.5 (B e B’) e no pâncreas do rato adulto (c). A imagem em (B’) representa uma vista de ampliação mais elevada da área indicada pela caixa em (b). Note restriction of ALDH1 expression to tips of epitelial branches (indicated by asterisks in B’) and not more-central branch trunks (indicated by star). No pâncreas adulto (C), a expressão ALDH1 é restrita a um subconjunto de células centroacinares E-cadherinas positivas. Detecção imunohistoquímica da proteína ALDH1 (marrom) em subconjuntos de centroacinar (setas) e células de ducto terminal (ponta de flecha). (Barras de escala: 50 µM.)

ara caracterizar ainda mais a expressão ALDH1 e a actividade enzimática ALDH1 no ducto terminal adulto/células centroacinares, utilizámos preparações de unidades acinar-ductais periféricas recém-isoladas do pâncreas exócrino do rato digerido pela colagenase (22). É importante notar que estas unidades acinar-ductais periféricas isoladas estão marcadamente depauperadas de grandes ductos e elementos endócrinos. Em comparação com o pâncreas total, as unidades acinar-ductais periféricas exibiram uma depleção de insulina>400 vezes superior nas transcrições de insulina, conforme avaliado pela RT-PCR (Fig. S2A). Quando a análise FACS foi realizada em unidades acinar-ductais periféricas colhidas a partir do Ins1 transgénico:ratos DsRed que expressaram proteína fluorescente vermelha nas células β, apenas 3 das 10 000 células (0, 03%) desta preparação foram positivas para o DsRed.a caracterização tridimensional adicional da expressão proteica ALDH1 foi realizada utilizando a rotulagem fluorescente de montagem integral de unidades acinares-ductais periféricas isoladas. A proteína ALDH1 foi localizada em combinação com a e-cadherina como marcador de células epiteliais e com Dolichos biflorus aglutinina (DBA) conjugada com FITC ou aglutinina de amendoim (PNA) conjugada com FITC, marcadores de células ductais e acinares, respectivamente. A imagem multicanal confirmou uma localização ductal predominantemente centroacinar/terminal das células epiteliais com expressão de ALDH1 no pâncreas adulto(Fig. S3). As células que expressam o ALDH1 foram mais frequentemente interpostas entre o epitélio ductal terminal e as células acinares mais periféricas. Além disso, células epiteliais únicas com expressão ALDH1 também foram observadas imediatamente adjacentes ao epitélio ductal terminal (Fig. S3 A E B). Ambas as células positivas de DBA e negativas de ALDH1 foram identificadas, enquanto que as células positivas de PNA positivas de ALDH1 só raramente foram identificadas.isolamento das células Centroacinares e ductais terminais que expressam o ALDH1.

na esperança de isolar as células que expressam o ALDH1 do pâncreas adulto do rato, nós tirámos partido de um substrato fluorogénico conhecido como “Aldefluor” (StemCell Technologies), que tem sido anteriormente utilizado no isolamento baseado nas FACS das células estaminais hematopoiéticas, neurais e epiteliais mamárias (17-19). Antes de tentar o isolamento baseado em FACS das células epiteliais pancreáticas que expressam o ALDH1, aplicamos este reagente para visualizar células vivas que expressam o ALDH1 em unidades acinares-ductais periféricas (Fig. 2). Como mostrado na Fig. 2 E E F, estes estudos confirmaram a localização ductal centroacinar/terminal de células Aldefluor-positivas em baixa abundância no pâncreas adulto do Ratinho. As células centroacinares/ductais terminais Aldefluor-positivas eram facilmente distinguidas das células acinares adjacentes devido ao seu pequeno tamanho e à falta de grânulos de zimogénio. Na Fig. são fornecidos exemplos adicionais de imagens de células vivas utilizando o reagente Aldefluor. S4. Estes resultados implicaram que a imunofluorescência anti-ALDH1 e a citofluorescência baseada em Aldeflluorescência estavam rotulando uma população centroacinar/ductal terminal semelhante, e sugeriram ainda que estas células podem ser isoladas com sucesso por FACS.Fig. 2. isolamento FACS das células epiteliais centroacinares/terminais ductais que exprimem ALDH1 utilizando o reagente Aldefluor. A triagem de FACS foi realizada em células únicas isoladas a partir de unidades acinares periféricas desprovidas de elementos endócrinos e de grandes condutas. (A E B) mistura de células Aldefluor-positivas com base na actividade enzimática ALDH1 sensível ao DESACAB. o eixo y indica dispersão lateral; o eixo x indica intensidade do sinal Aldefluor (a) com e (B) sem DEAB. B E C) detecção da actividade enzimática ALDH1 (C) com E D) sem DEAB, em conjugação com a detecção superficial da proteína e-cadherina. o eixo y representa a intensidade da rotulagem com o anticorpo anti-e-cadherina conjugado com APC; o eixo x indica a intensidade do sinal Aldefluor. FACS-classificados populações indicado por P2, P3, P4, e P5 em D correspondem a Aldefluor-positivo, E-cadherin-negativo (A+E−), Aldefluor-positivo, E-cadherin-positivo (A+E+), Aldefluor-negativo, E-cadherin-positivo (−E+), e Aldefluor-negativo, E-cadherin-negativo (−E−), respectivamente. (E E F) A imagem do pâncreas do rato digerido pela colagenase utilizando reagente Aldefluor confirma a localização ductal centroacinar/terminal de células Aldefluor-positivas, semelhante à observada para a imunofluorescência ALDH1 (figos. 1 e 2). Note-se a posição ductal centroacinar/terminal e o pequeno tamanho das células Aldefluor-positivas em relação às células acinares maiores, que são facilmente identificáveis pelo citoplasma granular correspondente a grânulos zimogénicos apicais. (Barras de escala: 50 µM.) (G) Quantitative RT-PCR analysis of gene expression in a+e+ cells (red), A+e− cells (white), A+E− cells (blue), and a−e− cells (black). Em comparação com A−E+ aldefluor-negativo células epiteliais, A+E+ aldefluor-positivo centroacinar/terminal ductal células epiteliais são enriquecidas por transcrições de codificação Aldh1a1, Aldh1a7, Sca1, Sdf1, c-Met, Nestin, Ptf1a, e Sox9. (Barras de escala: 50 µM.)

We next pursued FACS-based characterization and sorting of single cells dissociated from peripheral acinar-ductal units. Como um meio inicial para estabelecer uma gatação específica das células que expressam o ALDH1, empregamos um inibidor farmacológico da actividade enzimática ALDH1 (DEAB). Como representado na Fig. 2 A-D, Esta estratégia permitiu o isolamento de uma população celular de baixa abundância caracterizada por altos níveis de atividade enzimática DEAB-sensível ALDH1, compreendendo 0,9% ± 0.2% de todas as células classificadas no pâncreas adulto do rato. Utilizando um anticorpo e-cadherina para identificar simultaneamente as células epiteliais, verificou-se que as células e-cadherina (+) representam 0, 5% ± 0, 13% de todas as células classificadas no pâncreas adulto do rato (Fig. 2D).

Usando RT-PCR quantitativo para comparar o Aldefluor-positivo, E-cadherin-positivo (A+E+), Aldefluor-negativo, E-cadherin-positivo (−E+), Aldefluor-positivo, E-cadherin-negativo (A+E−), e Aldefluor-negativo, E-cadherin-negativo (−E−) populações de isolados de rato adulto pâncreas, encontramos a+E+ população a ser significativamente enriquecido com transcrições de codificação Aldh1a1 e Aldh1a7, e esgotada de transcrições para dois outros ALDH1 isoformas, Aldh1a2 e Aldh1a3 (Fig. 3G). Aldh8a1 não foi detectado em nenhuma das amostras. Em comparação com o A−E+ população, A+E+ as células foram modestamente esgotada de transcrições para Pdx1 (P < 0.09), Amilase (P < 0,001), e Cytokeratin-19 (P < 0.01) (marcadores expressa diferenciada β-células, acinar células, e duto de células, respectivamente). Em contraste, as células A+e + foram caracterizadas pela expressão de alto nível de Ptf1a, apesar de terem sido esgotadas tanto de transcrições de amilase quanto de proteína de amilase (Fig. 3G e Fig. S5). Além disso, essas células foram enriquecidos por transcrições de codificação de Sca-1, SDF1, c-Met, Nestin, Sox9, Hey1, e Hey2, marcadores associados anteriormente progenitoras populações no pâncreas e outros tecidos. Utilizando a rotulagem imunofluorescente em preps de citospinas de células separadas por FACS, confirmámos o enriquecimento marcado para as proteínas ALDH1 e Sox9 e a depleção da amilase nas células A+e+ (Fig. S5). Além disso, realizamos, ainda, FACS análise para determinar a frequência com que Aldefluor ( + ), as células foram também positivas para marcadores de células-tronco, tais como CD133 e Sca-1 de proteína, e observaram que mais de 90% dos Aldefluor (+) células além disso coexpressed ambos estes marcadores de células-tronco. Em contraste, apenas 0,11% das células Aldefluor (+) também foram positivas para o marcador endotelial vascular PECAM, enquanto 0,08% foram positivas para o marcador hematopoiético CD45. Quando a análise FACS foi realizada em unidades acinar-ductais periféricas colhidas em ratinhos transgénicos Ins1-DsRed que expressavam proteína fluorescente vermelha nas células β, verificou-se que todas as células Aldefluor (+) eram negativas para dsRed.

Pancreatosphere Assay of Endocrine and Exocrine Progenitor Function.

como uma tela inicial para a atividade como progenitor, nós avaliamos Aldefluor ( + ) e Aldefluor ( – ) células para a capacidade de formar pancreatosferas (Fig. 3), similar ao ensaio de neuroesfera comumente usado para identificar progenitores neurais (23). Nestes ensaios, as células ductais a+e+ centroacinar / terminais foram unicamente capazes de formar esferas em cultura de suspensão. As células a+e + mostraram uma eficiência formadora de esfera >100 vezes a dos seus equivalentes a-e+ (Fig. 3 A E B e quadro S1). Com menor eficiência, as células a+e+ simples eram capazes de formar esferas quando banhadas em densidade clonal (uma célula por poço) em placas de 96 poços (tabela S1). Nenhuma das populações e-cadherin-negativas exibiu uma capacidade significativa de formação de esferas. Quando cultivadas ao longo de um período de 5 a 7 dias, as pancreatosferas derivadas de células A+e+ exibiam uma forte expressão de e – cadherina (Fig. 3C), confirmando a sua identidade epitelial, e as células individuais dentro das esferas começaram a acumular quantidades consideráveis de amilase ou insulina e peptídeo-C de insulina (Fig. 3 D E E). Ao fim de 5 dias, cerca de 50% das pancreatosferas apresentavam expressão de amilase, enquanto cerca de 30% apresentavam imunoreactividade à insulina c-peptídeo. As esferas individuais foram geralmente positivas quer para a insulina quer para a amilase, mas não para ambos. Pequenos subconjuntos de células dentro das esferas mantidos expressão ALDH1 durante o período de cultura, e também demonstrou a expressão nuclear da proteína Sox9(Fig. 3 F E G), sugerindo a possível manutenção de um pool de progenitores auto-renovadores. Esta capacidade aparente de auto-renovação foi ainda corroborada pelo facto de as pancreatosferas geradas pelas células ductais Centroacinares/terminais da Aldefluor poderem ser submetidas a dissociação enzimática em série, mantendo a sua capacidade de formação de esferas durante um mínimo de três passagens sequenciais a intervalos de 7 dias. Além disso, as células dentro das esferas foram altamente proliferativas, como avaliado pela incorporação overnight de EdU adicionado no início ou no fim do período de cultura (Fig. 3H).

com base nas capacidades progenitoras distintas mostradas pelas células A+e+, examinámos as populações de células separadas para a expressão de Ngn3, um marcador de células progenitoras endócrinas(Fig. S2B). De acordo com estudos anteriores (7), não foi possível detectar a expressão significativa de Ngn3 no pâncreas adulto total ou em qualquer uma das populações de células recém-separadas. No entanto, uma vez que as células A+e+ foram colocadas em cultura, elas começaram a gerar expressão detectável de Ngn3 imediatamente antes do início da expressão de insulina, confirmando ainda mais a capacidade de progenitor endócrino das células centroacinares e epiteliais ductais terminais.as Pancreatosferas derivadas das células Ductal/Centroacinar terminais apresentam secreção de insulina que responde à Glucose.

a detecção de células que expressam insulina e peptídeo-C de insulina em pancreatosferas cultivadas levou à avaliação da capacidade destas células de secreção de insulina que responde à glucose, uma característica das células-β funcionais. Como um controle positivo, usamos células Ins – 1 (clone 832/13) uma linha beta imortalizada comumente usada para estudos de secreção de insulina em resposta a concentrações fisiológicas de glicose. Após incubação nocturna de quer pancreatosferas quer de células Ins-1 em glucose de 0, 5 e 11 mM, colheram-se sobrenadantes de meios de cultura e lisados de células para secreção e peptídeo-C de insulina celular utilizando um ensaio ELISA. Pancreatosferas derivadas de Aldefluor ( + ) centroacinar/células ductais terminais secretaram o péptido-C de forma dependente da glucose, com sensibilidade à glucose semelhante à demonstrada pelas células Ins-1 (Fig. 3I).Aldefluor ( + ) células ductais terminais adultas/Centroacinares podem contribuir para linhagens endócrinas e exócrinas embrionárias.

Como um ainda mais rigoroso teste para pancreática progenitoras atividade, nós microinjected isolado Aldefluor (+) e Aldefluor (–) células em microdissected dorsal pancreática botões isolados de E12.5 mouse embriões, e testadas para uma capacidade produtiva de contribuir para o desenvolvimento de endócrinas e exócrinas linhagens (Fig. 4). Esta abordagem foi recentemente utilizada para documentar a actividade progenitora das células que expressam o Ngn3, surgindo após a ligação do ducto pancreático (7). Para traçar a linhagem de adultos derivada de doadores de células e distingui-los de seus embriões derivados homólogos, isolada Aldefluor (+) e Aldefluor (–) a partir de células do pâncreas de camundongos carregando um ubiquitously expressa pCAG:mCherry transgene, como esquematicamente representado na Fig. 4A (pCAG: mcherry mice were gently provided by Michael Wolfgang, Johns Hopkins University). Quando comparado com as células Aldefluor ( – ), as células Aldefluor ( + ) carregavam um potencial dramaticamente melhorado para contribuir para a emergência de linhagens endócrinas endócrinas dentro dos botões dorsais em maturação, como demonstrado pela co-expressão da mCherry com qualquer um dos peptídeos C (Fig. 4 B-e) ou glucagom (Fig. 4 F-I). Utilizando a rotulagem e-cadherina sobreposta para permitir a contagem de células individuais positivas à mCherry, avaliámos quantitativamente a capacidade de as células adultas de Aldefluor (+) e Aldefluor (−) entrarem em linhagens embrionárias. Sete dias após a microinjecção das células Aldefluor (+) no E12.5 botões dorsais, observou-se expressão de glucagon em 11, 7% das células residuais positivas de mCherry, com expressão peptídica-C de insulina observada numa percentagem adicional de 11, 6% (Fig. 5N). Em contrapartida, 2,4% das células Aldefluor (-) residuais de mCherry positivas expressaram glucagon e apenas 0,2% expressaram peptídeo − C de insulina. Curiosamente, as populações Aldefluor (+) e Aldefluor (–) mostraram habilidades equivalentes para entrar em linhagens epiteliais não – endócrinas, talvez refletindo o fato de que a maioria da população Aldefluor ( – ) era composta de células acinares já diferenciadas. Foram observadas frequências semelhantes de e-cadherina, amilase e positividade PNA em células residuais positivas de mCherry derivadas quer das populações Aldefluor (+) quer Aldefluor (-) (Fig. 4 J-N).Fig. 4. as células pancreáticas adultas Aldefluor-positivas penetram tanto nas linhagens endócrina como exócrina no pâncreas embrionário em cultura. A) Esquema da experiência. Para traçar a linhagem das células adultas, as células Aldefluor (+) e Aldefluor (–) foram isoladas a partir da GAC adulta:pâncreas transgénico de ratinho mCherry, microinjectado em botões pancreáticos dorsais microdissectados isolados a partir da E12.5 embriões de ratinho não-transgénicos, e assediado para uma capacidade de contribuir produtivamente para o desenvolvimento de linhagens endócrinas e exócrinas. (B–J) Coexpression de mCherry e insulina C-peptídeo (Ser) e mCherry e glucagon (F–I) confirma a capacidade do adulto Aldefluor (+) células de contribuir para embrionário β – e α-célula de linhagens, considerando que a rotulagem individual dos mCherry-células positivas com FITC conjugado PNA (J–M) confirma a capacidade de contribuir para o desenvolvimento embrionário acinar linhagem. N) frequências com as quais as células residuais de Aldeflouor ( + ) e Aldefluor (-) positivo em mCherry apresentam o rótulo do péptido − C de insulina, glucagon, e-cadherina e PNA 7 dias após a microinjecção em botões pancreáticos dorsais microdissectados E12.5. Todas as contagens de células foram determinadas usando a rotulagem e-cadherin para delinear o limite de células individuais. Note que a capacidade de diferenciação endócrina é predominantemente limitada à população Aldefluor ( + ), enquanto que tanto as células Aldefluor ( + ) quanto Aldefluor ( − ) podem contribuir produtivamente para o desenvolvimento de linhagens exócrinas. (Barras de escala: 50 µM.)

Expansion of ALDH1-Expressing Centroacinar and Terminal Duct Cells Following Chronic Epithelial Injury.

para avaliar o comportamento in vivo das células centroacinares e do ducto terminal que expressam o ALDH1, avaliamos padrões de expressão do ALDH1 na configuração da inflamação crónica e metaplasia regenerativa induzida pela administração sequencial de caeruleína de baixa dose. Tal como anteriormente notificado (15), o tratamento de ratinhos adultos com três injecções de caeruleína (50 µg/kg) por semana durante 3 semanas consecutivas induziu um estado de pancreatite crónica seguido de uma regeneração e reparação quase completas. Este processo é caracterizado por infiltrações inflamatórias, expansão estromal, e a formação de complexos tubulares regenerativos metaplásticos, que incluem complexos tubulares tipo-1 anteriormente mostrados como derivados de células acinares, e complexos tubulares tipo-2 (TC2), anteriormente mostrados como derivados não-acinares e presumivelmente decorrentes de células terminais proliferantes (15). Em contraste com a relativamente baixa abundância de ducto terminal com expressão de ALDH1 e células centroacinares observadas no pâncreas adulto normal (Fig. 5 A E B), Conduta terminal que exprime ALDH1 (Fig. 5 C E D) e centroacinar (Fig. 5 e E F) as células foram acentuadamente expandidas no contexto da pancreatite crónica induzida pela caeruleína. De notar,complexos tubulares tipo-2 eram compostos predominantemente de células que expressavam ALDH1 (Fig. 5H), enquanto que os complexos tubulares tipo – 1 não mostraram evidência de expressão ALDH1 (Fig. 5G).