Fúngicas de host

os fungos Filamentosos podem servir como hospedeiros para um microbiana do ácido carmínico célula de fábrica, pois eles têm a capacidade de fornecer um amplo fornecimento de acetil-CoA e malonyl-CoA blocos de construção para a síntese dos polyketide andaime. Eles também oferecem a infra-estrutura celular necessária para acomodar a membrana ER ligada a c-glucosiltransferase UGT28. Uma vez que A. nidulans possui uma caixa de ferramentas de engenharia genética bem desenvolvida, escolhemos esta espécie como um ponto de partida para o desenvolvimento de uma fábrica de células de ácido carmínico fúngico. Como a maioria dos Fungos Filamentosos, A. nidulans é capaz de produzir uma infinidade de metabolitos secundários biossinteticamente diversos, incluindo um número significativo de policetídeos aromáticos. Chiang et al. demonstraram anteriormente que a eliminação dos clusters genéticos responsáveis pela formação dos principais produtos endógenos de PKS em A. nidulans11, melhorou o potencial de A. nidulans como uma fábrica de células para a produção heteróloga de policetídeos. Desta forma, aumentam-se os blocos de construção acetil-CoA e malonil-CoA e simplificam-se as análises químicas subsequentes para a formação de novos produtos. Como primeiro passo para uma fábrica de células fúngicas para a produção de ácido carmínico, eliminamos, portanto, as vias biossintéticas para os policetídeos aromáticos dominantes que poderiam potencialmente interferir com a produção de ácido carmínico e complicar a análise e purificação a jusante. Especificamente, os clusters de genes para a produção de aspertecina, monodictifenona e esterigmatocistina foram eliminados, bem como os genes responsáveis pela formação de pigmentos verdes, wA e yA, foram eliminados em um fundo não homólogo end joining deseficiente A. nidulans. Além da esperada falta de pigmentos conidiais, a estirpe resultante, NID2252, não mostrou quaisquer efeitos visíveis na morfologia e fitness (arquivo suplementar, Fig. 1). Por isso, usamos NID2252 como uma estirpe de referência e como base para a construção de uma fábrica de células fúngicas para a produção de ácido carmínico.

Design de um semi-caminho natural para flavokermesic ácido anthrone formação

O maior empecilho para a construção de um microbiana do ácido carmínico célula fábrica foi a falta de um natural PKS que sintetiza flavokermesic ácido anthrone, o primeiro suposto intermediário na via. Para contornar esta limitação, buscamos uma via biossintética alternativa para a produção deste policetido. A Antrona de ácido flavokermésico octaketide, com o seu padrão de ciclização C7-C12, C5-C14 e C2-C15, poderia, em teoria, ser formada em um único passo por um fungo não redutor tipo I iterativo PKS que possui um domínio de modelo de produto adequado (Fig. 1 Esquerda). No entanto, tais enzimas ainda não foram descritas na literatura. Um mecanismo alternativo para formar a Antrona de ácido flavocermésico é através de uma reação em duas etapas onde um PKS sintetiza uma cadeia linear octacetídica não-reduzida, que posteriormente é ciclizada na estrutura desejada por ciclases/aromatases trans-atuantes (Fig. 1 direita). Reacções deste tipo existem na natureza, por exemplo, na Via actinorhodin (Act) em Streptomyces coelicolor12. Neste caso, o octaketide espinha dorsal é sintetizado por uma multi-subunidade bacteriana do tipo II PKS sistema, KSa, KSß e dos países ACP (lei mínimo de PKS), que é reduzida pela actKR na posição C9 e, posteriormente, dobrado pela aromatase/ciclase, actARO/CYC e ciclase actCYC2, para produzir os compostos tricíclicos 3,8-di-hidroxi-1-methylanthraquinone-2-ácido carboxílico (DMAC)7. O DMAC apresenta a mesma dobra que o ácido flavocermésico Antrona, mas é reduzido na posição C9.

de especial interesse para o presente estudo, é a ZhuI cyclase e a zhuj aromatase de Streptomyces sp. R1128, que catalisa duas reações de ciclização sequencial de policetídeos lineares não reduzidos em dobras semelhantes às do ácido flavocermésico an throne13. Especificamente, o ZhuI ciclase é responsável por fechar o primeiro anel, C7, C12, e o ZhuJ aromatase para fechar o segundo anel, C5-C14. O terceiro anel, C2-C15, é formado espontaneamente. ZhuI e ZhuJ foram previamente Co-expressos em S. coelicolor com o octacetido formando o tipo II act mínimo PKS resultando na formação de ácido flavocermésico, conhecido como ácido 3,6,8-trihidroxi-1-metilantraquinona-2-carboxílico (TMAC) na literatura bacteriana14. Infelizmente, uma estratégia idêntica pode ser difícil de implementar em A. nidulans como o tipo II mínimo PKSs não foram implementados com sucesso em hospedeiros heterólogos fora do gênero Streptomyces apesar de várias tentativas 15. E, de facto, as nossas tentativas de reconstituir os miniPKS act em A. nidulans e Saccharomyces cerevisiae revelaram-se igualmente infrutíferas (dados não apresentados). Uma forma alternativa de formar o octacetido não reduzido necessário é confiar nas enzimas PKS tipo III, que foram expressas com êxito em leveduras, por exemplo, em ligação com o biossíntese do flavonóide 16. De especial interesse é a Aloe arborescens octaketide sintase (OKS,), que tem sido descrito para produzir não-reduzida octaketides que, espontaneamente, dobras em SEK4 e SEK4b em vitro17 (Fig. 2a). No entanto, em Aspergillus, não foi testado se os produtos do tipo III PKSs, que são enzimas ACP-independentes que libertam ácidos carboxílicos, podem ser dobrados pelo tipo ZhuI de ciclase que foi descrito para actuar em substratos ligados aos países ACP. No presente estudo nós, portanto, partiu para testar a compatibilidade da planta tipo III OKS com que cyclases/aromatases bacterianas PKS tipo II sistemas, com o objectivo de desenvolver uma artificial de novo biossintéticos caminho para a formação do flavokermesic ácido anthrone precursor para a formação de ácido carmínico.

a Produção de polyketide precursores de ácido carmínico produção em A. nidulans

Para o teste in vivo de desempenho de OKS em um fúngicas de host, é inserido OKS controlado pelo A. nidulans gpdA promotor, de uma única cópia em um determinado locus (integração local 5, 5) em A. nidulans genome18. Duas estirpes foram construídas, uma expressando a sequência de codificação OKS nativa e uma expressando uma versão otimizada do codon para expressão em A. nidulans. Após sete dias de incubação em meios de crescimento sólido, veja a seção métodos para detalhes, ambas as estirpes exibiram uma forte coloração vermelho-marrom do micélio(Fig. 2b). O perfil metabólico por HPLC-HRMS das estirpes não revelou quaisquer vestígios de uma octacetida não reduzida, mas sim o esperado SEK4 e SEK4b, juntamente com ácido flavocermésico e três outros compostos abundantes de Identidade Desconhecida (Fig. 2c), que não estavam presentes na estirpe de referência NID2252. O SEK4 e o SEK4b foram identificados com base numa análise minuciosa da HPLC-HRMS/MS (ficheiro suplementar, Fig. 2) e estava em conformidade com os valores anteriormente relatados19, enquanto o ácido flavocermésico foi comparado a uma referência autêntica isolada de D. coccus9 (ficheiro suplementar, Fig. 3). O metabolito eluindo a 13, 0 min. tinha um ião pseudomolecular + de m / z 303.0867, correspondente a uma fórmula molecular de C16H14O6, consistente com o produto conhecido de shunt de octaketide, mutactina, anteriormente descrito em experimentos baseados em Streptomyces com o gene de Act cluster7. Esta identificação foi confirmada através de uma análise detalhada do espectro UV, e apoiada pelo tempo de retenção em relação a SEK4 e SEK4b (ficheiro suplementar, Fig. 4). Os dois metabolitos adicionais com fórmulas moleculares de C16H12O6 (- m/z 299.0566) indicaram produtos octaketide, mas não correspondiam, contudo, a um produto comum do shunt (ficheiro suplementar, Fig. 5). Assim, os metabolitos foram isolados e a elucidação da estrutura com base em experiências 1D e 2D NMR identificou-os como dehidro-SEK4 (também conhecido como B26 na literatura bacteriana) e dehidro-SEK4b20 (ficheiro suplementar, Figs 6-11). A formação dos seis novos policetídeos observados na estirpe OKS pode ser explicada por três reacções espontâneas diferentes de primeiro fecho do anel: C7-C12 (SEK4, dehidro-SEK4 e ácido flavokermésico), C10-C15 (SEK4b e dehidro-SEK4b) e C7-C12 após a redução de C9 cetona (mutactina) (Fig. 2a e Dossier suplementar, Fig. 12). Destes, apenas o primeiro tipo de fechamento de anel (C7-C12) permite a formação subsequente do ácido flavocermésico desejado Antrona através de um segundo fechamento de anel C5-C14 e terceiro C2-C15. SEK4 e SEK4b tem sido relatada espontaneamente, desidratam para formar dehydro-SEK4 e dehydro-SEK4b, respectivamente, enquanto a formação de mutactin depende enzimática de redução do C9 posição do polyketide cadeia antes de folding21. A formação do ácido flavocermésico, um intermediário conhecido na Via do ácido carmínico (Fig. 1), foi inesperado, uma vez que não foi referido que este metabolito se forma espontaneamente a partir de cadeias octacetídicas não reduzidas. Isto sugere que A. nidulans naturalmente produz um número de ciclases / aromatases que promovem o padrão de dobragem desejado. O perfil metabólico das duas estirpes que expressam o OKS não mostrou quaisquer diferenças substanciais nos níveis de produção e decidimos concentrar-nos na estirpe que expressa a versão nativa do OKS como base para o desenvolvimento posterior de uma fábrica de células fúngicas para a produção de ácido carmínico.a engenharia da via dobrável dos octacetídeos não reduzidos

a dobragem promíscua do octacetido não reduzido reduz o rendimento do ácido flavocermésico desejável. Nós, portanto, imaginamos que a produção de ácido flavokermésico poderia ser aumentada, simplificando o processo de dobragem na direção desejada, expressando versões otimizadas de codon de ZhuI e ZhuJ. Para examinar se ZhuI e ZhuJ interferem com o metabolismo nativo de A. nidulans, nós primeiro construímos estirpes expressando ZhuI e ZhuJ individualmente e em combinação com loci genômico definido (IS6 e IS7) no A. estirpe de referência nidulans NID2252. O perfil metabólico das três estirpes por HPLC-HRMS não revelou quaisquer diferenças metabólicas detectáveis (Fig. 3b). Nós então construímos uma estirpe Co-expressando OKS com ZhuI, que codifica as ciclases que catalisam a formação do primeiro fechamento do anel C7-C12 (Fig. 3a). Em comparação com a estirpe que exprime apenas OKS, esta estirpe apresentou aumentos de 2, 5, 2 e 2, 1 vezes nos níveis de ácido flavocermésico, SEK4 e dehidro-SEK4, respectivamente. De acordo com ZhuI guiding folding na direcção desejada, estas alterações metabólicas foram acompanhadas por níveis reduzidos de metabolitos contendo as primeiras dobras indesejáveis do anel (Fig. 3b e Quadro 1). Uma estirpe que co-expressa OKS e ZhuJ, que codifica as aromatases que catalisam o fecho do segundo anel C5-C14 (Fig. 3a), produziu um aumento de 2,7 vezes nos níveis de ácido flavocermésico. Este aumento foi acompanhado por uma redução dos níveis de metabolitos com uma primeira dobra de anel C7-C12 (SEK4 e dehidro-SEK4), enquanto, como esperado, o nível de metabolitos com a primeira dobra de anel C10-C15 indesejada (SEK4b e dehidro-SEK4b) não foram afectados (Fig. 3b e Quadro 1). Finalmente, a análise da estirpe que expressa ZhuI, ZhuJ e OKS mostrou um aumento de 4,1 vezes na produção de ácido flavocermésico em comparação com quando OKS foi expresso sozinho. Além disso, este aumento é 60% superior ao observado com as estirpes que expressam OKS em combinação com ZhuI ou ZhuJ, respectivamente (Quadro 1). Este resultado indica que a ciclase e a aromatase, de forma aditivo, são capazes de aumentar o fluxo na Via artificial de novo em direcção ao produto desejado, ácido flavocermésico (Fig. 3b).

Surpreendentemente, e muito encorajador, mais metabólica análise da deformação co-expressando OKS, ZhuI e ZhuJ revelou que o aumento da formação de flavokermesic ácido foi acompanhado pela produção de kermesic ácido (Fig. 4). Daí, A. nidulans provides the necessary monooxygenase for converting flavokermesic acid into kermesic acid, which may server as the final intermediate in the carminic acid pathway (Fig. 1).

produção de ácido carmínico em A. nidulanos

a última etapa na formação do ácido carmínico envolve a glucosilação do ácido cámrico (Fig. 5a). A enzima responsável por esta etapa na Via biossintética do ácido carmínico foi previamente identificada em D. coccus e caracterizada por expressão heteróloga em S. cerevisiae8. Nós, portanto, inserido o UGT2 codificação do gene, otimizados para expressão em A. nidulans, no IS4 locus da NID2252 estirpe de referência, e para completar o semi-naturais, ácido carmínico biossintéticos caminho em A. nidulans, no mesmo locus em que a tensão de co-expressando ZhuI, ZhuJ, e OKS. A expressão da UGT2 isolada na estirpe de referência não afectou o aspecto da cor média de crescimento nem o perfil metabólico de A. nidulans quando comparado com a estirpe de referência NID2252 (Fig. 5b, c). Em contraste, a co-expressão de OKS, ZhuI, ZhuJ e UGT2 deu origem a uma coloração vermelha do meio, sugerindo que um colorante mais solúvel em água foi formado (Fig. 5b). A análise específica da LC-HRMS desta estirpe confirmou a formação de ácido carmínico 22 (Dossier complementar, Fig. 13), juntamente com o dcII9,23 e um isómero dcII (ficheiro suplementar, Fig. 14), mostrando que a UGT2 estava funcional em A. nidulanos e poderiam completar com sucesso a via biossintética(Fig. 5c). A identificação positiva do ácido carmínico e do dcII baseou-se em tempos de retenção semelhantes, espectros UV, padrões de fragmentação MS e MS/MS para padrões puros dos dois compostos. Três isómeros de ácido carmínico foram descritos na literatura (ácido carmínico, DCIV e DCVII) por Stathopoulou et al.23, todos os três mostram tempos de retenção diferentes na análise baseada em LC-MS/MS. Na nossa análise só detectámos ácido carmínico e não DCIV e DCVII com base no tempo de retenção e no padrão de fragmentação do ácido carmínico autêntico isolado de D. coccus (ficheiro suplementar, Fig. 13). Juntos, os nossos dados demonstram firmemente que é possível produzir ácido carmínico em A. nidulanos com base numa via semi-natural.