introdução

células citotóxicas fazem parte integrante da luta contra as células infectadas pelo vírus e as células cancerígenas. Estas células matam através de três vias diferentes, a libertação de grânulos líticos, a via receptor-ligante Fas, ou a via receptor TRAIL–TRAIL. Para o propósito deste artigo, vamos nos concentrar na degranulação. Quando uma célula citotóxica encontra uma célula-alvo, adere firmemente a ela formando a sinapse imunológica. Os grânulos líticos são então polarizados em direção à Sinapse imunológica e liberados da célula citotóxica direcionada para o alvo (1). Estes grânulos contêm vários mediadores citotóxicos, tais como a perforina e as granzimas. A perforina libertada pode formar poros transitórios dentro da membrana da célula-alvo, permitindo que as granzimas entrem na célula-alvo. A entrada também é provavelmente mediada por oligómeros de perforina formando poros incompletos (arcos) (2), e também foi sugerido que as granzimas e a perforina podem ser absorvidas pelas células alvo através da via endossómica (3, 4). Os dados subjacentes a estes mecanismos propostos foram recentemente discutidos em pormenor (5). Quando as granzimas entram nas células-alvo, a via caspase é activada, resultando em apoptose (6, 7). A membrana destes grânulos citotóxicos contém glicoproteína-1 (LAMP1), também conhecida como CD107a (8), associada ao lisossoma. A parte luminal do rato CD107a é transitoriamente exposta ao lado extracelular da membrana celular após a degranulação antes de ser novamente internalizada. Portanto, a coloração CD107a indica que ocorreu um evento de degranulação (9). Enquanto o papel do CD107a ainda está sendo determinado, os estudos do siRNA contra o CD107a mostraram que é essencial para o tráfico de perforina dentro das vesículas, uma vez que a entrega de perforina para grânulos líticos é inibida na ausência do CD107a (10). Também foi demonstrado que o CD107a tem um papel na protecção das células citotóxicas da morte, ligando-se à perforina e impedindo a inserção na membrana celular (11).existem dois tipos principais de linfócitos citotóxicos, células assassinas naturais (NK) e células T CD8. Ambos os tipos de células matam através da libertação de grânulos líticos, a via do receptor Fas/ligando Fas e a via do receptor TRAIL/TRAIL, mas o estímulo necessário para ativar estes dois grupos de células é diferente. As células T reconhecem o antigénio apresentado pelas moléculas MHC classe I através do seu receptor de células T activante (TCR), enquanto as células NK reconhecem os antigénios das células alvo através de vários receptores inibitórios e activadores. Os receptores inibitórios são importantes para evitar que as células NK matem células saudáveis enquanto que os receptores activadores induzem citotoxicidade das células NK.

antes da identificação do CD107a como marcador para a degranulação nas células NK (12), a saída para medir a capacidade citotóxica foi a morte das células-alvo. A detecção de CD107a por citometria de fluxo permitiu aos investigadores identificar as células efectoras específicas com capacidade citotóxica. Desde a sua descoberta, uma grande variedade de publicações de dados de Estudos em ratos e humanos foi concluída mostrando a vantagem de usar um anticorpo anti-CD107a. O rato é um modelo animal imunológico valioso para o estudo de doenças como leucemia e enxerto vs. doença do hospedeiro (13), mas as leituras funcionais têm sido prejudicadas pela falta de anticorpos anti-rato específicos de alta qualidade para a citometria de fluxo. This paper describes the creation of an anticorpo toward rat CD107a and characterization of the degranulation response in rat NK and CD8+ T cells.

materiais e métodos

animais

hamsters inbred Arménios (Cytogen Research and Development Inc., MA, EUA) foram alojados no departamento de Medicina comparativa em Rikshospitalet, Hospital da Universidade de Oslo, de acordo com as Diretrizes institucionais. O rato cepas PVG-RT1U, PVG-RT7b, PVG-RT1N, e PVG-R23 foram usados de forma intercambiável e mantida por mais de 20 gerações e alojados em conformidade com as diretrizes definidas pelo Animal Experimental Conselho de acordo com o Ministério da Agricultura de Noruega e pela Convenção Europeia para a Protecção dos Animais Vertebrados utilizados para fins Experimentais e Outros Finalidade Científica. Os ratos foram utilizados com a idade de 8-12 semanas. As instalações dos animais de laboratório são submetidas a um programa de monitorização da saúde de rotina e testadas para pesquisa de organismos infecciosos de acordo com uma modificação das recomendações da Federação Europeia de Ciências Animais de laboratório. As experiências com animais foram regulamentadas através de regulamentos laboratoriais, que são apresentados pela Lei relativa ao bem-estar dos animais, na qual a Noruega segue a direcção laboratorial da UE e a Convenção laboratorial Europeia.

Abs e reagentes

anticorpos contra Nkp46, NKR-P1A 3.2.3-PB, ou unconjugated (obrigatório apenas NKR-P1A, mas não NKR-P1B, no PVG deformação), CD8 (OX8-biotina), CD2 (OX34, unconjugated), TCR (R73-Alexa647), o mouse IgD b allotype (TIB96-unconjugated, usado como mouse IgG isotype), e CD45.2 (His41-FITC, usado como mouse IgG isotype) foram feitas em nosso laboratório e conjugados de acordo com protocolos padrão. Os anticorpos contra o CD3 (IF4, não conjugados) e a sua IgM do rato isótipo (MM-30, não conjugada) e o controlo do isótipo da IgG do hamster Arménio (HTK88-FITC) foram comprados a Biolegend (San Diego, CA, EUA). Os anticorpos anti-CD107a comerciais foram comprados a AbCam (Cambridge, Reino Unido) (H4A3-FITC), eBioscience (San Diego, CA, EUA) (ID48-PerCP-eFluor), e Lifespan (Seattle, WA, EUA) (LS-C8580-não conjugados). LS-C8580 foi conjugado com o éster ALEXA488 NHS (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) para uso em ensaios funcionais. Anticorpos anti-bandeira (M2, não conjugados) e IgG anti-rato (cabra policlonal-FITC) foram comprados a Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, EUA). O IL-2 foi obtido a partir de uma cultura celular dialisada sobrenadante de uma linha celular de ovário de hamster chinês (CHO) transfectada de forma estável com uma construção de expressão IL-2 do rato. A streptavidina conjugada com proteína Peridinina clorofila-A (PerCP), o controlo do isotipo policlonal do hamster FITC, o controlo do isótipo IgG1 do Ratinho FITC (MOPC-FITC) e o GolgiStop foram comprados na BD biosciences (Franklin Lakes, NJ, EUA). O hamster anti-arménio de cabra (policlonal-FITC) foi comprado à Jackson Immunoresearch (West Grove, PA, EUA). Sobrenadante de hybridomas OX41, CD172a (SIRPa), 73 (anti-rat TCRaß), OX19 (anti-CD5), OX12 (anti-Igk cadeia), e OX33 (anti-CD45RA) foram feitas em casa. O soro do hamster Control foi derivado de hamsters Arménios não imunizados.

a clonagem de ratos CD107a

Rat CD107a foi amplificada por PCR a partir de cDNA gerado a partir de splenócitos de ratos PVG e subclonado em um vetor de expressão pMX contendo um gene de resistência à puromicina (um dom generoso do Dr. Michael R. Daws) (14). Os primers CD107 foram projetados com base em uma sequência cd107a (LAMP1) cDNA de ratos (GenBank: NM_012857). Iniciador da frente: 5′-GCCCCAGCACTGTTCGAGGT-3′; iniciador inverso: 5′ – GTTGTTACGTCTGTACACACT-3′. Um peptídeo líder aniônico tripsin – 1 (MSALLILALVGAAVA) foi usado na expressão vetor, e a região transmembranar CD107 original foi substituída por um fragmento transmembranar CD8 para facilitar a expressão de alta superfície. Uma marca de bandeira (DYKDDDK) foi ligada ao N-terminal da proteína CD107 para fazer a expressão da superfície detectável. Todas as sequências inseridas e estrutura de leitura aberta na construção final de plasmídeos quiméricos foram examinadas e confirmadas pela sequenciação de ADN de Sanger.

transferindo BWZ.36 células com plasmídeo pMX-CD107a

293T foram semeadas numa placa de cultura de 6 células com meio RPMI 1640 de 4 ml, transfectadas com 7, 5 µl de reagente FuGENE6 (Roche, protocolo do fabricante) e incubadas a 37°C com 5% de CO2. O reagente FuGENE6 foi pré-diluído com Opti-MEM (Gibco) e misturado com 1, 5 µg de plasmídeo pMX-CD107a e 1 µg de plasmídeo retroviral específico pCL-ECO roedor (Addgene #12371). Vinte e quatro horas após a transfecção, o sobrenadante foi descantado e substituído por meio RPMI1640 com 2% de FBS e transferido para 32°C para produção retroviral. Quarenta e oito horas depois, o sobrenadante foi colhido e filtrado com um filtro de filtropur s de 0,2 µm (Sarstedt) e guardado a -80°C para transdução retroviral.105 BWZ.36 células foram semeadas por alvéolo numa placa de cultura de 24 alvéolos (Corning) e cultivadas com meio fresco RPMI1640 com 10% de FBS, durante a noite. O sobrenadante foi removido e RPMI1640 contendo 10% de FBS, 16 µg de polibreno (para uma concentração final de 8 µg/ml) e 1,5 ml de sobrenadante retroviral foi adicionado e centrifugado a 32°C a 2400 rpm durante 2 h. As células foram então incubadas a 32 ° C durante 1 h, após o que o sobrenadante foi removido e substituído por meio RPMI1640 fresco com 10% de FBS e cultivadas durante 3 dias, a 37°C com 5% de CO2 (no dia 2, pode utilizar-se um meio completo com 1 ng/ml de puromicina). Os transfectantes de bandeira BWZ.CD107a expandidos foram examinados para a expressão da marca da bandeira na superfície e, em seguida, foram usados para imunização de anticorpos ou rastreio de anticorpos.o plasmídeo de rato chimérico CD107a foi transfectado em células CHO. Brevemente, as células CHO foram cultivadas em meio RPMI1640 completo (cRPMI; RPMI1640 meio com 10% de FBS, 1mm na piruvato, 50µM 2-mercaptoetanol) até atingirem a confluência de 30%. O plasmídeo de 2, 5 µg foi misturado com 7, 5 µl de reagente Fugene 6 (Roche) e adicionado às células gota a gota. Dois dias depois, as células CHO foram destacadas com meio RPMI1640 complementado com EDTA 2mM e foram semeadas em placas de cultura de células inferiores bem planas (25 células/alvéolo) com meio de selecção (cRPMI complementado com 20 µg/ml de puromicina) para clonagem de transfectantes estáveis. Após 10-12 dias de cultura, os clones adultos foram rastreados com anticorpo anti-FLAG (M2). Um dos clones expressando o mais alto nível de superfície da bandeira e CD107a foi usado para imunizações.

imunização e fusão celular

os hamsters inbred arménios de 3 a 10 semanas de idade foram imunizados por injecções intraperitoneais (I. p.) com 2 × 106 células do CHO. CD107a uma vez por semana durante 3 semanas. Um impulso com 4 × 106 células BWZ.CD107a transfectadas de forma estável foi dado I. p.32 dias após a primeira imunização e os soros foram analisados para coloração superficial de ambas as células CHO.CD107a-FLAG e BWZ.Cd107a-FLAG transfectants. Dois dos três animais foram positivos, e 3 dias após o reforço, as células do baço foram colhidas e combinadas dos dois animais, Um dos quais tinha esplenomegalia. Cerca de 2, 0 × 108 células de baço e 1, 4 × 108 células de mieloma foram lavadas três vezes em DMEM com aditivos (1mm de piruvato de sódio, 0, 05 mM de 2-mercaptoetanol e antibiótico/Antimicótico) e centrifugadas a 90 g durante 10 minutos. Mantendo tudo a 37°C Deste ponto para a frente, o sedimento foi dissolvido batendo no tubo e adicionou-se polietilenoglicol 1500 (Roche), gota a gota, enquanto se agitava suavemente durante 1 minuto. Foram gradualmente adicionados três mililitros de DMEM com aditivos para os próximos 3 minutos de acabamento com um adicional de 7 ml antes da centrifugação a 500 g. o sedimento foi lavado com um autoclismo cuidadoso (sem ressuspensão) com DMEM com aditivos e 20% de FBS (DMEM-20) e cultivado durante a noite. As células foram colhidas no dia seguinte e foram adicionados 100 ml de DMEM-20 com 2× hipoxantina–aminopterina–timidina (SIGMA) e 10% de suplemento de clonagem de hibridoma (HCS) (PAA). A suspensão celular foi transferida para placas de 96 poços. Após 12 dias, sobrenadantes de clones em crescimento foram testados por citometria de fluxo para coloração de antigénios de superfície presentes em BWZ.CD107a-FLAG e CHO.CD107a-FLAG, mas não em BWZ.36 células transferidas com antigénios marcados irrelevantes como controlos negativos. Os 9 dos 12 clones positivos que produziram anticorpos específicos foram ainda subclonados utilizando DMEM-20, complementados com hipoxantina-timidina e HCS. Apenas um clone (SIM1) ainda produziu anticorpos após subclonagem e este foi mais uma vez subclonado. Anticorpos IgG específicos do hamster CD107a foram detectados pela IGG anti-Armenian hamster FITC (Jackson Immunoresearch). O anti-CD107a do hibridoma SIM1 foi purificado pela proteína G HP HiTrap (GE Healthcare, Life Sciences) e conjugado FITC de acordo com procedimentos padrão ou conjugado Alexa488 de acordo com o protocolo do fabricante.a partir do baço prepararam-se suspensões de células efectoras. Os linfócitos foram isolados utilizando um gradiente de Linfoprepo e, em seguida, passam por uma coluna de lã de nylon para remover células B e macrófagos. Para a geração de células NK activadas por IL-2 (LAK), as células restantes foram cultivadas durante a noite em IL-2. No dia seguinte, as células não aderentes foram removidas por lavagem com PBS e as células NK aderentes foram mantidas em RPMI complementadas com IL-2, 10% de FBS inactivados pelo calor, 1% de estreptomicina/penicilina, 1mm de piruvato de sódio e 50 µM de 2-mercaptoetanol. As células foram cultivadas durante 8-10 dias. Para a geração de células NK enriquecidas ou de células T e NK separadas, as células foram enriquecidas por seleção negativa após a etapa de lã de nylon. Para o enriquecimento de células NK, pan-mouse IgG Dynabeads (Invitrogen Dynal) foram revestidos com anticorpos contra macrófagos (OX41), células T (R73 e OX19), e as células B (OX12 e OX33). Para o enriquecimento das células T, as Dinabeads IGG pan-mouse foram manchadas com anticorpos contra os macrófagos (OX41) e as células B (OX12 e OX33). As células foram enriquecidas por dois passos de selecção negativa com esferas manchadas durante 30 minutos a 4 ° C. As células NK enriquecidas tinham uma pureza de aproximadamente 50-60% e foram utilizadas para estudos de degranulação. As células T enriquecidas (79-85% de pureza) foram ainda separadas para as células TCR+ utilizando uma Aria FACS (Biociências BD).

Degranulação Ensaios

Para medir a degranulação de resposta por coloração com anti-rat CD107a (SIM1) durante a célula-alvo estimulação, NK processadores de efeitos e YAC metas células foram incubadas, em uma razão de 1 para 1 de 3 × 105 células/poço (excepto se declarado o contrário), em meios contendo o SIM1 ou o mAb, a outros disponíveis comercialmente anti-CD107a anticorpos, ou isotype de controle. Para medir a resposta de degranulação à estimulação de anticorpos a partir de células NK, utilizámos placas de fundo plano com 96 alvéolos revestidas com concentrações variáveis de anti-NKp46 (Wen23), anti-NKR-P1A (3.2.3) e um controlo do isótipo IgG1 do rato (TIB96). No dia seguinte, as placas foram lavadas com PBS e bloqueadas com cRPMI antes da adição de 3 × 105 células NK enriquecidas suspensas em cRPMI contendo SIM1 foram adicionadas por Poço. Para medir a degranulação das células T, foram classificadas e cultivadas em cRPMI com IL-2 durante 2-3 dias. As placas de fundo com 96 alvéolos foram revestidas durante a noite com anticorpos contra CD3 (IF4), CD2 (OX34), ou um controle de isótopos de IgM (MM-30). Cerca de 3 × 105 células T foram adicionadas por poço em cRPMI contendo SIM1. Todos os ensaios foram incubados por 4 h. Golgistop foi adicionado durante os últimos 3 h de incubação para evitar a degradação do internalizado CD107a. As células foram então lavadas e coradas com anticorpos para o adequado superfície receptores e analisados utilizando o FACS Canto ou LSR II (BD Biosciences).ensaio de Libertação de crómio YAC – 1 células alvo (5 × 106 células/ml de cRPMI) com adição de 3.Incubaram-se 7 MBq51Cr a 37°C durante 1 h, mexendo a cada 15 minutos. As células foram então lavadas três vezes com PBS com 2% FBS e ressuspendidas para 1 × 105 células/ml em cRPMI. As células efectoras de LAK e as células-alvo foram revestidas com as razões especificadas num volume final de 200 µl. As células foram centrifugadas e incubadas durante 4 h a 37°C. A libertação específica de 51Cr foi medida utilizando o Cobra auto-Gama (Packard).

resulta em

para criar um anticorpo contra o CD107a, fizemos um vector de expressão contendo a região extracelular da membrana do rato CD107a, a região transmembranar do rato CD8, e uma marca de 3′-terminal para detectar a expressão da superfície (figura 1A). O vector foi transfectado em células CHO e no BWZ.Linha de 36 T de células e rastreada para a expressão CD107a utilizando um anticorpo anti-FLAG (M2) (figura 1B). Foram injectadas células-CHO stavelmente transfectadas CD107a em hamsters inbred Arménios uma vez por semana durante 3 semanas com um impulso final de células BWZ transfectadas stably CD107a 3 dias antes da fusão com a linha celular de mieloma NS0. Sobrenadantes dos diferentes clones foram testados quanto à especificidade para BWZ.CD107a-FLAG, mas não irrelevantes BWZ marcado com bandeira.36 transfectantes. Um clone, SIM1, foi encontrado para se ligar especificamente ao CD107a expressando transfectante, mas não ao controle transfetado da bandeira (figura 1C).

o clone SIM1 foi ainda testado em ensaios funcionais em paralelo com dois anticorpos CD107a comercialmente disponíveis, que poderiam potencialmente reagir cruzada com CD107a de rato na citometria de fluxo. O anticorpo clones testados foram H4A3 da AbCam (que cruz reage com humanos, rato, rato, e primatas em citometria de fluxo) e o anticorpo clone LS-C8580 de Vida Biociências (que cruz reage com CD107a do mouse, humanos e ratos, imunohistoquímica e Western blots de acordo com o site do fabricante). O nosso clone de anticorpos SIM1 identificou células degranuladoras na presença de células alvo e mostrou pouca coloração de fundo na ausência de alvos (figura 2A do painel superior). O Clone H4A3 manchou a maior percentagem de células NK após estimulação das células alvo (painel médio). No entanto, houve também um elevado nível de coloração de fundo na ausência de células alvo, indicando ligação não específica. Níveis muito baixos de degranulação, se houver, foram medidos pelo clone LS-C8580 mAb (Painel inferior). A especificidade destes anticorpos foi confirmada por coloração positiva do transfectante BWZ.CD107a-FLAG, mas não BWZ.Controlo da bandeira NKR-P1F (figura 2B). O anticorpo clone H4A3, que tem sido mostrado para ligar para humanos CD107a (16), não mancha rat CD107a transfected BWZ células, indicando que não há nenhuma reação transversal com ratos CD107a. O anti-mouse CD107a clone ID48 também não mancha o rato CD107a transfectant. LS-C8580 não conjugados, por outro lado, mostraram coloração específica de células transfectadas CD107a (dados não mostrados). No entanto, o clone LS-C8580 só está disponível como anticorpo não conjugado que não é adequado para estudos de degranulação. Tentativas repetidas em nosso laboratório para conjugar LS-C8580 para Alexa488, infelizmente, não forneceu qualquer forte coloração conjuga, embora o pequeno tamanho da amostra e a concentração de LS-C8580 pode ser a causa dos pobres conjugação. O LS-C8580 conjugado mostra coloração reduzida, mas específica, das células transfectadas CD107a (figura 2B), mas, como mostrado na figura 2A, Não fomos capazes de detectar células degranuladoras durante os ensaios funcionais com este conjugado. Em conclusão, o mAb SIM1 mancha especificamente as células NK do rato desgranulantes após estimulação com as células alvo.