Results

Modulation of Cellular p107 Levels Through Controlled Proteolysis. Mostramos anteriormente que a endógenos p107, um membro do RB família de proteínas, o que não é natural do substrato de SCFßTrCP, pode ser eliminado na C33A células de carcinoma cervical pela expressão ectópica de uma quimérica ßTrCP hidrolase–proteína ligase (ßTrCP-E7N) que carrega um p107-ligação de peptídeos derivados de N-terminal 35-aa resíduos do HPV oncoprotein, E7 (E7N) (1). No entanto, as funções de muitas proteínas celulares são ditadas pela sua abundância intracelular, e não simplesmente pela sua presença ou ausência. Até à data, não existe um método fiável para modular com precisão os níveis de proteínas intracelulares nas células de mamíferos.

primeiro investigou se p107 níveis poderiam ser sistematicamente reduzida através da expressão controlada de diferentes quantidades de ßTrCP-E7N. O humano C33A células de carcinoma cervical foram infectados com o aumento das doses de adenovírus recombinante carregando ßTrCP-E7N ou o controle de adenovírus por 24 h. A infecção foi de 100%, mesmo na dose mais baixa utilizada, conforme avaliado pela expressão de GFP transportada pelo adenovírus em todas as células receptoras (dados não apresentados). Como mostrado na Fig. 1( superior), os níveis endógenos de p107 foram sistematicamente reduzidos para 78%, 25% e 5% dos níveis no estado estacionário quando as células C33A foram transduzidas com adenovírus ßTrCP-E7N recombinante em mois de 10, 35 e 80, mas não com as mesmas doses do vírus controlo Ad1. Por conseguinte, o scfßtrcp-BP concebido oferece um meio simples e reprodutível para reduzir as quantidades globais de proteínas-alvo a níveis definidos para avaliar os efeitos de dosagem nas actividades biológicas.

p > P107 associa-se estavelmente ao cyclin a e ao Cdk2 através de um local de ligação de elevada afinidade em células proliferantes (13-15). Para determinar se estas proteínas associadas ao p107 são também sujeitas a degradação específica pelo ßTrCP-E7N, a imunoblotting foi efectuada em células C33A infectadas pelo vírus Ad-F-TrCP-E7N. Como mostrado na Fig. 1, os níveis endógenos de ciclina a e de Cdk2 permaneceram inalterados, ao passo que o p107 foi drasticamente reduzido. Além disso, os níveis de β-actina não alvo não foram afectados pelo F-TrCP-E7N (Fig. 1). Este resultado forneceu fortes provas de que a ligase proteica ubiquitina-ubiquitina produzida por engenharia degrada especificamente o substrato P107, mas não as proteínas associadas.degradação selectiva de uma subpopulação específica da proteína-alvo pós-operacionalmente modificada. A modificação de uma proteína celular no nível pós-transferacional, como a fosforilação, é um meio fundamental que as células empregam para regular a função ou para conferir novas atividades da proteína. As ferramentas experimentais para dissecar a função associada a um evento específico de modificação pós-translacional são atualmente limitadas. Porque a proteína nocaute opera no posttranslational nível que diretamente reconhece alvo proteínas, uma aplicação para a engenharia de um específico E3, que é capaz de selecionar uma subpopulação de posttranslationally modificação de proteínas para degradação, em vez de destruir toda a população.verificou-se que o HPV16 E7 Se liga selectivamente à forma hipofosforilada de RB (16). Investigámos se a ligase quimérica da proteína ubiquitina-E7N da ubiquitina podia distinguir a RB hipo–e hiperfosforilada e seleccionar apenas a hipoforme para degradação. As células osteossarcoma u2os humanas expressam ambas as formas de RB que podem ser facilmente identificadas, com base na sua mobilidade electroforética diferente em SDS / PAGE (Fig. 2A, lane 1) (17). A identidade destas duas espécies RB foi verificada através da imunoblotting utilizando anticorpos específicos para as formas hipo ou hiperfosforiladas de RB (Fig. 2A, faixas 2 e 3). As células U2OS foram infectadas com os adenovírus ad-F-TrCP-E7N recombinante ou o adenovírus AD1 controlado durante 48 h, E os níveis de RB-P e RB no estado estacionário foram analisados simultaneamente por Western blotting, usando um anticorpo monoclonal anti-RB que reconhece ambas as formas. Consistente com a ligação preferencial do E7N ao RB hipofosforilado, a expressão ectópica do F-TrCP-E7N resultou na eliminação do RB hipofosforilado, enquanto o RB-P hiperfosforilado ficou intacto (Fig. 2B Upper, compare as faixas 4-6 com as faixas 1-3). Este resultado destaca a capacidade da engenharia de F-TrCP-E7N hidrolase–proteína ligase na seleção de uma subpopulação específica de RB para a degradação, que foi baseado em o estado de determinados posttranslational modificação da proteína alvo.Fig. 2. degradação selectiva de RB sob a forma hipofosforilada nas células U2OS. A) as células U2OS contêm simultaneamente formas hipofosforiladas e hiperfosforiladas de RB. Immunoblotting foi realizado para detectar RB em U2OS célula extrai usando anticorpos que reconhecem tanto RB formas (via 1) (IF8, Santa Cruz Biotechnology), ou específicos para hypo- (faixa 2) (G99–549, BD Biosciences) ou hyperphosphorylated RB (faixa 3) . B) as células U2OS foram infectadas com doses crescentes (em µl) de adenovírus Ad1-F-TrCP-E7N ou de adenovírus de controlo pAd1 durante 48 h. os extractos das células foram preparados e imunoblotados com anticorpos contra RB, p107, FLAG (M2), p21waf1, p27kip1 e β-actina.

HPV16 E7 pode interagir com os inibidores da quinase dependentes das ciclinas p21Waf1 e p27Kip1, mas o domínio de ligação foi mapeado para o domínio C-terminal (resíduos 40-98), em vez do fragmento E7N (resíduos 18-20). Para examinar a especificidade de F-TrCP-E7N, os mesmos extratos de células U2OS também foram sondados com anticorpos contra p21Waf1 e p27Kip1. Como se vê na Fig. 2B (Médio), os níveis de estado estacionário de p21Waf1 e p27Kip1 permaneceram inalterados. Together, the engineered F-TrCP-E7N demonstrated proteolytic specificity toward the RB family proteins, but not other cell-cycle regulators such as Cdk2, cyclin a, p21Waf1, and p27Kip1.mutagénese baseada na estrutura para gerar uma Ligase altamente específica da proteína ubiquitina ßTrCP-E7N. O ßTrCP-E7N quimérico ainda é capaz de ligar os substratos ßTrCP endógenos, incluindo IkB, β-catenina e ATF4 (3-7). A sobreexpressão do ßTrCP-E7N pode interferir com a degradação destes substratos nativos. Inversamente, a ligação do substrato endógeno à ßTrCP-E7N pode interferir com o posicionamento adequado do substrato pretendido para aceitar a ubiquitina da enzima conjugadora da ubiquitina e, por conseguinte, reduzir a eficiência da degradação orientada (Fig. 3AUpper). Além disso, o ßTrCP interage com um pseudo substrato hnRNP-U, que liga o ßTrCP e os seus derivados no núcleo e exclui a sua interacção com os substratos (21). Através da introdução de mutações pontuais dos resíduos de aminoácidos em ßTrCP para eliminar a sua ligação à β-catenin, IkB, ou hnRNP-U, antecipamos para melhorar não só a especificidade, mas também a disponibilidade de engenharia ßTrCP-E7N para recrutar a intenção de substrato (Fig. 3ALower).Fig. 3. mutagénese baseada na estrutura dos resíduos de ligação do substrato no motoreredßtrcp–E7N ubiquitin-proteína ligase. A) diagramas esquemáticos dos complexos SCFßTrCP-BP/IkB/target previstos e SCFßTrCP(m1)-BP/target previstos. Ta, peptídeo de ligação; T, alvo. B) modelo tridimensional do WD40 repetições de ßTrCP. Os cinco resíduos carregados positivamente são cianos. C) a ligase F-TrCP(m1)-E7N ubiquitina–proteína não se pode ligar à IkB, mas mantém a sua interacção com a p107. Células HeLa foram transitoriamente transfected com IkB, juntamente com pcDNA3 (faixa 1), F-TrCP (pista 2), F-TrCP-E7N (faixa 3), e o F-TrCP(m1)-E7N (linha 4), e tratados com MG132 for2hand, em seguida, com o TNF-α por 15 min. Foram preparados extractos celulares para imunoprecipitação com o anticorpo anti-FLAG (M2), e sondados com anticorpos fosforilados IkB ou anticorpos policlonais anti-p107. O F-TrCP (m1)-E7N migra como um duplo em géis SDS por razões ainda a determinar (pista 4). D) degradação eficiente do p107 por F-TrCP(m1)-E7N em células C33A. As células C33A transfectadas com os plasmídeos indicados e 1 µg de pCMV-CD19 foram enriquecidas por selecção imunomagnética, e os níveis de P107 endógeno foram examinados por imunoblotting. (E) ensaio de imunofluorescência Indirecta foi realizado para detectar endógena p107 (Centro), em resposta a transientes de transfeccao e expressão de F-TrCP, F-TrCP-E7N, ou F-TrCP(m1)-E7N (Esquerda) e individuais C33A células (indicados pelas setas). Imagens do mesmo campo de células com 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) foram mostradas para identificar os núcleos de ambas as células transfectadas (marcadas por setas) e não-infectadas.

o domínio de ligação ao substrato do ßTrCP contém sete repetições WD40 na região Terminal C, que se dobram na estrutura típica de hélice β de sete lâminas conservada entre as proteínas WD40 (3-7). Uma vez que a integridade global da estrutura da hélice β das proteínas WD40 é fundamental para as suas funções, a abordagem de mutagénese por eliminação padrão irá provavelmente induzir alterações estruturais grosseiras, pelo que não é aplicável à definição de locais de ligação ao substrato do ßTrCP. No entanto, a estrutura cristalina conhecida das proteínas WD40 pode ser explorada para identificar os resíduos de superfície envolvidos na ligação dos substratos ßTrCP. Uma abordagem de mutagénese baseada na estrutura foi projetada para identificar e mutar cinco resíduos positivamente carregados (R285, K365, R474, R521, e R524), predito para residir na superfície superior da hélice-β WD40, que estão envolvidos na ligação às proteínas associadas à WD40 (Fig. 3B) (22). Esta abordagem foi detalhada em Métodos de apoio, que é publicada como informação de apoio no site PNAS. Além disso, ver Fig. 6, que é publicado como informação de apoio no site PNAS. Além disso, as substituições destes resíduos Lys/Arg não irão provavelmente alterar a estrutura geral do ßTrCP.utilizando o Kit de mutagénese (Stratagene) de QuikChange multisite, alterámos simultaneamente estes resíduos para a Colu. Este composto mutante marcado com bandeira, designado F-TrCP(m1)-E7N, foi testado para a sua ligação tanto aos alvos finais endógenos (IkB) como aos pretendidos (p107). Células HeLa foram transitoriamente transfected com F-TrCP(m1)-E7N ou F-TrCP-E7N, e suas interações com IkB e p107 foram determinados por coimmunoprecipitation. F-TrCP-E7N E F-TrCP exibiram afinidades semelhantes à proteína IkB fosforilada, enquanto que o composto m1 mutantes aboliu a ligação F-TrCP(m1) – E7N (Fig. 3C Middle). Em contraste, níveis semelhantes de p107 foram detectados nas imunocomplexas de F-TrCP-E7N ou F-TrCP(m1) – E7N (Fig. 3C mais baixo), indicando que a ligase proteica f-TrCP(m1)-E7N ubiquitina–proteína é totalmente funcional no recrutamento dos alvos celulares pretendidos. Estes resultados estão de acordo com as previsões estruturais da Fig. 3B, e definir melhor os resíduos de aminoácidos no ßTrCP críticos para o reconhecimento endógeno do substrato.a engenharia F-TrCP (m1)-E7N foi ainda analisada quanto à sua potência na degradação do p107 endógeno. As células C33A foram coptransfectadas com F-TrCP, F-TrCP-E7N, ou F-TrCP(m1)-E7N, juntamente com uma expressão CD19 plasmídea. Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram colhidas e enriquecidas para aqueles que receberam os plasmídeos transfectados utilizando as esferas imunomagnéticas conjugadas com o anticorpo monoclonal anti-CD19. Os níveis endógenos de p107 foram subsequentemente determinados por imunoblotting. Como mostrado na Fig. A expressão ectópica 3D do F-TrCP(m1)-E7N resultou numa redução de 95% dos níveis endógenos de p107, enquanto que foi observada uma regulação negativa de 82% do p107 para o F-TrCP-E7N (Fig. 3D Upper, compare faixas 4 e 3). Além disso, a expressão do F-TrCP(m1)-E7N não teve qualquer efeito observável no factor de necrose tumoral (TNF)-α induziu degradação do IkB pelo scfßtrcp nativo, ou na destruição do p27kip1 pelas ligases da proteína ubiquitina–SCFSkp2 (dados não apresentados). Portanto, a expressão ectópica da engenharia de F-TrCP(m1)-E7N não interferir com o total de SCF ubiquitination atividade através da contenção do núcleo SCF componentes (Skp1, CUL-1, e Rbx1/Roc1) compartilhado por endógeno F-caixa de proteínas.a degradação alvo do p107 foi ainda avaliada em células c33a individuais através do doseamento indirecto da imunofluorescência. Consistentemente, p107 foi erradicado em células C33A expressando f-TrCP-E7N ou F-TrCP(m1)-E7N, mas não apenas F-TrCP (Fig. 3E). Colectivamente, estes resultados indicam que, ao eliminar os locais de ligação dos substratos ßTrCP endógenos, a proteína ligase proteolítica f-TrCP(m1)-E7N ubiquitina demonstrou uma maior especificidade e uma actividade proteolítica robusta em relação ao objectivo pretendido.domínio de ligação mínimo como objectivo do peptídeo para o recrutamento eficiente do substrato. Para atingir uma elevada especificidade de recrutamento de substrato e minimizar a focalização não específica de outras proteínas celulares, testamos se o domínio de interação mínimo p107/RB de E7N (designado E7m), que abrange resíduos 21-29 de E7 abrangendo o motivo LXCXE (23), poderia alcançar uma ligação e degradação eficientes do p107. Uma ligase quimérica de proteína ubiquitina foi construída em que ßTrCP e E7m foram covalentemente ligados por um espaçador flexível de 20 aa composto por 10 cópias de repetições Gly-Ser (designado 10GS). O F-TrCP-E7N ou F-TrCP-10GS-E7m foram transitoriamente transfected em C33A células, e a sua vinculação à endógenos p107 foi avaliada por imunoprecipitação em extratos elaborados após o tratamento com o inibidor de proteassoma MG132 para inibir a degradação como conseqüência dessa interação. Como mostrado na Fig. 4A (faixas 2 e 3), F-TrCP-10GS-E7m tinha um pouco maior afinidade para p107 do que o original F-TrCP-E7N. O F-TrCP-E7N e F-TrCP-10GS-E7m foram ainda avaliados quanto a sua eficiência na p107 degradação transitório, de transfeccao em C33A células, como na Fig. 3D. como mostrado na Fig. 4B, F-TrCP-E7N e F-TrCP-10GS-E7m induzido até 92% e 95% para baixo-regulamento de p107, indicando que a engenharia ßTrCP levando o mínimo p107-domínio de ligação funções de forma tão eficiente quanto o original F-TrCP-E7N em situações degradantes alvo proteínas.Fig. 4. o domínio mínimo de ligação p107 do E7 é suficiente para recrutar o p107 para destruição orientada. (A) a ligase proteica f-TrCP-10GS-E7m ubiquitina liga–se eficientemente ao p107. As células c33a transfectadas transitoriamente com os plasmídeos indicados foram tratadas com o inibidor do proteosoma MG132 para 2 h. Os extratos de células foram preparados para imunoprecipitação com o anticorpo anti-FLAG, e foram sondados com anticorpos contra FLAG ou p107. B) A degradação do P107 endógeno pelas células f-TrCP-E7m. C33A foram transfectadas transitoriamente com os plasmídeos indicados (em µg) e 1 µg de pCMV-CD19. As células transfectadas foram enriquecidas pela selecção imunomagnética da bead, e os níveis de estado estacionário das perfusões p107, F-TrCP e β-actina (controlo de carga) foram determinados pela imunoblotting usando anticorpos contra p107, FLAG e β-actina. O experimento foi repetido quatro vezes, e a quantidade de p107 restante foi medida pela análise do Fosforimager. Os níveis endógenos de β-actina foram também medidos como um controlo interno da carga.

Administração Retroviral mediada do ßTrCP para degradação sustentada de alvos endógenos. Em seguida, examinamos se as ligases ubiquitina–proteína poderiam ser expressas de forma estável para alcançar a degradação sustentada do alvo pretendido. As células da leucemia promielocítica HL-60 foram transduzidas com os retrovírus recombinantes expressando PBMN-GFP, F-TrCP(m1)-E7N, ou o Controle F-TrCP-E7N (ΔDLYC), no qual o local de ligação RB/p107 foi deletado (1). As células infectadas com transgénicos chiméricos f-TrCP integrados cromossomicamente foram isoladas por triagem FACS, com base na expressão de GFP dos vírus, e a degradação do P107 endógeno foi avaliada a partir de células HL-60 infectadas imediatamente após a infecção (Fig. 5A), ou após 3 meses de cultura em meio de crescimento (Fig. 5B). Além disso, como dois outros membros da família RB proteínas, RB e p130, também são expressos em células HL-60, nós examinamos se um único F-TrCP-E7N pode simultaneamente atingir a degradação de toda a família RB de proteínas que interagem com o mesmo motivo LXCXE de E7N. 5-A) e p130 (dados não apresentados) em células HL-60, quer imediatamente após infecção e triagem FACS (Fig. 5-a), ou 3 meses após a infecção e cultura contínua (Fig. 5B, lane 3). Em contraste, a expressão estável de F-TrCP-E7N(ΔDLYC) em células HL-60 não teve efeito na alteração de p107, RB (Fig. Níveis 5A, faixa 3) e P130 (dados não apresentados). Consistente com a observação de que A F-TrCP-E7N degrada preferencialmente a RB hipofosforilada nas células U2OS (Fig. 2), a redução da espécie RB hiperfosforilada pela expressão estável de F-TrCP-E7N foi menos pronunciada, em comparação com a forma hipofosforilada nas células HL-60 (Fig. 5A, compare a faixa 2 de pRB e pRB-P).Fig. 5. administração da proteína ubiquitina da proteína ligase F-TrCP-E7N mediada por retrovírus para degradação específica das proteínas da família RB nas células HL-60. A) as células HL-60 infectadas com os retrovírus recombinantes indicados foram isoladas por FACS e os níveis de estado estacionário de RB, p107, F-TrCP-E7N e F-TrCP-E7N(ΔDLYC) foram determinados por imunoblotting utilizando os respectivos anticorpos. os níveis de β-actina também foram determinados como uma especificidade e controlo interno de carga. RB e RB-P significam hipo e HIPERFOSFORILADO RB. B) as células HL-60 infectadas e separadas por FACS foram cultivadas durante 3 meses e não tratadas (faixa 3) ou tratadas com 1 µM de ATRA durante 72 horas (Faixa 2). A RB endógena, a p107 e a p130 foram determinadas em resposta à expressão de F-TrCP-E7N por imunoblotting. C) análise FACS para determinar o conteúdo de ADN das células HL-60 vivas infectadas pelo controlo ou pBMN-F-TrCP(m1)-E7N retrovírus em condições normais de crescimento e em resposta à paragem do crescimento induzida pelo ATRA.durante o tratamento com ácido retinóico all-trans( ATRA), as células HL-60 saem do ciclo celular e sofrem uma diferenciação terminal. Observou-se uma acumulação de RB hipofosforilado, que foi previamente notificada como contribuindo para a paragem do crescimento induzido pelo ATRA, enquanto que a RB hiperfosforilada não foi detectável (24, 25). Para examinar se a máquina SCFßTrCP também pode ser aproveitada durante a saída do ciclo celular, as células HL-60 que expressam f-TrCP-E7N ou F-TrCP(m1)-E7N foram tratadas com 1 µM ATRA durante 72 horas, e a degradação das proteínas da família RB foi avaliada. As células HL-60 expressando de forma estável F-TrCP-E7N resultaram em uma diminuição de 95%, 98% e 85% dos níveis de RB, p107 e p130, respectivamente, em comparação com as células infectadas com o vírus pBMN-GFP controle (Fig. 5B, lane 2). Porque ATRA também ativa a transcrição de genes sob o controle de leucemia murínica LTR de pBMN-GFP (26), o aumento da expressão de F-TrCP-E7N na ATRA tratamento provavelmente contribuiu ainda mais para o eficiente down-regulation p107, p130, e hypophosphorylated RB (Fig. 5B).

o efeito das proteínas da família RB na progressão normal do ciclo celular foi examinado em fibroblastos embrionários de ratinho com disrupções nos genes RB, p107 e p130, e verificou-se que não responde a sinais que induzem a paragem G1, tais como a retirada do factor de crescimento ou danos ao ADN (27, 28). No entanto, os efeitos coletivos dos membros da família RB na proliferação de células tumorais não foram estudados, devido à falta de ferramentas genéticas reversas eficientes. As células estáveis HL-60 que expressam F-TrCP (m1)-E7N a partir deste estudo permitiram-nos avaliar como as células tumorais deficientes para as três proteínas da família RB responderam aos sinais de paragem G1. Em células HL-60 em crescimento exponencial expressando F-TrCP (m1)-E7N que induziu a degradação constitutiva das proteínas da família RB, observou-se uma aceleração marcada da progressão do ciclo celular em comparação com as infectadas pelo vírus pBMN-GFP de controlo (Fig. 5c esquerda). Este resultado é consistente com o controlo deficiente das transições de G1–s observadas em fibroblastos embrionários de RB–/–, p107–/– e p130–/– knockout Triple mouse (27, 28).o tratamento com

ATRA inibiu a transição de fase G1-A-S em células HL-60 infectadas pelo pBMN-GFP de controlo (Fig. 5C) ou vírus F-TrCP-E7N(ΔDLYC) (dados não apresentados), o que é consistente com o que foi relatado para células HL-60 não infectadas (Fig. 5C) (24). Foi também observado um atraso inicial na transição G1–S nas células pBMN-F-TrCP(m1)-E7N/HL-60 às 48 horas após ATRA. No entanto, não foi possível obter uma paragem completa do G1 numa fase posterior (72-96 h) e as células continuaram o curso da progressão do ciclo celular (Fig. 5C). Em contraste, o controle pBMN-GFP/HL-60 células foram todos bloqueados no G1 entre 72 e 96 h. Estas observações sugerem que o F-TrCP(m1)-E7N mediada degradação da RB membros da família prejudica um final de ATRA-resposta de evento necessário para a conclusão de crescimento de prisão, considerando que o início de atenuação do G1–S progressão foi muito afetada. Além disso, observou-se uma redução dramática do número de células entre 72 e 96 h após o tratamento com ATRA devido à morte maciça das células durante a saída e diferenciação do ciclo celular induzida pelo ATRA (29). Surpreendentemente, a HL-60 células que expressam F-TrCP(m1)-E7N exibiu um aumento médio de 2 a 3 vezes na subG1 populações comparada com o controle de vírus infectado HL-60 células (dados não mostrados), o que é consistente com o aumento da morte celular em RB–/–, p107–/–, e p130–/– triplo mouse nocaute embrionárias células de fibroblastos em crescimento, inibidores condições (28). Colectivamente, a expressão constitutiva do F-TrCP(m1)-E7N induziu a sub-regulação de todas as proteínas da família RB, o que conduz a uma inibição da paragem do crescimento e a um aumento da morte celular durante o tratamento com ATRA.

arresto G1 induzido pelo ATRA envolve a regulação coordenada de múltiplos sinais/componentes celulares que controlam negativamente o ciclo celular (revisado em ref. 30). Dimberg et al. (31) informou que, ATRA dispara uma seqüência de eventos em células mielóides envolvendo precoce de um aumento na expressão de p21waf1, a estabilização da p27kip1, e, mais tarde, dephosphorylation de RB no início do G1 prisão. Porque ßTrCP(m1)-E7N só degrada o RB membros da família e não tem efeito sobre a estabilidade de p21waf1 e p27kip1, é provável que apenas o final, RB-dependente ATRA resposta é afetado, o que é consistente com a resistência de pBMN-F-TrCP(m1)-E7N/HL-60 células para concluir G1 arrestat72–96 h (Fig. 5C). A inibição do crescimento precoce observada pela ATRA às 48 horas (Fig. 5C) poderia ser atribuída, pelo menos em parte, à regulação ascendente de p21waf1 e p27kip1, cuja estabilidade não é afetada pela expressão constitutiva F-TrCP(m1)-E7N (figos. 2 e 5).