Melhor de pequena escala contínua do sistema de cultivo
neste estudo, vamos mostrar mais avanços e possibilidades de aplicação de uma pequena escala contínua, sistema de cultivo, anteriormente desenvolvido por Klein et al. , para um maior grau de paralelização e melhoria do manuseamento, bem como o controlo dos reactores individuais. Os principais aspectos das alterações introduzidas no sistema incluem um aumento do conjunto de recipientes de cultura paralela de 8 para 24 reactores e uma diminuição do volume de trabalho de 10 para 6,5 mL. O sistema actual consiste, além disso, em tampas feitas por medida que alojam quatro portas fixas utilizadas para arejamento, fornecimento de meios, remoção de caldo, bem como inoculação ou amostragem (Fig. 1). Além das quatro portas, uma sonda óptica em forma de vara do é inserida através da tampa para fazer o monitoramento sem perturbar o processo de cultivo, e desta forma substituindo o ponto sensor de oxigênio fluorescente da configuração anterior . O banho de água, que no set-up anterior manteve uma temperatura de cultivo constante, foi substituído por um bloco de aquecimento de alumínio personalizado, que é fundido a uma unidade de agitador microplate. Como a versão anterior do sistema de biorreactor de pequena escala foi validada usando a levedura de fissão Schizosaccharomyces pombe , apresentamos aqui o melhor sistema de cultivo para cultivações de S. cerevisiae.as fases operacionais básicas, bem como os ajustamentos das taxas de diluição, seleccionando o diâmetro adequado do tubo e a taxa de bomba da bomba de influxo do meio, foram realizados como descrito anteriormente . Neste caso, a massa do teor líquido de cada biorreator foi determinada gravimetricamente no final do cultivo, permitindo o cálculo exacto da respectiva taxa de diluição com um 5.Desvio de 1%. O caldo de cultura e a fase de gás do reator foram ambos removidos através do mesmo porto da tampa do reator usando a bomba de efluxo (Fig. 1). Em todas as experiências de cultivo foram utilizadas taxas de bomba de efluxo de 7, 5 mL min−1. A taxa da bomba de efluxo era muito superior à taxa da bomba de alimentação, gerando uma ligeira pressão negativa dentro do recipiente de cultura. Esta diferença de pressão resultou na entrada de ar através da porta de arejamento. O coeficiente médio de transferência de massa de oxigénio kLa atingido foi de 110 h-1, o que permitiu níveis de saturação de oxigénio muito acima de 30% ao longo do processo de cultivo. O pH não foi monitorado on-line nem controlado durante o cultivo, como o meio foi ajustado a priori a um pH de 6,0, o que resultou em um pH final de 5,5 no caldo de cultivo. O pH era medido em linha diariamente a partir da saída dos reatores e após a colheita. O pH permaneceu constante assim que o estado estacionário foi atingido e o efluente do reator mostrou um pequeno desvio de 0,1 unidades de pH (dados não mostrados).explorando a produção de 3-HP em quimiostatos de pequena escala a diferentes taxas de diluição em condições limitativas de C
para determinar a taxa de crescimento específico máxima (µmax), S. cerevisiae ST938 foi cultivada em condições de lote aplicando disponibilidade excessiva de nutrientes. Usando glicose como fonte de carbono, o µmax foi 0,265 h-1, o rendimento de biomassa foi de 24,9 g mol−1, e o rendimento de carbono de 3-HP na glicose foi de 0,6% C-mol (Tabela 1). Neste modo de cultivo, a maior parte do carbono era metabolizado em etanol e CO2, como fluxos glicolíticos elevados em espécies selvagens. as cerevisiae estão fortemente ligadas à fermentação alcoólica . As cultivações quimiostáticas são controladas pelo fornecimento de um substrato limitador do crescimento. No estado estável, de tipo selvagem S. cerevisiae não produz quantidades significativas de estouro de metabólitos abaixo de uma determinada taxa de crescimento, marcando a crítica de diluição taxa (Dcrit (h−1)), devido à falta de acúmulo de carbono de origem. A essa taxa crítica de diluição, a fonte de carbono acumula-se no reator e o metabolismo do excesso é desencadeado, resultando na produção de vários subprodutos, tais como etanol, acetato e pequenas quantidades de ácidos orgânicos . Assim, foram utilizadas culturas contínuas para investigar a relação entre a taxa de crescimento e a formação específica de produtos 3-HP de biomassa em S. cerevisiae ST938. As quatro taxas de diluição diferentes D (h−1): 0, 04, 0, 09, 0, 17 e 0, 21 foram escolhidas para ser inferiores ao µmax da estirpe ST938 de S. cerevisiae, determinada no cultivo em lote. Foram investigados o rendimento de biomassa da glucose, o rendimento de 3-HP, a taxa de produção específica de 3-HP e a taxa de absorção específica do substrato (Fig. 2a-d, Quadro 1). Todos os parâmetros de cultivo relevantes, ou seja, os rendimentos e as taxas com os respectivos desvios-padrão, são resumidos no quadro 1.
Selected rates and yields for C-limited aerobic chemostat cultivations of S. cerevisiae ST938 a 3-HP yield (C-mol C-mol−1) on glucose, b biomass yield on glucose (g mol−1), c specific 3-HP production rate (mmol gCDW−1 h−1) and d specific glucose uptake rate (mmol gCDW−1 h−1) at different dilution rates for S. cerevisiae ST938. Cultivations were carried out in triplicates at 30 °C and pH 5.5 under C-limited conditions. Erros correspondem aos desvios-padrão derivado da triplicata cultivos
O cultivo de S. cerevisiae ST938 em C-condições limitadoras mostrou um parâmetro a partir predominantemente fermentativa metabolismo observado em modo de lote para um respiratória, metabolismo de chemostats, o que se reflete em maior biomassa produz bem como insignificante etanol e glicerol formação (Tabela 1). Além disso, quantidades menores de glucose residual inferiores a 0.Foram detectados 1 mM nas amostras colhidas do efluxo dos diferentes reactores, verificando-se que as culturas são limitadas à glucose. As condições limitadas em carbono encontradas nas culturas de quimiostato em estado estacionário pareciam promover a formação de 3-HP, uma vez que os rendimentos deste produto eram 20 a 25 vezes superiores ao rendimento determinado na cultura do lote (Quadro 1). Isto é mais provável devido à conversão mais eficiente do carbono em energia sob a forma de ATP durante a respiração, em comparação com a fermentação em culturas de lotes. Curiosamente, as cultivações de S. cerevisiae ST938 em condições de limitação C revelou que, com taxas de crescimento específicas em declínio, se pôde observar um aumento constante nos rendimentos de carbono de 3-HP, com o maior rendimento de 3-HP de 16,6% C-mol observado a uma taxa de diluição de 0, 04 h−1 (Fig. 2a). O rendimento de 3 HP na biomassa é dez vezes superior ao das culturas em lotes e aumentou mais do dobro de 0,19 para 0,43 gcdw−1, reduzindo a taxa de diluição de 0,21 para 0,04 h−1 (Quadro 1). A produtividade máxima específica para 3-HP de aproximadamente 0, 50 mmol gCDW−1 h−1 foi observada com taxas de diluição de 0, 17 e 0.21 h-1, que é aproximadamente quatro vezes superior à medida em cultivações de lotes (Fig. 2C, Quadro 1). Como esperado, a taxa de absorção específica de glucose (qS) aumentou com taxas de diluição mais elevadas de 0, 51 para 2, 1 mmol gCDW−1 h−1 (Fig. 2d). Estes valores são até 20 vezes inferiores à taxa máxima específica de absorção de glucose de 10, 7 mmol gCDW−1 h-1 observada em µmax em condições de crescimento limitadas à glucose em modo lote (Quadro 1). Valores obtidos para a taxa de absorção específica do substrato e para o Rendimento da biomassa a uma taxa de diluição de 0.09 h−1 (Tabela 1) foram de acordo com dados da chemostat cultivos com o tipo selvagem S. cerevisiae na diluição taxa de 0,10 h−1, indicando 1.1 e 1,25 mmol gCDW−1 h−1, bem como de 0,49 g g−1, respectivamente . Verificou-se que o Rendimento da biomassa por substrato aumenta com o aumento das taxas de diluição, no caso da S. cerevisiae de tipo selvagem, no entanto, este parâmetro é geralmente constante abaixo do Dcrit, desde que o metabolismo de manutenção constitua um considerável sumidouro de carbono, reduzindo o Rendimento da biomassa a baixas taxas de diluição . No caso de S. no entanto, a estirpe ST938 de cerevisiae parecia que o carbono, que não se destinava à formação de biomassa, estava a contribuir, em certa medida, para a formação tanto de 3-HP como de subprodutos.
Para concluir, as diferenças de experiência em contínua culturas em diferentes taxas de diluição, bem como em comparação com o similar set-ups com S. cerevisiae tipo selvagem sugerem que a integração de biossintéticos caminho para produzir 3-HP tem um tremendo impacto na fisiologia de leveduras, que é, presumivelmente, amplificado por adaptável a resposta ao estresse. Por último, o cultivo limitado de quimiostatos com a menor taxa de diluição de 0.04 h-1 resultou no maior rendimento de carbono de 3-HP.após a caracterização de S. cerevisiae ST938 em condições c-limitantes, foram realizadas cultivações em condições limitadoras de azoto e fosfato, uma vez que se provou anteriormente serem favoráveis à produção de vários metabolitos nativos e não nativos em diferentes organismos . Aqui, as cultivações correspondentes sob limitação de azoto (N) e fósforo (P) foram investigadas no sistema de cultivo contínuo em pequena escala (Fig. 1) com uma taxa de diluição fixa de 0,04 h−1, que anteriormente resultava nos maiores rendimentos de carbono de 3-HP em condições C-limitadas (Quadro 1). Os parâmetros e os respectivos desvios – padrão das cultivações N E P limitadas da estirpe ST938 de levedura estão resumidos no quadro 2.
Para N e P-limitado condições de cultivo, não residual de amônio ou fosfatos foram detectados nas amostras tomadas a partir do efluxo de diferentes reatores, verificando as culturas a ser limitado com respeito a correspondente limitação de substrato (Tabela 2). No entanto, foram detectadas pequenas quantidades de glucose residual na gama de 0,63 e 0,19 mM na categoria N – E P-limitation (Quadro 2). Durante a limitação C, os níveis residuais de glucose foram muito inferiores a 0, 1 mM (Quadro 2). As cultivações que aplicam limitações N E P revelaram um rendimento de 3 HP de 17,7 e 21,1% C-mol, respectivamente, apresentando um valor significativamente mais elevado em condições P-limitadas do que o rendimento de carbono 3-HP de 16,6% c-mol calculado para condições C-limitadas de cultivo (quadros 1, 2). Da mesma forma, a produtividade de 3 HP foi significativamente maior para N e P-limitado cultivos revelando valores de 0,22 e 0,23 mmol gCDW−1 h−1, em comparação com a 0,17 mmol gCDW−1 h−1 chegou em C-limitado culturas. Além disso, os rendimentos de 3-HP na biomassa mostraram valores comparáveis de 0,43 e 0.44 g de gCDW-1 para as condições de limitação C E N, no entanto, em caso de limitação P, foi observado um aumento do rendimento de 0,50 g de gCDW-1. Devido às baixas concentrações globais de subprodutos quantificadas, estas são negligenciáveis (Quadro 2). Os valores para a taxa de absorção específica do substrato (qS) para a limitação C E P foram comparáveis e um valor ligeiramente elevado de 0, 61 mmol gCDW – 1 h-1 foi obtido em condições N−limitadas. A biomassa produz por substrato, em condições N-E P-limitadas, valores semelhantes de 72,4 e 75,2 g mol-1, respectivamente. Comparado com o rendimento de biomassa de 78.4 g mol−1 obtidos em condições C-limitadas, estes valores são semelhantes. Nosso estudo apoia a lógica de que maiores rendimentos de produto por substrato foram alcançados em condições N-E P-limitantes. Consequentemente, afigura-se que uma taxa de Absorção Específica mais elevada do substrato, em caso de limitação N, combinada com a formação mínima de subprodutos, favoreceu, em última análise, a formação do produto. Sob condições de limitação P formaram-se as menores quantidades de subprodutos, o que poderia favorecer a síntese do produto. Pode-se especular ainda que algumas mudanças metabólicas possivelmente levam a uma quantidade reduzida de carbono sendo liberado como CO2.
em resumo, as cultivações de chemostat sob limitação de N E P revelaram um aumento dos rendimentos de 3-HP e taxas de produção específicas em comparação com condições C-limitadas, com a limitação de P permitindo os maiores rendimentos do produto.
Transferência de parâmetros fisiológicos medidos em pequena escala chemostats a fed-batch culturas em 1-L bancada de biorreatores em C – e-P-condições limitadoras
uma vez que este estudo ainda, que visa avaliar a transferibilidade e a comparabilidade dos parâmetros fisiológicos medidos em diferentes condições de cultivo, o cultivo de parâmetros obtidos a partir do C – e-P-limitar as condições estabelecidas em chemostat culturas foram transferidas para 1-L mexido bancada de reatores de execução da fed-batch mode. O conceito desta abordagem consistia, por conseguinte, em manter constantes Condições e parâmetros essenciais para as culturas de chemostat e de fed-batch, a fim de assegurar a comparabilidade. Estas condições incluíam (i) a mesma razão C:P aplicada em cultivações de quimiostatos limitantes de P, (ii) as mesmas condições de processo como pH e temperatura, e (iii) as mesmas taxas de crescimento específico aplicadas em quimiostáticos, obtidas através de um perfil de alimentação exponencial. Para otimizar o título do produto, Os parâmetros com o rendimento máximo do produto por substrato dos experimentos de chemostat (D = 0.04 h-1) Em C – E P-limitation foram escolhidos para a transferência para o sistema fed-batch. Devido a restrições técnicas no set-up, fed-batch cultivos foram realizados em uma taxa de crescimento de 0,05 h−1, o que é ligeiramente superior em comparação com o conjunto de diluição taxa de 0,04 h−1 no chemostat cultivos. O cultivo em lote de alimentação consistia de uma fase inicial de lote para gerar biomassa seguida de uma fase de alimentação exponencial e limitada em nutrientes para controlar a taxa de crescimento. Apenas a fase de alimentação foi considerada relevante para a avaliação da transferibilidade dos parâmetros obtidos a partir do sistema de cultivo contínuo, uma vez que apenas durante esta fase a concentração do substrato controlava e, portanto, limitava o crescimento microbiano. Os perfis de cultivo em lotes alimentados de S. cerevisiae ST938, aplicando condições limitadoras C E P, são apresentados na Fig. 3, e os parâmetros de cultivo correspondentes com o respectivo desvio padrão são resumidos na Tabela 3.
Aeróbica fed-batch cultivo em 1-L bancada de fermentadores de S. cerevisiae ST938 usando uma exponencial de alimentação rampa D = 0.05 h−1, com a limitação de substrato de carbono, ou b fósforo. Círculos em preto referem-se a biomassa de titulação, quadrados vermelhos para 3-HP título e a linha tracejada azul para a quantidade absoluta de glicose alimentados para os reatores
A biomassa rendimento observado na fed-batch culturas, foi a 77,9 e 67,7 g mol−1 C e P-limitação, respectivamente. O Rendimento da biomassa para cultivações C-limitadas foi comparável entre a operação de quimiostato e a operação de fed-batch, enquanto que para a limitação P foi observada uma ligeira diminuição do Rendimento da biomassa durante a operação de fed-batch (Tabelas 2, 3), que está dentro dos desvios-padrão observados para ambos os rendimentos da biomassa. O rendimento de carbono por substrato para 3-HP foi de 15,9% para C-limitation, que é quase idêntico em comparação com o valor calculado no sistema chemostat (Fig. 4a). Os rendimentos de 3-HP determinados neste estudo estão em estreita concordância com um rendimento de carbono por substrato de 14% obtido em estudos anteriores com lotes de alimentos limitados por C em pH 5.0 com uma estirpe S. cerevisiae projectada para utilizar a via β-alanina e de 13% com uma S. cerevisiae utilizando a via redutase dependente da malonil-CoA . Em estudos com Escherichia coli que indicaram um valor de 42% em cultivações em lotes alimentados com glucose, foram determinados rendimentos de carbono de 3-HP por substrato através da Via Da β-alanina .
comparação dos parâmetros de cultivo sob diferentes limitações determinadas em quimiostatos de pequena escala e reactores 1-L de topo de banco em modo fed-lote. um rendimento de carbono de 3 HP (%C-mol) e B 3−HP na biomassa (ggcdw-1). Erros correspondem aos desvios-padrão derivado da triplicata cultivos
Para P-condições limitadoras, no entanto, o nosso estudo revelou um aumento considerável de 3 HP de carbono rendimento de 25,6% (Fig. 4a). Os rendimentos de 3-HP observados na biomassa foram de 0,38 e 0,65 g de gCDW – 1 para as condições C-E P-limitantes, respectivamente. No caso da limitação C, este facto confirmou os valores observados na configuração de chemostat(Fig. 4b). Devido ao aumento do rendimento de 3-HP por substrato em condições de limitação P e à ligeira diminuição do Rendimento da biomassa por substrato ao mesmo tempo, o rendimento de 3-HP por biomassa foi significativamente aumentado em comparação com o experimento chemostat. Em contraste com as cultivações realizadas em quimiostáticos, não foi detectada acumulação significativa de etanol ou glicerol em cultivações em lotes alimentados. Um balanço de carbono fechado para as condições de limitação C E P indicou que não foram formadas quantidades relevantes de outros (subprodutos)Produtos (Quadro 3). Esta diferença no espectro de subprodutos pode explicar o aumento do rendimento de 3-HP por glucose.
Em comparação com os cultivos realizados em chemostats, a captação de glicose taxas determinadas fed-batch culturas mostrar consideravelmente maiores valores de 0,75 e 0,77 mmol gCDW−1 h−1 para C – e-P-condições limitadoras, respectivamente. Como mencionado acima, o ponto de ajuste para o fator exponencial do perfil de alimentação foi definido para 0,05 h−1 e variou até 0,059 h−1, resultando em uma taxa de crescimento específico 30-45% mais elevada em cultivações de lotes alimentados em comparação com os experimentos de chemostat com 0.04 h-1 (Quadro 3), causando um aumento das taxas específicas de absorção de glucose. No entanto, para fermentações limitadas em C, o rendimento de biomassa em glicose era comparável entre o chemostat e o cultivo em lotes alimentados. Da mesma forma, as taxas de produção específicas de 3-HP foram elevadas em cultivações de lotes alimentados, com 0, 24 mmol de gCDW-1 h−1 e 0, 38 mmol de gCDW−1 h−1, respectivamente. Os rendimentos de 3-HP por substrato eram comparáveis entre o cultivo de quimiostato e o cultivo de fed-batch, sugerindo rendimentos como um parâmetro de cultivo robusto que é resistente a perturbações induzidas por flutuações menores no sistema de cultivo. Não foi detectado fosfato residual, nem glucose, nas amostras colhidas dos diferentes reactores para as condições de limitação de P, confirmando-se que as culturas devem ser limitadas no que respeita à limitação correspondente. Do mesmo modo, para a limitação C, não foi detectada glucose residual nas amostras.
The here presented improvements of a small-scale chemostat system, previously developed by Klein et al. , compreende, entre outros, um aumento do número de reatores para 24 e uma redução do volume de cultivo para 6,5 mL. Este aumento do grau de paralelização faz do sistema uma ferramenta adequada de triagem de alto débito, uma vez que vários sistemas de quimiostato comparáveis em pequena escala operam com volumes de trabalho mais elevados e com um menor número de reatores: o sistema de biorreator balançado paralelo contínuo (CosBios) utiliza seis, respectivamente, oito recipientes de cultura paralela com um volume de cultura de 20-25 mL . O sistema de biorreactores agitados para cultivações contínuas modificados para um único uso (biorreator, 2mag AG) funciona com oito reatores paralelos com um volume de trabalho de 10 mL . O sistema Mini-chemostat (MC) desenvolvido por Bergenholm et al. compreende 16 reactores paralelos e requer um volume de trabalho de 40 mL. Nosso sistema é, portanto, bem aplicável para a triagem simples e econômica do desempenho microbiano em modo contínuo. Pode ser relevante, no entanto, para uma maior extensão do sistema através da monitorização de parâmetros adicionais, tais como gases de escape, para permitir uma análise detalhada da distribuição de carbono, que é de particular importância para caracterizações de estirpes fisiológicas.como o nosso estudo sugeriu que a limitação N – E P-fosse favorável para a formação 3-HP em S. cerevisiae, experiências futuras poderiam envolver uma maior triagem das taxas de crescimento com a limitação N – E P aplicada, a fim de encontrar a produção 3-HP ideal com cada limitação respectiva. O nosso estudo mostrou ainda a transferibilidade dos parâmetros fisiológicos, desde o quimiostato até às cultivações em lotes. Isto só é viável se não se acumularem compostos tóxicos ou inibidores durante o cultivo do lote de alimentação, uma vez que os parâmetros fisiológicos mudariam ao longo do tempo e se desviariam dos parâmetros adquiridos nos quimiostatos. Como uma abordagem geral, as experiências com chemostat podem servir como uma ferramenta para investigar a influência de um potencial composto tóxico ou inibidor, adicionando a substância ao próprio alimento. Como todos os outros parâmetros são constantes, a influência do composto e sua concentração pode ser avaliada e avaliada diretamente. Em nosso estudo, não houve formação de subprodutos detectados em cultivações de lotes alimentados e uma resposta de estresse presumivelmente semelhante foi induzida devido a ácidos fracos, o que permitiu condições fisiológicas em quimiostáticos de pequena escala para se assemelhar aos EM condições de fed-lote.
em resumo, este estudo demonstrou que o conceito de condições limitativas de C E P para a produção de 3 – HP foi investigado num novo sistema paralelo de cultivo de quimiostatos e poderia ser transferido com sucesso para biorreactores 1-L de bancada que operam em modo fed-lote. Por conseguinte, os parâmetros fisiológicos adquiridos nos quimiostáticos podem ser utilizados para a concepção e avaliação do desempenho das cultivações em lotes alimentados com alimentos, utilizando parâmetros baseados no rendimento para o processo de criação.
