Automatizado de sequenciamento de DNA por eletroforese capilar
a Separação dos produtos de uma radioactively-rotulados ou fluorescente dideoxy reação de seqüenciamento historicamente tem sido feito em um poli-acrilamida laje de gel, por exemplo, do tipo utilizado em uma placa de 96 lane ABI 377. Desvantagens deste método incluem a necessidade de preparar um gel fresco para cada sequência de execução, Carregamento manual de amostras para o gel, tempos de execução relativamente longos (8 ~ 10 hrs para resolução de um fragmento de DNA 1Kb), e dificuldades em Rastreamento automático e/ou manual de faixas.
um método alternativo de separação utiliza eletroforese capilar. Uma série de reações padrão de sequenciamento de DNA dideoxídico são preparadas, cada uma em um poço de uma placa de 8 linhas x 12 coluna 96-poço. Uma série de tubos capilares ultra-finos (0.1 mm de diâmetro interior, com 50 ~ 80 cm de comprimento) são enchidos com uma mistura de contas de resina e colocados num conjunto multi-capilar. Uma extremidade da matriz é montada numa placa de cátodo carregada negativamente de modo que as suas extremidades se alinhem com cada poço da placa de amostra. A aplicação de alta tensão faz com que o DNA rotulado em cada amostra bem para entrar no capilar correspondente, e migrar embora em direção ao reservatório de ânodo positivamente carregado. Devido às altas tensões utilizadas, a separação eletroforética requer apenas 1 ~ 3 horas. Tal como na electroforese em gel de laje, os fragmentos mais pequenos movem-se mais rapidamente do que os maiores . Os corantes end-label são ativados por um laser na janela do detector , e o comprimento de onda de fluorescência de cada fragmento é lido por um fotômetro à medida que passa por um ponto fixo. Ao contrário do sistema de gel de laje, o laser e o fotômetro são fixos e imóveis, e podem ativar e ler vários Capilares lado a lado simultaneamente como fluxos de dados separados: isso evita o problema de rastrear faixas separadas em um gel de laje. Dados de mobilidade são enviados para um computador, e um cromatograma é gerado para cada amostra que é essencialmente idêntico aos do sistema de gel de laje. sequenciadores Capilares normalmente usam um robô para carregar uma pilha de placas de amostra automaticamente. O conjunto capilar é lavado com tampão entre placas, de modo que a máquina pode ser deixada a funcionar sem vigilância durante muitas corridas. Nas maiores instalações, as reações de PCR também podem estar ligadas diretamente a placas de sequenciamento em postos de trabalho robóticos que atendem dezenas ou centenas de sequenciadores Capilares. Os dados do cromatograma são colocados em um servidor, e podem ser baixados por usuários a centenas ou milhares de milhas de distância. Economices of scale can make it cheaper to outsourcing DNA sequencing rather than buying, maintaining, and staffing an in-house machine.
