Sistêmica agonísticos imunoterapia do cancro, induz a expansão diferencial de CD4 e CD8 linfócitos T na linfóides periféricos órgãos
Combinação de anti-CD40 com IL-2 tem sido mostrado para induzir atraso no crescimento e regressão em vários murino tumor modelos . Semelhante aos dados publicados utilizando a linha de células de tumor modelos, o tratamento da neoplasia intra-epitelial mamária-conseqüência (MIN-O) modelo , um tecido de transplante de linha, com anti-CD40 e IL-2 imunoterapia (ELE) levou a uma significativa anti-tumor respostas (P = 0.0057), incluindo regressão >50% dos ratos tratados (arquivo Adicionais 1: Figura S1A). Estudos anteriores têm mostrado que estas respostas anti-tumor a ser devido às células T CD8, portanto, nós avaliamos fenótipo de células T no baço, bem como dentro do tumor e pulmões (um local metastático comum para muitos modelos diferentes de tumor). Embora notemos que a terapia induziu a expansão CD8 em todos os órgãos, notamos algumas diferenças no fenótipo da memória de células T CD8 em todos os locais de órgãos (arquivo adicional 1: Figura S1B-C).nós e outros já demonstrámos anteriormente que terapias imunoestimuladoras fortes para o cancro induzem uma proliferação potente de células T de memória (CD44high) CD4 e CD8 no baço e nos gânglios linfáticos . Observou-se também que as células T CD4, mas não CD8, também sofrem morte celular induzida pela activação de forma dependente do interferão(IFN) – γ, resultando numa expansão global insignificante das células T CD4 por números nestes mesmos órgãos em comparação com o valor basal . Estes dados foram gerados através da leitura de órgãos linfóides. No entanto, à luz dos fenotipos observados nos ratinhos tratados com MIN-O, a expansão, activação e apoptose das células T activadas pode ser afectada diferentemente nos tecidos periféricos. Portanto, buscamos caracterizar e comparar ainda mais a ativação das células T em órgãos periféricos (onde o tumor primário e/ou lesões metastáticas podem residir) e órgãos linfóides secundários (que são frequentemente pesquisados durante estudos imunoterapêuticos para avaliar mecanismos de ação). Avaliamos a frequência, expansão e apoptose de células T CD8 e CD4 (Foxp3neg) sistemicamente em ambos os órgãos linfóides e Periféricos. Consistente com relatórios anteriores do nosso grupo, embora não alterando significativamente a sua frequência global(Fig. 1-A), a imunoterapia anti-CD40 / IL-2 resultou numa expansão significativa do número total de células T CD8 nos spleens e gânglios linfáticos (Fig. 1b). De acordo com o aumento do número total de CD8, a frequência de células T CD8 que incorporaram bromodesoxiuridina (BrdU) in vivo foi significativamente expandida e a proporção de células apoptóticas, avaliada pela expressão extracelular do Anexo V, não foi significativamente diferente dos controlos (Fig. C-D). Em contraste, a frequência total das células CD4 T diminuiu e os números não se alteraram significativamente em comparação com os controlos nos mesmos órgãos (Fig. 1a-b). Enquanto as células T CD4 estavam se expandindo conforme avaliado pela incorporação de BrdU, uma proporção significativa delas também estavam passando por apoptose (Fig. 1c-d) resultando numa variação líquida não significativa dos números totais. Estes dados estavam de acordo com o que foi observado anteriormente . Quando avaliámos os órgãos não linfóides, incluindo pulmões e fígado, vimos tendências semelhantes nas células T CD4 e CD8, nomeadamente que as células T CD8 estavam a expandir-se e a sobreviver em todos os órgãos que as seguiam (Fig. 2a-B) enquanto que as células T CD4 (Foxp3neg) estavam a expandir-se e a passar simultaneamente pela apoptose numa extensão semelhante, resultando em alterações insignificantes tanto nas suas frequências como nos seus números (Fig. 2c-d) na periferia.
CD4 e células T CD8 têm respostas proliferativas e apoptóticas diferenciais a terapias imunoestimuladoras em órgãos linfóides. Os ratinhos foram tratados com imunoterapia anti-CD40 / IL-2 e avaliados relativamente a vários parâmetros imunológicos no dia 12 do tratamento em órgãos linfóides (baço ou LN). Percentagem (a) e número total (b) de células CD4 (Foxp3-ve) e CD8 T em órgãos linfóides. Percentagem de proliferação (c), avaliada pelo BrdU, e de células T CD4 (Foxp3-ve) e CD8 em órgãos linfóides, avaliada pela expressão do Anexo V da superfície. Estes dados são representativos de 2-5 experimentos independentes com 3 ratos por grupo. Os dados são apresentados como média ± SEM. Statistics were derived using ANOVA with Bonferroni’s post-test, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ns: P > 0.05
CD4 and CD8 T cells have differential proliferative and apoptotic responses to immunostimulatory therapies in peripheral organs. Os ratinhos foram tratados com imunoterapia anti-CD40 / IL-2 e avaliados relativamente a vários parâmetros imunológicos no dia 12 do tratamento em órgãos periféricos (pulmões ou fígado). Percentagem (a) e número total (b) de células CD4 (Foxp3-ve) e CD8 T em órgãos periféricos. Percentagem de proliferação (c), avaliada com BrdU, e de células T CD4 (Foxp3-ve) e CD8 em órgãos periféricos, avaliada com base na expressão do Anexo V da superfície. Estes dados são representativos de 2-3 experimentos independentes com 3 ratos por grupo. Os dados são apresentados como média ± SEM. Statistics were derived using ANOVA with Bonferroni’s post-test, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ns: P > 0.05
célula T de memória fenótipos variar entre órgãos linfóides secundários e periféricos não-tecidos linfóides em células T CD8, mas não células T CD4 seguinte
Em ratos, CD4 e CD8, as células T podem ser categorizadas em memória e ingênua fenótipos com base em CD62L (L-selectina) e CD44 expressão com o CD44lowCD62L+ população considerada ingênua (TN), CD44highCD62L+ população considerada memória central (TCM), e o CD44highCD62Lneg população considerada efetoras e/ou efetoras de memória (TE/EM). Sabe-se que as células T CD4 e CD8 diferem na sua distribuição destes subconjuntos em órgãos linfóides e Periféricos. Enquanto frequências ingênuas dentro das populações CD4 e CD8 permanecem relativamente semelhantes, a população CD44high é mais memória central distorcida em células T CD8 e memória efetora distorcida em células T CD4 em um organismo em repouso . No entanto, nos órgãos periféricos, as células T residentes nos tecidos dentro dos subconjuntos das células T CD4 e CD8 são predominantemente do fenótipo da memória efectora .estudos anteriores demonstraram que as células do fenótipo da memória (CD44high) são o principal tipo de célula que se expande após imunoterapias estimuladoras . Para melhor compreender a composição das células T CD4 e CD8 em vários órgãos, avaliamos o estado de fenótipo da memória em cada órgão que a segue. Em repouso, a população CD44high de células T CD8 nos órgãos linfóides era predominantemente TCM (>90%) enquanto que nos órgãos periféricos, era uma combinação com ~60% TCM (Fig. 3a, c, E, – f). Em geral, resulta numa expansão global da frequência CD44high em todos os órgãos. As frequências TCM foram inalteradas ou ligeiramente aumentadas, enquanto as populações TE/EM expandiram-se significativamente (Fig. 3e-f) de ~10% a 30% nos órgãos linfóides e, de forma impressionante, de ~30-85% nos órgãos periféricos.
t o fenótipo da memória celular difere nos órgãos linfóides e periféricos após imunoterapia. Os ratinhos foram tratados com imunoterapia anti-CD40 / IL-2 e avaliados relativamente a vários parâmetros imunológicos no dia 12 do tratamento em órgãos linfóides (baço ou LN) ou periféricos (pulmões ou fígado). gráficos de pontos representativos A-b das células CD44 vs cd62l de expressão em CD8 (a) e CD4 (Foxp3-ve) (B) de células T no controlo e em ratos tratados com TI. gráficos circulares C-d representando a memória central (branca) vs a frequência da memória efectora (negra) na sub-população CD44high nas células T CD8 (C) e nas células T CD4 (d); frequências de CD44high representadas nas fatias pie para uma dada população. (E-f) frequência da memória efectora/efectora (e) e da memória central (F) CD8 (painéis da esquerda) e CD4 (Foxp3-ve) (painéis da direita) células T em vários órgãos de ratos tratados com controlo ou anti-CD40/IL2. Estes dados são representativos de 4-5 experiências independentes com 3 ratos por grupo. Os dados são apresentados como média ± SEM
dentro da população CD44high das células T CD4, os ratinhos em repouso foram mais fortemente inclinados para o fenótipo TE / EM com aproximadamente 60-70% no linfóide e 75-95% nos tecidos periféricos (Fig. 3b, d). Tal como ocorreu nas células T CD8, a seguir a proporção CD44high expandiu-se, mas devido ao facto de ter sido tão fortemente inclinada para o fenótipo TE/EM em em todos os órgãos em ratos em repouso, as frequências de CD4 TE/EM foram em grande parte consistentes em todos os órgãos em ratos tratados com IT (Fig. 3e). As frequências TCM CD4 permaneceram relativamente baixas e consistentes em todos os órgãos, tanto pré-como pós-TI(Fig. 3f).
A expressão de marcadores de ativação em células T CD4 e CD8 é dependente da localização e fenótipo de memória
além de diferenças na proliferação e apoptose, também temos notado rotineiramente que as células T CD4 e CD8 diferem de ativação e moléculas inibitórias após ela. O exemplo mais notável de PD-1, que, com base em estudos com foco em órgãos linfóides secundários (baço e LN), foi preferencialmente upregulated no CD4 e não células T CD8 e pensei que, provavelmente, ser envolvidos na preferencial AICD processo que ocorreu em CD4, mas não células T CD8 a seguir . Outro exemplo seria a regulação preferencial de NKG2D nas células T CD8, mas não CD4, conferindo capacidade lítica induzida por espectador após uma forte exposição à citoquina no subconjunto de memória CD8. Estudos anteriores do nosso laboratório, bem como dados apresentados na Fig. 3 têm mostrado que entre as células T CD4 e CD8, as células primárias que proliferam ativamente e respondem a ela são as células fenótipo de memória CD44high . Portanto, em seguida, nos concentramos nesta população.
No CD44high população, tem sido demonstrado que a proliferação de células T CD8 falhar para regular marcadores consistentes com a ativação por um antígeno específico de estímulo, como CD25 e PD-1, ainda upregulate marcadores que lhes permite adquirir um espectador fenótipo, nomeadamente NKG2D, conferindo-lhe a capacidade de agir mais de uma NK-como, antígeno de modo inadequado. Inversamente, as células CD44HIGH, proliferando (Foxp3neg) CD4 T elevam desproporcionalmente as células PD-1 (em contraste com as células CD8 T e Foxp3+, células CD4 T regulamentares), O que sugerimos permite que elas sejam preferencialmente direcionadas para a indução de apoptose . De acordo com estes relatórios anteriores, observaram-se fenótipos semelhantes entre as células CD44highCD8+ T do esplénico e dos gânglios linfáticos, tratados com IT, o que aumentou significativamente a regulação do NKG2D mas não da PD-1 (Fig. 4A, c), e cd44highcd4+ T células, que robustly upregulated PD-1, ainda não NKG2D (Fig. 4b, d). Quando avaliamos os mesmos marcadores fenotípicos nas populações de células T residentes nos órgãos periféricos não linfóides, o fenótipo das células T CD44highCD8+ foi consideravelmente diferente do dos residentes nos órgãos linfóides secundários. Enquanto as células T CD44highCD8 + residentes nos pulmões e no fígado ainda eram NKG2D + CD25neg (Fig. 4a, c), a frequência das células NKG2D+ nesta população pareceu aumentar de 20-30% nos órgãos linfóides para 40-50% nos órgãos periféricos (Fig. 4a). Além disso, ao contrário dos órgãos linfóides em que a expressão PD-1 se manteve inalterada, a expressão PD-1 aumentou significativamente tanto nos pulmões como no fígado, seguindo-a na população CD44highCD8+ (Fig. 4c). Por outro lado, o fenótipo das células T CD44highCD4 foi notavelmente semelhante às células T CD4 do baço e dos gânglios linfáticos em todos os órgãos (Fig. 4B, d) com expressão comparável de PD-1, e um upregulation mínimo de NKG2D. CD25 não foi upregulado em células CD4 ou CD8 T em qualquer local (Dados não mostrados). Isto foi inesperado Porque já sugerimos anteriormente que a expressão diferencial de PD-1 era provavelmente o mecanismo subjacente da indução diferencial da apoptose entre as células T CD4 e CD8 após regimes it imunoestimulatórios fortes. No entanto, nos órgãos periféricos, as células T CD4 continuam a ser desproporcionalmente afetadas pela apoptose, apesar do fato de que a expressão PD-1 é comparável entre as células T CD4 e CD8. Este padrão que surgiu também foi interessante porque a maior expressão de marcador de ativação na periferia parecia estar diretamente correlacionada com a predominância TE / EM, particularmente no caso de PD-1.
expressão diferencial de activação e marcadores inibitórios nas células T CD8 dependendo da localização. Os ratinhos foram tratados com imunoterapia anti-CD40 / IL-2 e avaliados relativamente a vários parâmetros imunológicos no dia 12 do tratamento em órgãos linfóides (baço ou LN) ou periféricos (pulmões ou fígado). Percentagem de células NKG2D+ (A-b) e PD-1+ (c-d) de CD8 (A, c) e CD4 (Foxp3-ve) (B, d) T em vários órgãos. Grafos Pie representando CD8 EM/CM de cada órgão sob determinadas condições de tratamento / órgão. Estes dados são representativos de 2-4 experimentos independentes com 3 ratos por grupo. Os dados são apresentados como média ± SEM. As estatísticas foram derivadas usando ANOVA com o pós-teste de Bonferroni, * P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001
recentemente, foi mostrado que circulam TE/EM células expressam elevados níveis de PD-1 em repouso humanos . Portanto, nós hipotetizamos que as células CD8+ TE/EM podem estar preferencialmente expressando estes marcadores de ativação sobre CD8+ TCM resultando em frequências diferenciais de células CD44highCD8+ t expressando marcadores de ativação em órgãos secundários linfóides e periféricos que a seguem. Portanto, avaliamos a expressão NKG2D e PD – 1 em CD8 + Cd44highd25neg e células TCM em todos os órgãos em ratos em repouso e tratados com TI. Em ratos de controlo, ambos NKG2D (Fig. 5a) e PD-1 (Fig. 5c) foram expressos com maior frequência no subconjunto TE/EM da população CD8+Cd44highc25. No entanto, a frequência global da população de TE/EM entre as células CD8+ T em ratinhos em repouso é relativamente baixa em comparação com a TCM (pie charts Fig. 5a), portanto, em geral a expressão de PD – 1 e NKG2D é predominantemente baixa (Fig. 4) como TCM compõe a maioria das células T CD8+ em repouso. No ratinho tratado com imunoterapia, tanto a expressão NKG2D como a expressão PD-1 aumentaram em todos os órgãos (Fig. 4). Mais uma vez, ambos NKG2D (Fig. 5b) e PD – 1 (Fig. 5d) foram expressos mais fortemente nas células TE / EM CD8+ T do que nas células TCM CD8+ T. Nos órgãos linfóides, onde a população TE/EM se expandiu em comparação com o Controle, ainda era significativamente menor do que as células CD8+ TCM (gráficos de torta, Fig. 5b) resultando em Expansões menos significativas nestes locais. Ao contrário dos órgãos linfóides, as células CD8+ TE/em constituíam a maioria dos órgãos periféricos assentados (gráficos circulares, Fig. 5b) tornando assim a expressão global de NKG2D e PD-1 significativamente mais elevada nestes locais. Mais uma vez, é importante notar que nos órgãos linfóides dos ratinhos tratados com imunoterapia, a expressão geral de ambos os marcadores de activação foi significativamente mais baixa do que nos órgãos periféricos devido à derrapagem do TCM nos linfáticos na periferia da população CD8. Os níveis de expressão não variam muito entre TE/EM, a partir de diferentes órgãos (não houve diferenças significativas entre linfóides periféricos órgãos) dentro de um mesmo grupos de tratamento, mas não fez, geralmente, aumentar os tratados comparados ao grupo de controle, uma tendência que foi significativamente mais pronunciado com NKG2D de PD-1 (Fig. 5). Em contraste, a expressão marcador de ativação TCM permaneceu relativamente constante não apenas entre os órgãos de ratos dentro de um grupo de tratamento, mas também entre os grupos de controle e it tratados (Fig. 5a-b). Em conjunto, estes dados sugerem que a Constituição da memória/Conjunto ativado (TCM vs TE/EM) pesa muito sobre o fenótipo da população de células T ativadas, particularmente com as células T CD8 como sua constituição varia muito entre os órgãos linfóides e não-linfóides.
Diferencial fenótipos de células T CD8 por localização correlaciona-se com maior expansão e ativação marcador upregulation no efetor/efetoras de memória T fenótipo de célula. Os ratinhos foram tratados com imunoterapia anti-CD40 / IL-2 e avaliados relativamente a vários parâmetros imunológicos no dia 12 do tratamento em órgãos linfóides (baço ou LN) ou periféricos (pulmões ou fígado). Frequências de nkg2d+ (A-b) e PD-1+ (c-d) em células CD25negCD44highCD8+ T em controlo (a, c) e ratinhos anti-CD40/IL-2 (b, d) tratados como estratificados por TCM (CD62L+, brancos) e TE/EM (CD62L-, Negros). Estes dados são representativos de 2-3 experimentos independentes com 3 ratos por grupo. Os dados são apresentados como média ± SEM. As estatísticas foram derivadas usando ANOVA com o pós-teste de Bonferroni, * P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001
Avaliação de células T dos pacientes que recebem alta dose sistêmica imunoestimulatórios terapia
a Próxima queríamos avaliar se esses resultados traduzidos em pacientes humanos receber imunoestimulatórios terapias para o cancro. Atualmente não existem ensaios de avaliação de combinação agonísticos anti-CD40 com recombinante humana IL-2 no entanto, temos rotineiramente comparado a nossa terapia de combinação para outros sistêmica imunoestimulatórios tratamentos, incluindo altas doses de TLR agonistas e alta dose sistêmica de citocinas terapias e mostrado semelhante fenotípica e funcional de alterações de células T, como são observados em nosso modelo pré-clínico . Para avaliar se os doentes na clínica apresentaram alterações semelhantes na expressão do marcador de superfície, recolhemos células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de doentes com melanoma metastático submetidos a terapêutica sistémica de dose elevada IL-2. Os doentes receberam 6×10^5 UI/Kg a cada 8 H para um total planeado de 14 doses. As amostras de CPSP foram colhidas um dia antes do início do tratamento (linha de base) ou no dia 8 do primeiro ciclo de tratamento (dia 8) para avaliar o fenótipo das células T. Comparando as amostras basais e do dia 8, verificou-se um aumento significativo das células PD-1+ do fenótipo da memória (CD45RO+) nos subconjuntos das células T CD4 e CD8 após a terapêutica com doses elevadas de IL-2 (Fig. 6a-c). Quando esta população foi dividida em memória central (CD62L+) e efetor/efetoras de memória (CD62L-) no dia 8 de tempo, o efetor/efetoras de memória subconjunto expressa significativamente maior PD-1 de expressão do que a memória central subconjunto (Fig. 6d-e). Em conjunto, estes dados estão correlacionados com o que foi observado em estudos murinos sugerindo que estes dados são aplicáveis a estudos em seres humanos e podem ser um indicador do que está ocorrendo localmente.
Efetor/efetoras de memória de células T humano de células T submetidos a IL-2 terapia express upregulated PD-1. As CPSP foram isoladas antes da terapêutica e no dia 8 do tratamento de doentes submetidos a terapêutica sistémica com doses elevadas IL-2 para o melanoma. As CPSP foram avaliadas para a expressão do subconjunto de células T de PD-1 por citometria de fluxo. uma estratégia de coloração representativa das CPSP humanas. frequência b-c da expressão PD-1 nas células CD4 (b) e CD8 (C) T. (d-e) frequência da expressão PD-1 nos subconjuntos de memória (CD45RO + CD62L+) e memória efectora (CD45RO + CD62L-) das células T CD4 (d) e CD8 (e). Foram incluídas neste conjunto de dados seis amostras de doentes. Os dados são apresentados como média ± SEM. As estatísticas foram obtidas utilizando o teste T de Student, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001
