as crbn de forma eficiente é degradada pela BVS-as crbn heterodimerizing PROTACs

PROTAC tecnologia utiliza E3 ligases para destruir o alvo proteínas. Assim, nos perguntamos se um ligase E3 em si pode ser ubiquitinado e degradado por outro ligase E3 se dois ligases E3 diferentes são colocados na proximidade. A degradação da VHL pode potencialmente ser substitutos da eritropoetina através da activação do HIF1a. Para projetar isso, conectamos pomalidomida, uma molécula de alvo CRBN, a VHL032, um ligando ligase VHL E3(Fig. 1A). O linker conectou o grupo amino da pomalidomida e o grupo acetilo terminal de VH032; uma vez que estas são regiões expostas ao solvente, uma conexão entre elas provavelmente não perturbaria sua ligação a cada ligase E3. For the synthesis of VHL-CRBN heterodimerizing PROTACs (Fig. 1B e Fig. suplementar. S1A), 4-fluorotalidomida (1) e VHL ligand (5) foram preparados como anteriormente relatado33. 4-Fluorotalidomida (1) foi tratada com quatro linkers de amina (2) com um grupo éster terc-butílico na presença de n,n-diisopropiletilamina (DIPEA) no sulfóxido de dimetilo (DMSO) para formar um intermediário (3). A seguir deprotection de tert-butil grupo 3 por tratamento com trifluoroacetic ácido (TFA) em diclorometano (DCM), o ácido (4) foi, juntamente com a BVS ligante (5 ou 7), na presença de 1–1H-1,2,3-triazolopyridinium 3-óxido de hexafluorophosphate (HATU) e DIPEA para produzir o PROTACS (6), TD-158, TD-165, TD-343 e TD-487 (8).

após o tratamento com estes compostos, examinámos os níveis de VHL e CRBN através da análise Western blot. O tratamento com TD-158, TD-165 ou TD-343 causou uma diminuição dependente da concentração no nível de proteínas CRBN (Fig. 1C, Painel superior). Os níveis tanto da forma longa como da forma curta da VHL, no entanto, aumentaram, presumivelmente devido à estabilização pela interação química-proteína (Fig. 1C, painéis do meio superior e do meio inferior)34. No caso do tratamento com 10 µM TD-158, os níveis de CRBN foram restaurados; este efeito “gancho” é uma característica típica que ocorre no contexto da degradação proteica induzida por PROTAC de alta dose 9,35,36,37. No entanto, TD-487, um estereoisômero de TD-165, não conseguiu induzir a degradação CRBN(Fig. 1C). TD-343 possuía atividade relativamente fraca, implicando que a incorporação de oxigênio no linker inibe a atividade PROTAC. Uma análise quantitativa da reacção em cadeia da polimerase reversa (RT-PCR) indicou que a diminuição do nível de CRBN induzida por PROTACs heterodimerizantes da VHL-CRBN não resultou de alterações no mRNA (Figo suplementar. S1B). Os valores de concentração de degradação de 50% (DC50) e de degradação máxima (Dmax) foram medidos para todos os compostos sintetizados. Os valores calculados de DC50 e Dmax para TD-158 foram 44,5 nM e 97.1%, respectivamente, e os valores correspondentes para TD-165 foram de 20,4 nM e 99,6% (Fig. 1D e Fig. suplementar. S1D). The shorter linker-containing degrader TD-156 (DC50 = 100.6 nM, Dmax = 96.9%) displayed weaker activity compared with TD-165 (Supplementary Fig. S1C). TD-343 (DC50 = 367,8 nM, Dmax = 85,1%), com oxigênio incorporado no linker, levou à degradação ineficiente da CRBN. Para testar o efeito da ligação à talidomida, examinamos a degradação do CRBN por PROTACs heterodimerizantes VHL-CRBN com uma ligação diferente. TD-760 (DC50 = 367.7 nM, Dmax = 82%), com ácido glicólico ligação, e TD-033 (DC50 = 2546.1 nM), com uma ligação amida, exibiu reduzido as crbn degradação, enquanto que TD-759 (DC50 = 28.8 nM), com uma glicina ligação, apresentado uma potência semelhante à do TD-165. Para determinar se os níveis relativos de proteínas podem contribuir para esta degradação parcial de proteínas, tratámos células sobreexpressing VHL, CRBN, ou ambos com TD-158, e analisámos os níveis de CRBN e VHL. Em todos os casos, os níveis de CRBN foram reduzidos enquanto os níveis de VHL permaneceram semelhantes ou aumentados (Fig. 1E). Em experimentos de tempo-curso, TD-158 degradou CRBN em mais de 80% dentro de 3 h e completamente degradou após 12 h (Fig. 1F). A degradação crbn induzida pelo TD-158 também foi observada em várias linhas celulares humanas (Fig suplementar. S2A-D).

Degradação de as crbn pela BVS-as crbn heterodimerizing PROTACs é dependente CRL2VHL

Para verificar que as crbn degradação por TD-158 foi dependente da UPS ou Cullin-ANEL de hidrolase de ligases (CRL), testamos o bortezomib, um inibidor de proteassoma, e MLN4924, um neddylation inibidor. O Co-tratamento com TD-158 e bortezomib ou MLN4924 impediu a degradação da CRBN(Fig. 2A e Fig. suplementar. S3A). Como esperado, a formação da cadeia poli-ubiquitina aumentou acentuadamente na presença de TD-158 (Fig. 2B). Além disso, a redução da VHL por pequeno ARN interferente (siRNA) atenuou a degradação da CRBN induzida pelo TD-158 nas células HEK 293T (Fig. 2C). Em contraste, a expressão da VHL em células 786-o, uma linha celular de carcinoma renal deficiente em VHL, restaurou a degradação CRBN induzida por TD-158(Fig. 2D). Em linha com estes resultados, a queda mediada por siRNA de Cullin2, uma proteína de andaimes do complexo CRL2VHL, impediu a degradação crbn induzida por TD-158(Fig. 2E). Coletivamente, estes resultados indicam que a degradação de CRBN por PROTACs heterodimerizantes de VHL-CRBN é dependente do complexo CRL2VHL.

a degradação eficiente por PROTACs requer a formação de um complexo ternário com a proteína alvo e ligase9,38. Para testar isso, realizamos experimentos de co-imunoprecipitação. Descobrimos que o CRBN Co-immunoprescificou exogenamente a VHL endógena na presença de TD-158, mas não na sua ausência (Fig. 2F). Os experimentos de remoção do GST usando proteínas purificadas mostraram que o CRBN interagia diretamente com o complexo B/C de VHL-Elongin na presença de TD-158 (Fig. 2G). Além disso, a adição de excesso de pomalidomida ou ligando VHL inibiu a degradação CRBN induzida pelo TD-158 (Figo suplementar. S3B, C). Exogenamente expresso CRBN Y384/W386A (AA), Um mutante defeituoso ligante da pomalidomida 16, não foi degradado pelo TD-158 (Figo suplementar. S3D). Assim, estes dados sugerem que a formação de um complexo ternário entre CRBN, VHL, e TD-158 é um pré-requisito para a degradação CRBN.

A global proteomic analysis reveals that TD-158 induces degradation of CRBN

To examine the degradation of CRBN in an unbiased fashion, we performed a quantitative proteomic analysis. Para minimizar os efeitos secundários do as crbn degradação, nós tratamos células Jurkat, que expressa as crbn e IMiD neo substratos, com TD-158 ou DMSO (controle do veículo) por 12 h. As proteínas de cada amostra foram digeridas e a digestão peptídeos foram marcados para isobaric rotulagem acoplada à cromatografia líquida-espectrometria de massa em tandem. Esta análise identificou 7.148 proteínas contendo mais de três peptídeos únicos não redundantes (quadro suplementar S1). Apenas três proteínas-CRBN, CNIH1 e LMBRD2—cumpriam os critérios de um valor P = 0,05 e mais de 1,5 vezes. Entre eles, CRBN foi a única proteína que mudou por mais de 2 vezes (Fig. 3A). No entanto, os níveis de outros componentes de CRL4CRBN complexos (CUL4A, CUL4B, DDB1, e RBX1) e CRL2VHL complexos (elongin C , elongin B , CUL2, e RBX1) permaneceu inalterada (Fig. 3B, C). Curiosamente, os níveis de neo-substratos de IMiDs anteriormente relatados, incluindo IKZF1, IKZF3, ZFP91, ZNF276 e ZNF653, não foram alterados com o tratamento TD-158 (Fig. 3B)39,40,41. Estes resultados foram confirmados por imunoblotting em Jurkat e várias linhas celulares mieloma múltiplo(Fig. Figo 3D e suplementar. S2A-D).

as crbn degradação pela BVS-as crbn heterodimerizing PROTACs recapitula a uma as crbn deficiência

Um substrato endógeno de CRL4CRBN é a glutamina sintetase GLUL, que é uma enzima-chave na biogênese de glutamina. A acetiltransferase CBP / p300 acetila dois resíduos de lisina N-terminal de GLUL em condições de níveis elevados de glutamina, e a colagem acetilada resultante é capturada e ubiquitinada pela CRL4CRBN e subsequentemente removida por proteasomes22. Para examinar o efeito do TD-158 sobre os níveis de GLUL, nós starved células Hep3B de glutamina para 48 h e, em seguida, reabastecido glutamina na presença ou ausência de TD-158. O TD-158 induziu a degradação da CRBN, independentemente do estado da glutamina, e os níveis de GLUL diminuíram mais lentamente ao longo do tempo na presença de TD-158 do que na sua ausência (Fig. 4A, B). Além disso, os ensaios de ubiquitinação in vivo demonstraram que a ubiquitinação do GLUL diminuiu na presença de TD-158 (Fig. 4C). Também investigamos se o tratamento TD-165 confere resistência Celular À IMiD. Dois IMiD sensível linhas de células, WSU-DLCL2 e RPMI8226, foram pré-tratados com TD-165 ou DMSO por 24 h e, em seguida, tratados com pomalidomide, TD-165, ou ambos, para 3 d. O pré-tratamento com TD-165 reduzido o anti-proliferativa efeitos de pomalidomide em ambas as linhas de células (Fig. 4D, E). Em conjunto, estes dados indicam que a degradação do CRBN por heterodimerização VHL-CRBN PROTACs recapitula uma deficiência do CRBN.

Para investigar os efeitos in vivo da BVS-as crbn heterodimerizing PROTACs, procurou-se determinar se TD-165 pode induzir as crbn degradação em modelos animais. Embora não sejam conservados resíduos de aminoácidos na CRBN (mCRBN) do rato importantes para a teratogenicidade, a mCRBN foi claramente degradada, embora em menor grau, pela TD-165 em fibroblastos embrionários do rato (Figo suplementar. S4A). Em seguida, administramos TD-165 intraperitonealmente a ratos para determinar se TD-165 induz degradação CRBN in vivo. No entanto, os níveis de CRBN não foram alterados no baço, células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), ou fígado (Fig. suplementar. S4B). Dado que a farmacocinética do TD-165 é razoável (quadro suplementar S2), esta ausência de efeito pode ser atribuída à elevada ligação às proteínas plasmáticas (99, 9%) do TD-165 (quadro suplementar S3).

N-terminal truncado as crbn não é degradada pela BVS-as crbn heterodimerizing PROTACs

Para determinar que o domínio de as crbn é importante para a TD-165–mediada as crbn degradação, geramos uma série de as crbn exclusão mutantes (D1–D4), conforme representado na Fig. 5A. as células que exprimem a CRBN inteira ou os mutantes de deleção individual foram tratadas com DMSO ou TD-165, e os lisados celulares foram examinados para degradação após o tratamento TD-165. Surpreendentemente, nenhum dos quatro mutantes de supressão CRBN foram degradados por TD-165, enquanto CRBN de comprimento completo foi eficientemente degradado(Fig. 5B). Notavelmente, os níveis de VHL foram ligeiramente elevados, presumivelmente devido à estabilização da interação química-proteína na presença de TD-165, mas não alterados pela expressão de mutantes crbn truncados na presença de TD-165 (Fig. 5B). Uma possível explicação para isso seria a incapacidade de excluir mutantes para formar um complexo ternário. No entanto, o mutante D1 formou um complexo ternário com TD-165 e VHL(Fig. 5C), e a ubiquitinação de D1 aumentou na presença de TD-165 (Fig. 5D). Nós então hipotetizamos que os resíduos de lisina amino-terminal de CRBN são necessários para a ubiquitinação. Para testar esta ideia, substituímos todos os três resíduos de lisina dentro do n-terminus de CRBN (a. a. 1-80) com arginina, individualmente e em combinação, e, em seguida, examinamos lisados celulares para degradação CRBN. TD-158 degradou eficientemente todos os mutantes na mesma medida que o crbn de tipo selvagem (Fig. 5E), indicando que os três resíduos de lisina no N-terminal de CRBN não são necessários para a degradação induzida por PROTACs heterodimerizantes VHL-CRBN.

a região desordenada da proteína alvo é necessária para uma degradação eficiente induzida por PROTAC

procurámos em seguida determinar as diferenças estruturais entre a CRBN de comprimento total e o mutante de deleção CRBN D1. O n-terminus do CRBN (a. a. a. 1-80) era previsto para conter uma região desdobrada ou intrinsecamente desordenada, com base em uma análise IUPred2A (Fig suplementar. S5A). Esta região desordenada (A. A. 1-48) era, de facto, indiscernível na estrutura cristalina do CRL4CRBN devido à sua flexibilidade (entrada no ao; 6BN7). Tem sido demonstrado que a região intrinsecamente desordenada é um dos principais componentes do degron proteasomal e atua como o iniciador para proteolysis proteasomal25. Alternativamente, no caso de proteínas globulares sem uma região desordenada, o complexo de proteínas contendo P97/valosina (p97/VCP) pode desdobrar a estrutura secundária, facilitando a degradação proteosómica das proteínas. Para examinar a relação entre a degradação proteica induzida pelo PROTAC e o complexo p97/VCP, testámos o efeito da N2,N4-dibenzilquinazolina-2,4-diamina (DBeQ), um inibidor p97/VCP, na degradação da CRBN induzida pelo TD-165. Estes experimentos mostraram que a degradação do CRBN não foi influenciada pelo tratamento do DBeQ (Fig. 6A). Os níveis de transcript 3 (DDIT-3; CHOP) e LC-3II lipidados, utilizados como controlos positivos, foram elevados após o tratamento com DBeQ. Knockdown of p97 by siRNA or DBeQ treatment impaiued ERAD and autophagy pathways, leading to upregulation of CHOP, a well-established UPR marker, and accumulation of LC-3II, a representative autophagy marker, respectively(Fig. 6a) 42. Portanto, para investigar se a região desordenada da CRBN facilita a degradação proteosómica induzida pelo PROTAC, ligamos a região desordenada (a. a. 1-80) dos mutantes CRBN a D2, D3 e D4 e examinamos as proteínas quiméricas para degradação. Todas as proteínas quiméricas, especialmente a quimera D4, foram degradadas por TD-165 de forma dependente da concentração (Fig. 6B). No entanto, a introdução de uma região desordenada da CRBN ao terminal N ou C da VHL não induziu a degradação da proteína de fusão (Fig. 6C), indicando que a ligação da região desordenada não é suficiente para todas as proteínas visadas. Para estender essa ideia à degradação induzida por outros PROTACs, testamos ARCC4, um receptor de andrógeno (AR) PROTAC43, já que AR também abriga uma região desdobrada no n-terminus (A. A. 1-330), conforme determinado usando a ferramenta de análise IUPred2A (suplementar Fig. S5B). Após o tratamento com ARCC4, AR sem a região desordenada de N-terminal (ΔN330) foi degradada menos eficientemente do que a AR de comprimento total. Curiosamente, o apego da região desordenada de CRBN (a. a. 1-80)a ar ΔN330 aumentou a eficiência de degradação (Fig. 6D e Figo suplementar. S5C). De acordo com isso, o apego da região desordenada da AR (a. a. 1-170)à mutante CRBN D1 também promoveu a proteólise por TD-165 (Fig. 6e e Figo suplementar. S5D).

Para mais reforçar estas conclusões, foram selecionados PROTACs com alta potência (DC50 < 1 µM), com base em uma pesquisa bibliográfica e, em seguida, analisou-los para uma intrinsecamente desordenado região usando o IUPred2A ferramenta. Curiosamente, dois terços dos selecionados PROTAC alvo proteínas foram encontradas possuir um desordenado região de mais de 40 aminoácidos, ou em um de seus termini ou internamente (Tabela 1)44, embora a sequência de aminoácidos baseados em predição da desordenadas ou não estruturados regiões não tomar outros fatores, tais como a proteína-proteína de interação ou modificações pós-traducionais, em consideration44,45,46. De acordo com isso, o VHL-Homo-PROTAC tem sido mostrado para induzir a degradação da forma longa do VHL, que alberga uma região desordenada em seu n-terminus, mas não o VHL short form47. Assim, isto apoia a nossa ideia de que a região desordenada das proteínas alvo é necessária para uma degradação eficiente por parte dos PROTACs.