Resultados e Discussão

Em sistemas de mamíferos, Cdc42 atividade tem se mostrado importante na regulação da pele-tronco/progenitoras diferenciação celular em células do folículo piloso, controlando neuroepithelial-tronco/progenitoras polaridade e cerebral hemisférica de bifurcação, e a regulação do número de células e o crescimento durante o período perinatal período de desenvolvimento (6-9). Curiosamente, um exame da atividade Cdc42 em ratinhos adultos WT de várias idades revela que o nível relativo Cdc42-GTP de animais mais velhos é significativamente maior do que o dos mais jovens em diversos tecidos, incluindo coração, cérebro, pulmão, fígado, medula óssea, baço e rim (Fig. 1 A e dados não apresentados), aumentando a possibilidade de aumento da atividade Cdc42 estar envolvida no processo normal de envelhecimento.

para determinar se o aumento da actividade Cdc42 associada ao envelhecimento natural pode ter relevância fisiológica, examinámos o regulador negativo Cdc42, Cdc42GAP, em ratos com alvos genéticos após terem atingido a idade adulta. Estudos anteriores mostram que os homozigotos Cdc42GAP nocaute ratos durante o período perinatal indicou que vários tecidos/células contidas elevados Cdc42-GTP, e os embriões/recém-nascido filhotes de Cdc42GAP −/− genótipo apresentado reduzido órgão/organismal tamanho que estão relacionadas com o aumento espontâneo de apoptose em vários tipos de células (6). Em ratos adultos Cdc42GAP−/− ratinhos, a actividade Cdc42 foi constitucionalmente mais elevada em vários tipos de tecidos/células do que nos ratinhos WT correspondentes, enquanto que o nível de RhoA-GTP ou Rac1-GTP permaneceu semelhante ao de WT (Fig. 1 B; dados não apresentados), sugerindo uma actividade específica de ganho de Cdc42 nos animais adultos semelhante à do período perinatal. A maioria dos ratos Cdc42GAP−/− morreu durante o período neonatal devido ao seu tamanho menor e físico fraco (6). No entanto, uma proporção deles (cerca de 7%) poderia sobreviver ao período neonatal sob cuidados de adoção por mulheres educadoras não relacionadas. Apesar de regular, ingestão de leite e de soro normal de glicose e de insulina, as concentrações encontradas no homozigotos ratos no período pós-natal , o ganho de peso de Cdc42GAP−/− ratos começaram a desacelerar, no ≈3 meses de idade, em comparação com aproximadamente 5 meses de idade, para WT ou heterozigótico ratos, e o maduro homozygotes foram ≈30% de redução no peso corporal devido a uma diminuição global cellularity (Fig. 1 C e dados não apresentados). O tempo de vida médio dos ratos Cdc42GAP −/− foi de cerca de 12 meses, enquanto que os ratos controlo (WT ou heterozigous) permaneceram vitais até uma idade média de cerca de 27 meses (Fig. 1 D). A curva de sobrevivência dos ratos homozigóticos é um pouco diferente da típica curva de Gompertz, mas é semelhante aos relatados para os animais transgênicos (11). A cifose e a falta de vigor em ratos Cdc42GAP−/− tornaram-se evidentes com a idade de cerca de 12 meses (Fig. 1 E). Os ratinhos Cdc42GAP−/− esfolados aos 15 meses de idade mostraram uma redução clara da massa corporal, uma perda substancial de tecido adiposo subdérmico, lordokifose grave e atrofia muscular (os dados não demonstraram). Um exame de raio-x mostrou um fenótipo significativo de cifose e uma densidade mineral óssea reduzida (DMO) em ratos Cdc42GAP−/− ratinhos com 15 meses de idade (Fig. 1 F). Uma quantificação adicional dos ossos dissecados do Cdc42GAP−/− ratinhos revelou reduções da DMO 3 e 2, 6 vezes na tíbia e no fémur, respectivamente (SI Fig. 7). Além disso, tanto os ratos macho como fêmea Cdc42GAP−/− perderam a fertilidade numa idade mais precoce em comparação com A WT. No acasalamento entre fêmeas cdc42gap e machos WT, os homozigotos tornaram-se inférteis com 26 semanas de idade, em comparação com 48 semanas de idade para WT (Fig. 1 G). Estas observações indicam que a deficiência em Cdc42GAP resulta num nível constitucionalmente elevado de Cdc42-GTP, redução do tamanho corporal, cifose precoce, redução da DMO, redução do período de fertilidade e redução do tempo de vida em ratinhos adultos.

A He secções manchadas através do corpo vertebral fêmea de ratinho de 8 meses de idade mostraram que o Cdc42GAP- / -ratinhos tinha um córtex mais fino, com veios e trabeculas mais finas em comparação com ratos WT (Fig. 2 A). Do mesmo modo, as secções de longitude do fémur dos ratinhos homozigóticos mostraram uma redução da espessura óssea cortical em comparação com a dos ratinhos WT (dados não apresentados). Estas observações estão de acordo com a aparência grosseira e características clínicas da osteoporose. O baço, fígado, e rins de adultos Cdc42GAP−/− ratos foram reduzidos em massa devido a uma diminuição global cellularity, que ficou evidente na H&E manchada de seções do baço, e a T e células B-contendo polpa branca regiões de 12 meses Cdc42GAP−/− baço foram significativamente reduzidos se comparados com aqueles de idade que serve de camundongos WT (Fig. 2 B e dados não demonstrados), sugerindo atrofia linfóide pronunciada nos homozigotos. Consistente com a redução aparente do tecido adiposo subdérmico, a análise histológica das secções transversais da pele dorsal revelou uma ausência quase completa de células adiposas S. C. em ratos Cdc42GAP- / -ratinhos de 9 meses de idade (Fig. 2 C). Uma perda de massa muscular e atrofia muscular foi também confirmada pelo exame de Hsecções do músculo esquelético manchadas com corante em ratos Cdc42GAP-/-ratinhos com idade igualada (Fig. 2 C). O Cdc42GAP – / – mice também mostrou uma redução acentuada na regeneração do cabelo após a remoção do cabelo dorsal por barbear, enquanto o WT combinado com a idade e sexo exibia crescimento robusto do cabelo (Fig. 8). A capacidade de tolerar estresse, como cicatrização de feridas, uma atividade associada ao envelhecimento (12) do Cdc42GAP-/− ratinhos, foi significativamente reduzida em comparação com A WT (Fig. 2 D). A análise histopatológica das secções da ferida mostrou pouca reepitelialização no bordo da ferida do Cdc42GAP−/− ratinhos, enquanto que a reepitelização completa do Ratinho WT foi evidente 4 dias após a introdução da ferida (Fig. 2 E). Além dessas observações, um número de hematopoiéticas fenótipos dos homozigotos ratos, incluindo anemia, redução do baço e da medula óssea cellularities, defeitos de hematopoiéticas, células-tronco engraftment para a medula óssea, e aumento da sensibilidade hematopoiéticas, células-tronco induzidas mobilização (13, 14) foram consistentes com o envelhecimento precoce do sistema hematopoiético. Importante, um exame de ratinhos homozigóticos jovens (<4 meses de idade) antes da manifestação de fenótipos óbvios não revelou anomalias importantes no osso, pele e baço (Fig. 9 A E B e dados não mostrados), sugerindo que os fenótipos semelhantes ao envelhecimento do Cdc42GAP-/− mice não são devido a um transtorno de desenvolvimento precoce. Além disso, um certo número de fenotipos do Ratinho homozigótico, incluindo redução da espessura óssea cortical, cifose e perda de massa muscular e tecidos epidérmicos, podem ser encontrados no ratinho Velho (>2, 5 anos de idade) WT (Fig. 9 C E D e dados não apresentados). Como resumido na tabela 1 do SI, coletivamente estes resultados fornecem fortes evidências de que a deficiência de Cdc42GAP causa fenótipos prematuros nos animais.Fig. 2.

Cdc42GAP−/− ratinhos apresentam fenótipos prematuros em vários tecidos. A) He secções de corpos vertebrais femininos homozigóticos ou de ratos WT de 8 meses de idade. O Cdc42GAP – / – mouse mostra um córtex fino, curvado e trabeculae fino em contraste com o mouse WT. B) H&e secções de folhas de ratos fêmeas de 12 meses de idade. O ratinho com deficiência em Cdc42GAP apresenta uma diminuição do volume da polpa branca e da polpa vermelha do baço e folículos linfóides mais pequenos e uma diminuição dos glóbulos vermelhos nos sinusóides da polpa vermelha. C) he coloração de secções dorsais da ratinha de 9 meses de idade. No Cdc42GAP – / – mouse, a camada S. C. É completamente colapsada devido à perda de adipócitos, e a camada muscular mostra atrofia nas fibras musculares em comparação com o controle WT. Ep, epiderme; de, derme; sft, S. C. tecido adiposo; sm, músculo esquelético. D) capacidade de cicatrização de feridas em comparação com ratinhos fêmea de 8 meses de idade. E) H&e coloração de uma ferida cutânea 4 dias após a ferida. O WT mostra a epitelialização completa da ferida, enquanto não há fecho na ferida (indicado por asterisco) no rato com deficiência de Cdc42GAP. Os experimentos foram repetidos pelo menos duas vezes, e um conjunto de dados representativos é mostrado.

a Coloração dos tecidos de 9 meses de idade, os adultos, incluindo o fígado, rins e baço, por senescência associada a β-galactosidase (SA-β-gal) revelou uma forte actividade deste senescência marcador de homozigotos ratos que não foi detectado nos tecidos de idade e o sexo-correspondência de camundongos WT (Fig. 3 A E SI Fig. 10), indicando que os tecidos Cdc42GAP−/− adultos podem sofrer senescência prematura. Curiosamente, o aumento da apoptose dos tecidos homozigóticos observados durante o período perinatal esteve ausente nos homozigotos adultos quando a elevada actividade SA-β-gal foi evidente (ref. 6 e dados não apresentados). Cdc42GAP−/− mouse de fibroblastos embrionários (MEF) células, que contêm cerca de 3 vezes superior Cdc42-GTP mas normal Rac1-GTP ou RhoA-GTP conteúdo em comparação com WT MEF células (6), exibiram significativamente aumentada SA-β-gal atividade e acumulou uma achatada e ampliada senescent morfologia início na passagem 6 quando WT MEF células foram negativos para SA-β-gal atividade e foram contratuais na morfologia (Figs. 3 B E SI Fig. 11). As células Cdc42GAP−/ – MEF começaram a desacelerar no crescimento nas passagens 5-7, quando as células WT MEF correspondentes estavam crescendo exponencialmente (Fig. 3 C) (6), e eles passaram por uma senescência replicativa massiva após a passagem 7, enquanto a maioria das células WT MEF não chegou à senescência até a passagem 13 (SI Fig. 11 e dados não apresentados). Além disso, uma percentagem significativamente maior de células Cdc42GAP−/− MEF na passagem 7 formou focos maiores no núcleo do que as células WT (SI Fig. 12). Estes resultados indicam que a deficiência de Cdc42GAP induz a senescência precoce dos tecidos/células.Fig. 3.

Cdc42GAP – / – cells undergo early senescence and show increased genomic instability. (A E B) actividades SA-β-gal nas secções do baço de ratinhos fêmea de 9 meses (a) e de passagem-6 células MEF (B). As células MEF mutantes apresentam uma morfologia aumentada e achatada que está associada à coloração da β-galactosidase. C) As células MEF (passagem 4) foram replantadas com uma densidade de 1 × 106 por prato de cultura de 10 cm de 3 em 3 dias, e os tempos de duplicação da população foram derivados. D) perfis de propagação da metafase de 50 esplenócitos de fêmeas com 8 meses de idade WT e de ratos homozigóticos. E) as células MEF de passagem-6 foram submetidas a análise do cariótipo, e as anomalias cromossómicas estão resumidas. F) é apresentado um conjunto de imagens representativas das estruturas cromossómicas para ambos os genótipos. As pontas de flecha apontam para as quebras cromatídicas, asteriscos indicam fragmentos cromossômicos, e o sinal positivo indica uma fusão e reorganização complexa. G) As células MEF de passagem-7 foram manchadas com anticorpos anti-P-H2AX e DAPI para revelar núcleo celular e focos danificados pelo ADN. Três pares independentes de células MEF foram examinados, e os pares se comportaram da mesma forma.

um factor bem reconhecido que contribui para o envelhecimento prematuro e a senescência celular dos mamíferos é o aumento da instabilidade genómica (15). A análise da propagação da metafase mostrou que >30% dos esplenócitos primários de ratinhos homozigóticos de 8 meses de idade eram aneuploidas, enquanto que os esplenócitos WT combinados entre a idade e o sexo não apresentavam aneuploidia detectável (Fig. 3 D), indicando que o Cdc42GAP−/− tecido sofreu instabilidade genômica. Em apoio a esta descoberta, as células Cdc42GAP – / – MEF mostraram um aumento significativo de células de núcleos duplos sob coloração de DAPI em comparação com as células WT na passagem 7 (SI Fig. 12). Cariótipo a análise das passagens posteriores do MEF células (passagem 6-7) revelou ainda que, embora a maioria dos cromossomos de células WT (≈80%) manteve-se intacto, 42% dos Cdc42GAP−/− células contidas no mínimo uma aberração cromossômica, 20% continham dois ou mais aberrações, e 14% continham três ou mais aberrações (Fig. 3 E). A percentagem e o grau de aneuploidia também aumentaram significativamente nas células Cdc42GAP−/− MEF, com >32% das células com números cromossómicos anómalos variando entre 72 e 102, enquanto a maioria das células WT eram diplóides (Fig. 3 E E Si Fig. 13). A análise do cariótipo dos danos cromossômicos indica que as aberrações das células homozigóticas do MEF foram diversas, incluindo quebra cromatídica, separação prematura de cromatídeos irmãos (uma característica de um ponto de verificação defeituoso da montagem do fuso), translocação, quebras cromossômicas, cromossomo dicêntrico e fragmentação cromossômica (Fig. 3 F E SI Quadro 2), sugerindo que a máquina de reparação de danos ao ADN está comprometida nas células Cdc42GAP−/−. A coloração da imunofluorescência do fósforo-H2 AX no núcleo celular, um marcador de resposta a danos no ADN (16), mostra que, embora 10% da passagem das 7 células Cdc42GAP−/− MEF fossem positivas para o marcador de danos no ADN, <1% das células WT eram positivas (Fig. 3 G). A correlação entre o início e progressão dos fenótipos semelhantes ao envelhecimento do Cdc42GAP-/− mice e o grau e gravidade observados das aberrações genómicas nas células Cdc42GAP− / − suporta um papel de Cdc42 no desenvolvimento das características progeróides.

para determinar o possível mecanismo dos danos acumulados do ADN nas células Cdc42GAP−/−, comparámos o nível de espécies de oxigénio reactivas endógenas (ROS) das células homozigóticas com o das células WT, uma vez que Rac1 e Rac2, duas Rho GTPases estreitamente relacionadas, são reguladores conhecidos da ROS celular (17). Si Fig. 14 mostra que as células Cdc42GAP/ apresentaram uma actividade ROS semelhante à das células WT, indicando que o Cdc42GAP regula a estabilidade genómica através de um mecanismo endógeno independente Da ROS. Por causa das semelhanças de vários Cdc42GAP−/− mouse fenótipos que um número de gene alvo do mouse modelos de DNA de danos reparação de moléculas, incluindo o Brca1−/−p53+/−, Ku80−/−, e Mtr−/−Wrn modelos de mouse (12, 18, 19), temos mais sondou a capacidade de resposta dos primeiros passaged Cdc42GAP−/− células para vários danos ao DNA agentes. No ensaio de crescimento da resposta a danos no ADN, as células deficientes em Cdc42GAP mostraram um defeito largo da actividade de reparação de danos no ADN (Fig. 4), que se manifestou como significativamente mais elevadas percentagens de morte celular entre os homozigotos células, em comparação com WT células após o tratamento, aumentando as doses de H 2O2, irradiação ionizante, camptothecin, metil metano sulfonato de sódio, ou a mitomicina C. Assim, o acumulado de diversidade genômica anormalidades encontradas em passagens posteriores de Cdc42GAP−/− células podem ser atribuídas, pelo menos em parte, a deficiência de DNA de danos reparação de atividades.Fig. 4.

capacidade de reparação de danos no ADN diminuída das células MEF deficientes em Cdc42GAP após tratamento com vários agentes prejudiciais ao ADN. As células MEF das passagens precoces foram tratadas com as doses indicadas de IR, H2O2, camptotecina (CPT), sulfonato de metil-metano (MMS) ou mitomicina C (MMC), e os números de células sobreviventes em cada condição foram quantificados após 7 dias. As taxas de sobrevivência foram normalizadas para as células não tratadas.

uma consequência de danos genómicos persistentes nas células é a indução de múltiplos genes de resposta a danos do ADN e / ou de senescência (20, 21). A expressão de p53, p21Cip1, p16Ink4a, e phospho-p53 (Ser-15) em Cdc42GAP−/− MEF células foram significativamente maiores do que aqueles de WT MEF células, depois de passagens semelhantes, enquanto que p19ARF no homozigotos células apresentaram uma tendência semelhante de aumento de passagens, como as células WT (Fig. 5 A). Os níveis de proteína da p53, p21Cip1, p16Ink4a, phospho-p53 (Ser-15), e o dano ao DNA marcador phospho-H2 AX, em Cdc42GAP−/− tecidos a partir de 8 meses de idade, os ratos foram também significativamente maiores do que os correspondentes tecidos de correspondência de camundongos WT (Fig. 5 B). Estes resultados fornecem provas de que a activação da via regulamentada p53, p21Cip1 e p16Ink4a em particular, está associada à senescência precoce induzida pela deficiência de Cdc42GAP. Para examinar a questão de saber se elevados Cdc42 atividade no Cdc42GAP deficientes em células é suficiente para explicar o início da senescência fenótipo, manifestámos a ativação de um mutante de Cdc42, Cdc42F28L, em principal WT MEF células e testadas para o SA-β-gal a atividade das células, em comparação com a da correspondência de EGFP-expressão de células em diferentes passagens. A expressão Cdc42F28L causou um aumento significativo na população de células SA-β-gal positivas (35% nas células Cdc42F28L em comparação com 7% nas células expressoras de EGF) nas células MEF passadas precoces (Fig. 5 C), indicando que a activação do Cdc42 é suficiente para a indução da senescência precoce das células.Fig. 5. a senescência precoce das células Cdc42GAP – / – depende da actividade p53. Os lisatos proteicos (100 µg) das células MEF das passagens 3 e 6 (A) ou de diferentes tecidos de ratinhos de 8 meses de idade (B) foram imunoblotados com os respectivos anticorpos. (C) As células MEF do WT transduced with EGFP or Cdc42F28L/EGFP were stained for β-galactosidase activity at an early passage (passage 6) to reveal the senescent cell populations. D) Os tempos de duplicação da população de células MEF de vários genotipos nas passagens 4 a 9 foram medidos em cultura celular. E) as células MEF na passagem 7 foram manchadas com o marcador de senescência SA-β-gal para determinar as populações de células senescentes. F) Um modelo de funcionamento para um possível mecanismo de senescência induzida por deficiência do Cdc42GAP. O nocaute do Cdc42GAP causa uma atividade cdc42 constitucionalmente elevada, o que, por sua vez, diminui a capacidade de reparo de danos ao DNA. As anormalidades genômicas acumuladas resultantes dos danos não reparados estimulam uma resposta mediada por p53 que causa senescência replicativa.

para explorar mais a possibilidade de que o fenótipo de senescência das células Cdc42GAP−/− possa ser resgatado por um defeito p53, nós geramos Cdc42GAP+/−p53+/− ratinhos e tentamos preparar células MEF a partir do crossbred. De 44 embriões, seis com o genótipo Cdc42GAP−/−p53+/− e nenhum do genótipo Cdc42GAP−/−p53−/− foram obtidos. O Cdc42GAP−/−p53+/− MEF células cresceram a uma taxa entre p53+/− e WT células e mostrou basal senescent população comparável com a de p53+/− ou WT células de passagem de 7, enquanto que o p53−/− e Cdc42GAP−/− MEF células proliferam com uma curva linear e um bend-população dobrando a curva e foram senescência-resistente e senescência propensas semelhantes, passagens, respectivamente (Fig. 5 D E E). Estes resultados indicam que a senescência prematura induzida pela ativação do Cdc42 depende do p53.a limitada duração de vida das células e animais pode resultar da senescência replicativa em resposta a várias tensões, incluindo lesões no ADN (22), erosão telomérica (23), ROS (24) e/ou oncogenes inadequadamente activados (25). O Cdc42GAP – / – mice apresenta um modelo animal de actividade gain-of-Cdc42 que imita a activação Cdc42 induzida pelo sinal mitogénico (6) e permite uma avaliação dos possíveis efeitos da activação Cdc42 na fisiologia animal e celular. Demonstramos que a deficiência de Cdc42GAP causa o início precoce da senescência nas células e fenótipos prematuros no animal. Em particular, o objetivo do gene Cdc42GAP induz um aumento global da atividade do Cdc42 e promove a instabilidade genômica celular com reduzida capacidade de reparação de danos ao DNA, que por sua vez pode ativar p53 e p16 Ink4a, levando à senescência precoce (Fig. 5 F). Anteriormente, o Cdc42 foi activado em células senescentes para modular o ajuste morfológico (26). Também foi proposto envolver-se em alterações morfológicas celulares regulamentadas, apoptose e proliferação (27-29) e na apoptose controlada pela cinase c-Jun n (30, 31), eventos que têm sido associados com senescência celular e envelhecimento animal (32, 33). Nossas descobertas de que a ativação do Cdc42 está associada ao envelhecimento natural e que a deficiência do Cdc42GAP causa um defeito de reparo de danos no DNA para permitir que as células acumulem anormalidades genômicas que levam à senescência precoce sugerem ainda uma ligação funcional entre a atividade do Cdc42 e o envelhecimento dos mamíferos.demonstrou-se que a activação da via p53 ou a interrupção dos genes envolvidos na reparação de danos ao ADN ou na regulação da estabilidade genómica induzem o envelhecimento precoce em ratinhos.(11, 12, 33, 34). Consistente com observações anteriores de que o Cdc42 pode não estar envolvido na regulação das atividades de superóxido celular (17), descobrimos que os danos acumulados no DNA nas células Cdc42GAP−/− não está associado com a atividade ROS porque as células homozigóticas não mostram aumento da atividade ROS. A supressão do Cdc42GAP provoca uma redução acentuada da capacidade de reparação de danos do ADN num amplo espectro, incluindo respostas ao agente de ligação cruzada do ADN e ao indutor de ruptura de dupla cadeia ou de ruptura de uma cadeia única, sugerindo que a activação prolongada do Cdc42 pode diminuir a capacidade de reparação de danos do ADN. A diversidade dos danos genômicos encontrados nas células Cdc42GAP−/ – também é consistente com um impacto de um defeito de reparação de danos do DNA global. As questões importantes que permanecem por resolver incluem quais os determinantes moleculares específicos envolvidos na reparação de danos ao ADN regulada pelo Cdc42GAP e quais os sinais a montante que causam o aumento do Cdc42-GTP durante o processo de envelhecimento normal.