Abstract
Background. A expressão do CD133 humano (proeminina humana-1) em células cancerosas tem sido postulada como um marcador de stemness e é considerada como um marcador putativo de células estaminais cancerosas (CSCs). Desenhámos um estudo para descrever o padrão de expressão do CD133 na pele normal e em neoplasias cutâneas epiteliais. Meios. A expressão imunohistoquímica CD133 de 43 tumores de eccrina e apócrina foi comparada com a observada em outros tumores epiteliais da pele. Além disso, citometria de fluxo foi usada para detectar a expressão CD133 de quatro neoplasias epiteliais da pele, incluindo um porocarcinoma. Resultado. Foi observada imunoreactividade CD133 na superfície apical ou apicolateral das células que formam estruturas glandulares. As células de áreas sólidas de tumores benignos ou malignos não foram manchadas. As células de cultura derivadas do porocarcinoma mostraram 22% de células CD133 positivas usando citometria de fluxo, enquanto as culturas de carcinoma de células escamosas continham menos de 0,1%. Conclusao. Estas observações indicam que o CD133 é um marcador específico de diferenciação glandular que pode ser incluído no painel de diagnóstico de tumores cutâneos com possível diferenciação eccrina ou apócrina. No entanto, a utilização da expressão CD133 como marcador de CSCs deve ser interpretada com precaução em experiências de pele.
1. Introdução
nos últimos anos, um corpo crescente de evidências tem sido relatado apoiando a noção de que a capacidade de sustentar a formação e crescimento tumoral reside exclusivamente em uma pequena população de células chamadas células estaminais cancerosas (CSCs). A pesquisa de marcadores que demonstram o fenótipo tipo célula-tronco destas células iniciadoras de tumor é um campo de investigação ativo, e vários marcadores de células-tronco foram descritos recentemente em tumores de pele .
CD133 é o homólogo humano da proeminina-1 do rato, uma glicoproteína de superfície celular com cinco domínios transmembranares que recebeu atenção notável devido à sua expressão restrita a várias subpopulações de células estaminais somáticas . Este antigénio de superfície foi descoberto como alvo de um anticorpo monoclonal definido como Mab AC133, um marcador expresso por uma subpopulação de células estaminais hematopoiéticas CD34 positivas derivadas do fígado fetal humano e da medula óssea . Subsequentemente, o CD133 foi detectado em diferentes tecidos normais humanos, incluindo rim, próstata, cérebro e pâncreas, e verificou-se estar especificamente associado a microvilli e outras protusões da membrana plasmática . Além disso, este antigénio também foi identificado em neoplasias hematológicas e em várias neoplasias humanas sólidas, incluindo tumores gliais, carcinoma da próstata, carcinoma renal, hepatocarcinoma, carcinoma colorectal e melanoma maligno . O objetivo de muitos destes estudos foi determinar a existência de CSCs, definido como um pequeno grupo de células cancerosas que têm a capacidade de auto-renovação, iniciação do tumor, e manutenção do crescimento do tumor. Os anticorpos utilizados rotineiramente para a purificação de células AC133-positivas visam epítopos glicosilados mal caracterizados de especificidade incerta. Embora a actividade funcional do CD133 ainda seja controversa e a sua função fisiológica ainda não esteja determinada , está a tornar-se claro que esta proteína da superfície celular é um marcador único das saliências da membrana plasmática e dos micro-domínios de membrana . Tem sido sugerido que neste local celular CD133 pode atuar como um regulador da composição lipídica da membrana ou pode participar dos mecanismos de polaridade celular e migração .em estudos anteriores que relataram a coloração imunohistoquímica CD133 de epitélios glandulares humanos, tais como glândulas salivares, glândulas lacrimais, ductos pancreáticos, glândulas endocervicais e glândulas sudoríparas, foi descrito um padrão peculiar de expressão CD133 . Nestes epitélios, o CD133 mostrou ser localizado em protrusões de membrana plasmática nas áreas apicais das células polarizadas. Foi também observado um padrão semelhante de coloração citoplásmica apical CD133 de células que circundam um lúmen em carcinomas do ovário, cólon ou pâncreas .
a descoberta das células da glândula sudoríaca dos anticorpos CD133 levou-nos a conceber um estudo que agora reportamos, a fim de avaliar a expressão do CD133 em eccrina da pele e tumores apócrinos.2. Materiais e métodos
2.1. Cases
A retrospective search retrieved 43 previously diagnosticed skin eccrine and apocrine adnexal tumors from the files of the Department of Pathology of the Albacete University Hospital. Foram obtidas lâminas de vidro, blocos de parafina e relatórios histopatológicos de todos os casos. Slides were reviewed and adnexal skin tumors were diagnosed according to the criteria of the World Health Organization (WHO) classification , including eccrine spiradenoma (), nodular hidradenoma (), eccrine hidrocystoma (), poroma (), porocarcinoma (), syringocystadenoma papilliferum (), chondroid syringoma (), syringoma (), cylindroma (), hidradenoma papilliferum (), apocrine hidrocystoma (), microcystic adnexal carcinoma (), and apocrine carcinoma (). Foram também incluídos casos de carcinoma basocelular () e carcinoma de células escamosas () neste estudo para comparar os resultados obtidos nestas neoplasias com os obtidos em tumores da glândula sudorese. Para avaliar a expressão CD133 na pele normal, analisamos a pele de diferentes áreas obtidas a partir das margens de seis tumores cirurgicamente ressecados da pele e de três autópsias. para a cultura de células cancerígenas da pele, foram obtidas sete amostras de tumores de pele humana que correspondiam a um porocarcinoma de ecrina e seis carcinomas de células escamosas. O tecido fresco destes casos foi incluído no meio modificado da Águia de Dulbecco (DMEM), complementado com penicilina/estreptomicina e fungizona, imediatamente após a ressecção cirúrgica.
2, 2. Imunohistoquímica
formalina fixa, as secções de tecido embebido em parafina com 4 µm de largura foram cortadas, desparafinizadas em xileno e reidratadas numa série de etanol. A actividade endógena da peroxidase foi bloqueada com 3% de H2O2 durante 5 minutos. As lâminas foram tratadas com recuperação de epítopos induzida pelo calor e imunostenciadas com três anticorpos monoclonais anti-CD133 diferentes.: Anticorpo monoclonal AC133, anticorpo monoclonal 293C3 e anticorpo monoclonal AC141 (todos de Miltenyi Biotec, Alemanha). Os anticorpos foram testados em diferentes diluições e tempos de incubação. A detecção do CD133 foi efectuada utilizando o EnVision system-HRP (Dako, Glostrup, Dinamarca) numa plataforma de controlo automático de Dakocitomações, de acordo com as instruções do fabricante. Diaminobenzidina (sistema de substrato da DAB, Dako, Glostrup, Dinamarca) foi utilizada como cromogénio. Dos três anticorpos anti-CD133 diferentes testados, apenas um, o anticorpo monoclonal AC133, resultou em parafina. Os outros dois anticorpos testados falharam porque as secções incubadas com estes anticorpos não mostraram qualquer coloração ou porque a imunossupressão observada quando se utilizaram concentrações elevadas dos anticorpos foi considerada não específica (observou-se coloração semelhante nos controlos negativos). O anticorpo monoclonal AC133 deu resultados fiáveis nas secções incorporadas na parafina testadas. Estabelecemos para este anticorpo uma diluição de 1: 10 e 40 minutos de incubação à temperatura ambiente como as condições de trabalho preferidas. Posteriormente, todas as experiências foram realizadas nessas condições. secções da pele com glândulas sudoríparas normais foram utilizadas como controlos positivos. Além disso, quando presentes nas seções, glândulas sudoríparas normais da pele adjacente às neoplasias foram usadas como controles internos positivos. Os controlos negativos foram realizados omitindo o anticorpo anti-CD133 durante a incubação primária de anticorpos. a coloração imunohistoquímica de áreas sólidas e de estruturas acinares ou ductais dos tumores foi avaliada separadamente. A coloração CD133 foi classificada usando uma escala semiquantitativa. As estruturas acinares ou ductais foram avaliadas da seguinte forma: ( – ) sem manchas; (+) a coloração de secretora material no lúmen do isolado ductos ou ácinos e/ou fraca coloração dos apical ou luminal fronteira de alguns ductos ou ácinos; (++) limpar a coloração das apical ou luminal fronteira da maioria dos ductos ou ácinos presentes no tumor; (+++) a coloração das apical ou luminal fronteira de todos os ductos ou ácinos presente no tumor. A expressão CD133 foi avaliada por dois patologistas seniores (EP e SYNC) de forma cega, sem conhecimento de informação clínica e patológica. Em casos de avaliações discrepantes, as lâminas foram reavaliadas por ambos os patologistas sob um microscópio multi-cabeças, e um acordo foi obtido.
2, 3. A cultura de células cancerígenas a partir de tumores cutâneos
fragmentos de Tumor foi separada mecanicamente e enzimaticamente por digestão com colagenase tipo IA (2 mg/mL) (Gibco, Invitrogen) na solução salina equilibrada de Hank (HBSS) a 37°C durante 2 horas. As células foram filtradas através de uma malha de nylon de 40 µm e foram ainda dissociadas por passagem em Série através de pipetas serológicas. O tecido digerido foi centrifugado a 1000 × g durante 10 minutos e o sedimento lavado várias vezes para obter uma única suspensão celular. As células isoladas foram revestidas em frascos de cultura e cultivadas a 37 ° C em meio DMEM/F12 contendo 10% de soro fetal bovino e complementadas com penicilina/estreptomicina e fungizona.
2, 4. Análise da citometria de fluxo
todas as experiências foram realizadas em suspensões celulares preparadas na primeira passagem da cultura primária a partir de tumores. As células foram separadas utilizando EDTA a 0, 02% em solução salina tampão fosfato (PBS) durante 15 minutos a 37°C e lavadas com PBS antes da coloração. As suspensões celulares foram ajustadas às células / mL e incubadas com a diluição recomendada para anticorpos (1/10) durante 20 minutos no escuro (4°C). Foram utilizadas amostras sem anticorpos primários como controlos negativos. O anticorpo utilizado foi anti-CD133 / 1 (AC133)-APC (Miltenyi Biotec). Os anticorpos não ligados foram removidos por lavagem com PBS, e as células foram ressuspendidas num volume adequado de tampão. A análise foi realizada num citómetro de fluxo de LSRII (Biosciências BD). Os dados foram analisados usando o cume V5. 0. 1. 5170 software (Dako).
3. Resultados
3.1. Resultados clínicos
o grupo de doentes consistia em 29 homens e 23 mulheres, com idades compreendidas entre os 24 e os 90 anos (mediana, 49 anos). O local de apresentação foi variável, a maioria localizada na região da cabeça e pescoço. Os dados clínicos estão resumidos na Tabela 1. Todos os doentes foram submetidos a uma biópsia excisional da pele.
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| CD133 staining was graded using a semiquantitative scale. Acinar or ductal structures were evaluated as follows: (−) sem coloração; (+) de coloração de secretora material no lúmen do isolado ductos ou ácinos e/ou fraca coloração dos apical ou luminal fronteira de alguns ductos ou ácinos; (++) limpar a coloração das apical ou luminal fronteira da maioria dos ductos ou ácinos presentes no tumor; (+++) a coloração das apical ou luminal fronteira de todos os ductos ou ácinos presente no tumor. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3, 2. Resultados imunohistoquímicos
dos três anticorpos monoclonais diferentes testados em secções tecidulares fixas à formalina, parafínicas incorporadas, e de acordo com relatórios anteriores , apenas o AC133 apresentou resultados sensíveis e fiáveis. O padrão global de coloração imunohistoquímica observado com este anticorpo estava intimamente relacionado com a arquitetura dos tecidos. A coloração foi localizada principalmente na superfície apical das células que formaram estruturas ductais ou glandulares. Os resultados imunohistoquímicos observados nestas estruturas utilizando o anticorpo anti-CD133 estão resumidos na Tabela 1 e são descritos abaixo. As áreas sólidas de qualquer um dos tumores adnexais examinados ou dos carcinomas das células basais e escamosas testados não conseguiram demonstrar a positividade do CD133.
3.2.1. Observou-se a expressão do tecido Normal
CD133 na superfície endoluminal ou apical das células das células da acini e das ductulas terminais das glândulas eccrina normais [Figura 1 a)]. Os canalículos intercelulares formados na membrana lateral das células da eccrina localizadas na porção secretória das glândulas sudoríferas normais estavam claramente manchados (Figura 1(b)), bem como a secreção encontrada no lúmen das condutas de eccrina. A coloração das glândulas apócrinas normais nos ductos terminais foi observada na borda apical das células, embora com uma distribuição irregular. Em áreas acinares destas glândulas, onde a secreção de decapitação apócrina era óbvia, CD133 mostrou apenas uma coloração fraca ou negativa.
(a)
(b)
(a)
(b)
CD133 normal eccrine glândulas manchas da endoluminal superfície das células e a glândula de suor secreção (um). Também são observados canalículos intercelulares na membrana lateral das células da eccrina (b).
3.2.2. Os tumores
CD133 não foram expressos em nenhum dos carcinomas escamosos ou basocelulares testados. Usando o anticorpo AC133, os tumores adnexais analisados neste trabalho mostraram o seguinte padrão de coloração (resumido na Tabela 1).tumores benignos com diferenciação de Eccrina ou apócrina. Todos os casos de espiradenoma de eccrina apresentaram imunoreatividade CD133 na membrana apical das estruturas do tipo ducto presentes nos nódulos tumorais. A superfície luminal das células epiteliais que formam os quistos uniloculares de todos os casos de hidrocistoma de eccrina analisados também foi positiva. Ductos e pequenos quistos presentes em três dos seis casos de poroma de eccrina mostraram coloração intensa da camada celular interna dos túbulos proliferados, e esta coloração foi localizada na fronteira endoluminal das células. Os outros três casos de poroma analisados mostraram o mesmo padrão de coloração na maioria dos túbulos, mas com um padrão de coloração (++) ou (+) de positividade CD133. Estruturas tipo ducto, presentes nos quatro casos cilíndricos, mostraram também imunoreatividade na membrana apical das células epiteliais. A coloração dos quatro siringomas condróides era proeminente, e todos os ductos presentes, que formavam estruturas ramificantes ocasionais, mostraram intensa positividade na membrana apical (Figura 2). O dilatadas e tortuosas condutas, que levam em espaços císticos de todos os syringocystoadenoma papilliferum casos, apresentaram imunorreatividade na porção apical das células epiteliais ou na superfície luminal dos cistos, com uma intensidade que variou de (++) para (+++) (Figura 3). Os cinco casos diagnosticados como hidradenoma nodular mostraram estruturas isoladas do tipo ducto que eram positivas para o CD133 com uma coloração apical das células que formavam os túbulos (Figura 4) que variavam em intensidade de (++) a (+++). Os dois casos de hidradenoma papilliferum mostraram também a expressão de CD133 na porção apical das estruturas glandulares. Apenas dois dos seis casos de siringoma testados mostraram coloração consistente na superfície luminal dos pequenos dutos que formaram os tumores, que eram forrados geralmente por duas camadas de células epiteliais cubicas. Os casos de hidrocistoma apócrino não conseguiram demonstrar qualquer imunoreactividade positiva.
CD133 positividade na superfície interna do condróide syringoma ramos túbulos. Não se nota qualquer coloração das células estromais ou das células epiteliais exteriores.
Linear CD133 a coloração das células do epitélio colunar túbulos de um hidradenoma caso. Apenas as células localizadas na superfície interna dos túbulos estão manchadas.tumores malignos com diferenciação Ecrina ou apócrina. Não foi possível demonstrar imunoreactividade na superfície luminal dos quistos do caso diagnosticados como carcinoma apócrino. Os dois carcinomas adnexais microcísticos analisados neste estudo mostraram forte positividade CD133 na superfície apical das células que formavam o lumina pequeno e grande das estruturas tubulares. A imunocarcinoma CD133 pode ser demonstrada nas células muito atípicas que rodeiam as estruturas tubulares do caso do porocarcinoma (Figura 5).
(a)
(b)
(a)
(b)
Ductal structures of porocarcinoma seen in H&E sections (a) are CD133 positive (b).
3.3. Caracterização de culturas primárias a partir de tumores de pele humana e Análise de citometria de fluxo
sete amostras derivadas de tumores de pele humana foram processadas com o objetivo de obter suspensões de células únicas. Devido a um número insuficiente de células obtidas a partir dos tumores ou à contaminação fúngica ou bacteriana, apenas quatro amostras foram cultuadas com sucesso e analisadas para a expressão do epítopo CD133/1 da superfície celular. Estas biópsias bem cultivadas incluem um porocarcinoma de eccrina e três carcinomas de células escamosas. O exame microscópico das células cultivadas revelou diferentes morfologias que variavam consistentemente ao tipo de tumor histológico. As células do carcinoma de células escamosas mostraram o aspecto das células epitelióides ou do fuso enquanto as células derivadas do porocarcinoma da ecrina tinham uma forma mais arredondada e agrupadas em ilhotas de células pequenas e Atípicas. A presença de células epiteliais nestas culturas foi confirmada através da expressão positiva e-cadherina e EpCam como marcadores epiteliais.para determinar se as culturas de células tumorais da pele continham uma população de células CD133 positivas, usamos citometria de fluxo para examinar a expressão do marcador de superfície CD133/1 com o anticorpo AC133. Todas as amostras de carcinoma de células escamosas continham menos de 0,1% de células positivas, enquanto quase 22% de células positivas foram detectadas em porocarcinoma de eccrina. A figura 6 mostra histogramas representativos dos dois tipos de tumor de pele avaliados.
(a)
(b)
(a)
(b)
CD133 expression profiles in human skin primary tumour cells. Analysis of CD133/1 expression in samples from eccrine porocarcinoma (b) and from squamous cell carcinoma (a). Flow cytometry of porocarcinoma derived cell cultures show a 22% of CD133/1 epitope positive cells and CD133 immunostaining. O carcinoma de células escamosas apresenta coloração negativa para as células CD133 e 0% positivo para as células CD133 na citometria de fluxo.
4. Discussão
progresso na biologia das células estaminais cutâneas, e na compreensão da carcinogénese, depende fortemente da disponibilidade de marcadores específicos para populações de células estaminais distintas . Marcadores conhecidos de células estaminais da pele ou de células estaminais que foram identificados em outros órgãos ou tumores podem ser utilizados para a detecção de CSCs cutâneas. Um destes marcadores que pode ser testado na pele é a proteína CD133 (prominin-1). O primeiro reporte de dados CD133 expressão utilizando o anticorpo monoclonal AC133, produzido contra um romance de células-tronco glicoproteínas antigénio, mostrou que CD133 foi seletivamente expressa em hematopoéticas CD34-tronco e células progenitoras derivadas de humanos fetal o fígado e medula óssea, bem como do sangue . Desde então, vários relatórios têm mostrado que a proeminina-1 pode ser usada para identificar e isolar células estaminais humanas de várias fontes, incluindo o sistema hematopoiético , a próstata , o pâncreas ou o rim . Além disso, foram utilizados anticorpos monoclonais contra o CD133 para a identificação e isolamento de uma população putativa de células iniciadoras de tumores ou CSCs em vários carcinomas humanos e no melanoma maligno . No glioma, o aumento do número de células cancerosas CD133 positivas, bem como a presença de aglomerados destas células, tem sido proposto como um fator de prognóstico significativo, independente de outros fatores como o grau tumoral . No entanto, outros estudos, usando diferentes e novos clones anti-CD133, têm sugerido que a expressão do CD133 não se limita às células estaminais e progenitoras e parece ser expressa em células epiteliais adultas de tecidos humanos e de ratos . Por exemplo, usando um clone CD133, chamado 13A4, derivado do mouse prominin-1, Weigmann et al. manifestação demonstrada de proeminina-1 na superfície apical de células neuroepiteliais e túbulos renais proximais adultos, e Karbanová et al. , utilizando um anticorpo monoclonal (80B258) gerado contra um polipeptídeo humano proeminente-1, observou-se imunoreactividade em tecidos humanos adultos, particularmente em epitélios glandulares. Estes resultados indicam a necessidade de estudos adicionais para esclarecer se o antigénio AC133, anteriormente encontrado na citometria de fluxo a ser restringido às células progenitoras CD34 positivas, é expresso em células epiteliais adultas . Tem sido sugerido que a expressão variável CD133 observada está relacionada com a afinidade diferencial dos diversos anticorpos a várias formas glicosiladas de CD133 . O anticorpo monoclonal AC133 reconhece uma glycosylated epítopo de prominin-1 , e, curiosamente, o glycosylation desta proteína pode mudar dependendo do estado de diferenciação celular, ou pode ser alterada durante o processo de transformação maligna . Em nosso estudo sobre tumores de pele humana, temos observado que a expressão CD133 é muito dependente da formação de ductos da glândula sudorísa e secreção da glândula sudorísa. A imunoreactividade CD133 foi observada principalmente na superfície apical / endoluminal de estruturas semelhantes a ductos ou quistos da maioria dos tumores benignos e malignos da eccrina. Nenhum dos tumores estudados, nem benignos nem malignos, apresentou aglomerados isolados ou pequenos de células neoplásicas CD133 positivas em áreas sólidas. Padrões semelhantes de coloração CD133 da membrana celular apical das células secretoras foram previamente notificados em estruturas tubulares normais, tais como túbulos renais proximais ou glândulas tumorais de cancro colorectal . Também foi encontrada coloração CD133 na superfície apical/endoluminal de células formando um lúmen em carcinomas do ovário . Nestes casos, a localização apical do CD133 tem sido implicada numa possível função secreta desta molécula. A distribuição morfológica da coloração CD133 demonstra uma correlação com estruturas secretoras bem reconhecidas de tecidos e glândulas normais, sugerindo uma relação funcional de CD133 com secreção. De fato, em nosso estudo, tumores suspeitos de serem originados nas áreas ductais das glândulas sudoríparas, como siringomas, mostraram um padrão menos intenso de coloração do que aqueles originados nas porções acinares.
a expressão CD133 na superfície celular de células tumorais diferenciadas é um argumento contra o CD133 como um marcador específico de células estaminais cancerosas na pele. No entanto, a existência de uma pequena população de CSC CD133+ não pode ser completamente excluída, como tem sido demonstrado em outros órgãos, onde CD133 é expresso na superfície celular de ambos, CSCs, e células tumorais diferenciadas . em conjunto, os nossos resultados demonstram uma expressão imunohistoquímica específica do anticorpo AC133 na superfície secretória das células normais diferenciadas e neoplásicas das glândulas ecrinas. As experiências que utilizam este anticorpo como marcador de CSCs na pele devem ser interpretadas com precaução. O anticorpo AC133 é um marcador sensível e específico da diferenciação glandular cutânea, útil para o diagnóstico de tumores com possível diferenciação eccrina ou apócrina.
agradecimentos
os autores estão gratos a Pedro Javier Benito Castellanos e a Laura Abendaño pelo apoio técnico.
